原核表達(dá)技術(shù)word資料21頁(yè)

1、原核表達(dá)技術(shù)流程pMD19-T載體 目的基因的獲取TG1感受態(tài)制備PCR擴(kuò) 增連接重組載體1轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化細(xì)胞1抽取質(zhì)粒進(jìn)行電泳，PCR檢測(cè)陽(yáng)性 （陽(yáng)性）轉(zhuǎn)化細(xì)胞1酶切，獲取目的基因TG1感受態(tài)細(xì) 胞pET-28a載體 重 組重組載體2重組載體2轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)轉(zhuǎn)化細(xì)胞2抽取質(zhì)粒進(jìn)行 電泳，PCR檢測(cè)陽(yáng)性（陽(yáng)性）轉(zhuǎn)化細(xì)胞2誘導(dǎo)表達(dá) 蛋白質(zhì)提取，電泳檢測(cè) 呈陽(yáng)性目的蛋白原核表達(dá)技術(shù)及其在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用原核表達(dá)技術(shù)及其在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用1基因工程及其應(yīng)用 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)與表達(dá)基因工程：是用分離純化或人工合成的 DNA&體外與載體DNA結(jié)合，成為 重組DNA 用以轉(zhuǎn)化宿主（細(xì)菌或

2、其它細(xì)胞），篩選出能表達(dá)重組DNA的活細(xì) 出能表達(dá)重組DNA篩選出能表達(dá)重組DNA勺活細(xì) 加以純化、傳代、 擴(kuò)增，胞，加以純化、傳代、擴(kuò)增，成為克隆，成為克隆，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物或改造、的基因產(chǎn)物或改造、創(chuàng)造新的生物類型。生物類型。Your company slogan基因工程的應(yīng)用1.抗蟲轉(zhuǎn)基因植物1.抗蟲轉(zhuǎn)基因植物 Your company slogan 2. 抗病轉(zhuǎn)基因植物 2.抗病轉(zhuǎn)基因 植物 Your company slogan 3.The camelecow Your company slogan 其 他 基因工程產(chǎn)品抗蟲害的玉米 轉(zhuǎn)魚抗寒基因 的番茄 轉(zhuǎn)基因鞋 魚You

3、r company slogan 乳汁中含有 人生長(zhǎng)激素 的轉(zhuǎn)基因牛 阿根廷）（阿 根廷）轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病 基因的甜椒Your company slogan 基因工程的應(yīng) 用領(lǐng)域1.2. 3. 4. 5. 6.蛋白質(zhì)功能研究 生物制藥和疫苗生產(chǎn) 疾病的基因治療食品、化工用酶制劑 抗蟲、抗逆植物改良 細(xì)胞代謝產(chǎn)物的富集 Your company slogan 基因工程一般流程人的細(xì)胞 提取 目的基因與運(yùn)載體DNAf接 拼接 與運(yùn)載體 導(dǎo)入 細(xì)菌（含目的基因 細(xì)菌 含目的基因 ） 含目的基因 生產(chǎn)重組蛋白 Your company slogan 基因工程的操作工具 核酸分子剪刀 限制性核酸內(nèi)切酶一

4、. 核酸分子剪刀 限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別回文序列，產(chǎn)生粘性或平性末端， 識(shí)別回文序列，產(chǎn)生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性 末端的不同DNAt段可連接起來(lái)形 成重組 片段可連接起來(lái)形成重組 DN防子，故 分子，末端的不同 片段 可連接起來(lái)形成重組分子DNA限制性內(nèi)切酶是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中重要的 工具酶。識(shí) 限制性內(nèi)切酶是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中重要的工具酶。 限制性內(nèi) 切酶是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中重要的工具酶別雙鏈DNArt部特異位點(diǎn)并裂解磷酸二酯鍵 別雙鏈 內(nèi)部特異位點(diǎn)并裂解磷酸二酯鍵分類：分類：I型、n型、田型 命名： 發(fā)現(xiàn)次序）命名：EcoRI （E:屬名；co：種名；R: 株；I:發(fā)現(xiàn)次序 I :屬

5、名；：種名；：Your company slogan 第 一類（ 第一類（ I 型）限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的 核苷酸順序， 核苷酸 順序，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNAS,其切割的核昔酸順序沒有專一性，切割DNA®其切割的核昔酸順序沒有專一性，DNA是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA DNAS組技術(shù)或 是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在DNAg組技術(shù)或 基因工程中用處不大，無(wú)法用于分析 DNADNA 結(jié)構(gòu)或 基因工程中用處不大，無(wú)法用于分析DNA吉構(gòu)或 克隆基因?？寺』颉＿@類酶如 EcoB EcoK等。 第三類（III型 第三類（III型）限 制性內(nèi)切酶也有專一的 識(shí)別順序， 識(shí)

6、別順序，在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。 位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)也不是特異 性的。 因此， 性的。 因此， 這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度DNAt段，具有各種單鏈末端。DNA片段 定長(zhǎng)度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此也不 能應(yīng)用于基因克隆。 能應(yīng)用于基因克隆。 Yourcompany slogan 第二類 (II 型 第二類 (II 型) 限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一(II 的核苷酸順序， 的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。 切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和 切割的核苷酸都是專一的。 因此， 切割的核苷酸都是專一的。 因此， 這種限制 性內(nèi)切酶

7、是DNA 重組技術(shù)中最常用的工具酶性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶DNA之一。之一。 這種酶識(shí)別的專一核音酸順序最常見的個(gè)或6個(gè)核苷酸， 少數(shù)也有識(shí)別 5 是 4 個(gè)或 6 個(gè)核苷酸 ， 少數(shù)也有識(shí)別 5 個(gè)核苷 酸以及 7 10 個(gè)和 11 個(gè)核苷酸 個(gè)和 11 酸以及 7 個(gè) 、 8 個(gè) 、 9 個(gè) 、10 個(gè)和 11 個(gè)核苷酸 的。這種酶的切割可以有兩種方式： 這種酶的切割可以有兩種方式： Your company slogan 粘性末端；是交錯(cuò)切割， 粘性末端；是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的， 鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形 成氫鍵，

8、所以稱為粘性末端。 成氫鍵，所以稱為粘性末端。 RI 的識(shí)別順序?yàn)?的識(shí)另I順序?yàn)椋喝鏓coRI的識(shí)另I順序?yàn)椋?G|AATTC3' 3 3CTTAA|G5 '在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置切割后生成5'G G3'CTTAA CTTAA AATTC 3' 3 AATTC G5'5 各有一個(gè)單鏈末端， 二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的， 各有一個(gè)單鏈末端， 二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的 ，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過(guò)DNA DNA1接酶 其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過(guò)DNA 連接酶 Your company slogan 的作用而“粘合”的作用而“粘合”。 平頭末端： 平頭末端

9、： II 型酶切割方式的另一種是在同一位置上II 型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈， 產(chǎn)生平頭末端。 切割雙鏈， 產(chǎn)生平頭末端。 例如 EcoRV 的識(shí)別 位置是： 位置是：5'GAT|ATC3 ' 3 'CTA|TAG5 ' 切割后形成5'GAT 3'CTA ATC3 ' TAG5 這種末端 同樣可以通過(guò)DNAS接酶連接起來(lái)。這種末端同樣可以通過(guò) DNAS接酶 連接起來(lái)。DNA連接酶連接起來(lái) Your company slogan同裂酶和同尾酶： 同裂酶和同尾酶： 同裂酶： 同裂酶：有時(shí)兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷 酸順序和切割

10、位置都相同， 核苷酸順序和切割位置都相同，這些有相同切 點(diǎn)的酶稱為同裂酶（同切酶或異源同工酶）。 點(diǎn)的酶稱為同裂酶（同切酶或異源同工酶） 同裂酶 同裂酶差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割， 的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另 一種則不能。一種則不能。例如 Hpan和Mspl的識(shí)另I順序者B是5'G|CG G G|CG G3' 3 3 'G GC|G GGC|G5' 5如果其中有 5 -甲基胞口密噬，如果其中有5'-甲基胞口密噬，則只有Hpan能夠切割。能夠切割。Your company slogan同尾酶：同尾酶：有

11、時(shí)兩種酶切割序列不完全相同， 有時(shí)兩種酶切割序列不完全 相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端， 產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶 同尾酶的切割產(chǎn)物可以通過(guò) DNAS接酶將 同尾酶的切割產(chǎn)物可 以通過(guò)DNAS接酶將DNA這類末端連接起來(lái)， 這類末端連接起來(lái)，但原 來(lái)的酶切位點(diǎn)將被破壞。 Your company slogan 如 Xba1 和 Nhe1:T|CTAGA 3 5 'T|CTAGA 3 T|CTAGA AGATC|T 5 3 'AGATC|T 5AGATC|T CTAGA3 5 'T T CTAGA 3' T 5 3 'AGATC AGATC

12、T'5 G|CTAGC 3 5 'G|CTAGC 3 G|CTAGC CGATC|G5 3 'CGATC|G 5 CGATC|G CTAGC3 5 'G G CTAGC 3 G5 3 'CGATC CGATC G 5 TCTAGC 3 5 'TCTAGC 3 TCTAGC AGATCG5 3 'AGATCG 5 AGATCG 這些粘性末端連接后， 這些粘性末端連接后， Xba1 和 Nhe1 酶將不 能再 切割， 1（ 酶切識(shí)別位點(diǎn)為 能再切割，但可以利用 Bfa1（ 酶切識(shí)別位點(diǎn)為GATC來(lái)進(jìn)行再切割 來(lái)進(jìn)行再切割。GATC）來(lái)進(jìn)行再切

13、割。Your company slogan 二、DNA1接酶DNA連接酶 催化雙鏈DNA一端的3 OH與 催化雙 鏈DNA-端的3' OH與DNA一端的另一雙鏈DNA5 DNA5的磷酸根形成 另一雙鏈DNA5 的磷酸根形成磷酸二酯鍵，3， 5 -磷酸二酯鍵，使具有相同粘性末端或平末端的 DNA DN麻相同粘性末端或平末端的 DN襪 端連接起來(lái)。端連接起來(lái)。Your company slogan 三、DN膘合酶（DNA polymerase） DNA聚合酶（DNA聚合酶 大腸桿菌DN課合酶I及其大片段（Klenow片段） 大腸桿菌DN課合酶I及其大片段（Klenow片段）DNA 聚合酶

14、片段Your company slogan DNA 聚合酶的DNA聚合酶的3種功能 聚合酶的 3 聚合酶功能3 5 功能 5 外切功能3 外切Yourcompany slogan DNA聚合酶活性 5' 3' DNA聚合酶活性 f DNA聚合 酶 5 CCG 3 GGCTATCGA5 dATP dTTP dGTP dCTP 5 CCGATAGCT3 CCGJAGCT3 3' GGCTATCGA5 Your company slogan 3 ' f 5'外切酶 活性 5 CCGATAGCT3 CCGATAGCT3 3 GGC5 聚合酶 5 CCG33 GG

15、C5 A T A G C T Your company slogan Klenow 片段從大腸桿菌DN課合酶I中去除5' -3'外切酶活性，即得 Klenow片段。其只具有 5' f3'聚合酶活性 Your company slogan Taq DNA 聚合酶 特性： 耐 熱的DN課合酶來(lái)自于嗜熱的棲熱水生菌 Thermus aquaticus 中純化而 來(lái)的。5' -3'聚合酶活性 5' -3'外切酶活性 最佳作用溫度為 75- 80° C Your company slogan 載體 基因工程中常用的載體(vecto

16、r)主要包括質(zhì)?；蚬こ讨谐Ｓ玫妮d體(vector) 主要包括質(zhì)粒(vector)主要包括 (plasmid) 、噬菌體 (phage) 病毒 (virus) 三大類。 (phage) 和 (virus) 三大類 (plasmid) 、噬菌體 (phage) 和病毒 (virus) 三大類。 這些 載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因， 這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去 致病基因，并賦 予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、 予一 些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、 單一的限制酶切點(diǎn)等。 單 一的限制酶切點(diǎn)等。 Your company slogan 質(zhì)粒載體 是存在于天然細(xì)菌體內(nèi)的一種獨(dú)

17、立于細(xì)菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA具有獨(dú)立復(fù)制的能力，獨(dú)立復(fù)制的能力 雙鏈環(huán)狀DNA具有獨(dú)立復(fù)制的能力，通常帶有細(xì)菌 抗藥基因。 最早使用的質(zhì)粒DN幅人工構(gòu)建的 的抗藥基因。 最早使 用的質(zhì)粒DN混人工構(gòu)建的pBR322,該質(zhì)粒分子大小為 4.3kb , pBR322, 該質(zhì)粒分子大小為4.3kb ,帶有抗四環(huán)素和抗氨葦青霉素基因，EcoRIBamH 和抗氨葦青霉素基因，含EcoRI, BamH , Hindin等單一的限制酶切點(diǎn)。Hindin等單一的限制酶切點(diǎn)。Your company slogan 目Yourcompany slogan 錄 質(zhì)粒載體的特征1. 自主穩(wěn)定復(fù)制 松弛型質(zhì)粒 2

18、. 具有多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn) 2. 具有多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn) 3. 遺 傳標(biāo)記 3. 遺傳標(biāo)記 4. 插入容量大4. 插入容量大5. 分子量小 分子量小， 5. 分子量小，拷貝多 6. 安全 6. 安全 Your company slogan 目前常 用商用載體pJLA50X 系列 pcDNAII; etc 系列 pET 系列 （T7 promoter,Novagen公司公司）系列公司pQE系歹U （T5 promoter, Qiagen公司公 司）系列公司pMAL系列（周質(zhì)表達(dá)BioLabs公司周質(zhì)表達(dá)，公司）系 列周質(zhì)表達(dá) 公司pGEX系歹U （GST融合表達(dá)，Pharmacia公

19、司）pGEX系 列（GST融合表達(dá)，Pharmacia公司）融合表達(dá) 公司pBAD系列 （Arabinose 誘導(dǎo)型 誘導(dǎo)型 ） 系列 誘導(dǎo)型 Your company slogan Your company slogan 二、原核表達(dá)載體的構(gòu)建1. 目的基因的獲取2. 克隆載體的選擇與構(gòu)建3.外源基因與載體的連接 4.重組DN礙入受體菌 重組DNA DNAI入受體菌5.重組體的篩選6.克隆基因的表達(dá) Your company slogan Your company slogan 目的基因的獲取目的基因是人們 所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。如蘇云 金芽孢桿菌的抗

20、蟲基因，還有植物的抗?。?金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及 抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因， 人的胰島素基因、干擾素基因等。獲取目的基因 人的胰島素基因、干擾素基因等。 的方法有 1. 從 染色體DN特分離2.人工合成1.從染色體DNA中分離2.人工合成 從染 色體DNA 3.從mRN給成3.從mRN總成cDNA合成cDNA 4.基因文庫(kù)4. 基因文庫(kù) Your company slogan 雙酶切 Your company slogan 連接反應(yīng) Your company slogan 重組體的轉(zhuǎn)化 1. 重組體導(dǎo)入大腸桿菌 （ 1）氯化

21、 鈣法（2）電擊法（ 3）體外包裝法2. 重組體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞（ 1）磷酸鈣共沉淀法（ 2）脂質(zhì)體介導(dǎo)法（ 3 ）病毒感染法（ 4 ）顯微注射法Your company slogan DNA 重組體的篩選與鑒定 DNA重組體的篩選與鑒定1. 目的基因檢測(cè) 1. 目的基因檢測(cè) 2.DNA 限制酶切圖譜分析2.DNA 限制酶切圖譜分析3. 根據(jù)重組載體的表型進(jìn)行篩選 3. 根據(jù)重組載體的表型進(jìn)行篩選 4. 利用核酸雜交和放射自顯影進(jìn)行鑒定4. 利用核酸雜交和放射自顯影進(jìn)行鑒定Your company slogan 常見注意事項(xiàng) 1. 載體的選擇 1.載體的選擇2. 酶切位點(diǎn)的選擇與克隆引物的設(shè)計(jì)

22、2. 酶切位點(diǎn)的選擇與克隆引物的設(shè)計(jì)3. 酶切反應(yīng)的設(shè)計(jì)3. 酶切反應(yīng)的設(shè)計(jì)4. 酶切實(shí)驗(yàn) 4.酶切實(shí)驗(yàn) 5. 連接比例的設(shè)置5. 連接比例的設(shè)置6. 連接溫度與時(shí)間 6.連接溫度與時(shí)間 7. 感受態(tài)細(xì)胞的制備7. 感受態(tài)細(xì)胞的制備8. 轉(zhuǎn)化 8.轉(zhuǎn)化9. 重組子的鑒定9. 重組子的鑒定Your company slogan 載體的選擇標(biāo)準(zhǔn) 具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物， 有多個(gè)限制性內(nèi)酶切位點(diǎn)，至少有兩種酶能在同一體系 有多個(gè)限制性內(nèi)酶切位點(diǎn)， 中反應(yīng)。 中反應(yīng)。 拷貝數(shù)高，表達(dá)量高，表達(dá)穩(wěn)定。 拷貝數(shù)高，表達(dá)量高，表達(dá)穩(wěn)定。 具有強(qiáng)啟動(dòng)子和相應(yīng)的

23、表達(dá)標(biāo)簽和蛋白酶位點(diǎn)， 具有強(qiáng)啟動(dòng)子和相應(yīng)的表達(dá)標(biāo)簽和蛋白酶位點(diǎn)，便于表達(dá)產(chǎn)物的鑒定純化。 達(dá)產(chǎn)物的鑒定純化。 Your companyslogan酶切位點(diǎn)的選擇必須是選定載體的MCS必須是選定載體的MCSt的兩種酶切位點(diǎn) MCS上的兩種酶切位點(diǎn)盡量選用能產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) , 盡量選用能產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) , 并 且上游酶切位點(diǎn)盡量靠近起始密碼子。 且上游酶切位點(diǎn)盡量靠近起始密碼子。目的基因中不能含有選用的酶切位點(diǎn) 兩種酶盡可能在同一體系中反應(yīng)，兩種酶盡可能在同一體系中反應(yīng)，并且具有相近 的切割效率 為了保證切割效率， 為了保證切割效率，在設(shè)計(jì)的克隆引物的酶切位 點(diǎn)前

24、面必須加上合適的保護(hù)堿基。 點(diǎn)前面必須加上合適的保護(hù)堿基。 Your company slogan 酶切反應(yīng)大多數(shù)限制酶貯存在50甘油溶液中，以避免在- 20條件下結(jié)冰。 大多數(shù)限制酶貯存在50甘油溶液中，以避免在- 20條件下結(jié)冰。 50 條件下結(jié)冰 當(dāng)最終反應(yīng)液中甘油濃度大于 12 12 當(dāng)最終反 應(yīng)液中甘油濃度大于12時(shí)，某些限制酶的識(shí)別特異性降低，從而抑制酶活性。 降低，從而抑制酶活性。因此加入反應(yīng)的酶體積不超過(guò)反應(yīng)總體 積的10% 10% 積的10% 反應(yīng)混合物中基因組 DNA®物的濃度不宜 太大 反應(yīng)混合物中基因組 DN砥物的濃度不宜太大，小體積中過(guò)高濃度 的DNA底物的

25、濃度不宜太大，基因組DN砥形成粘性DNA容液，從而抑制酶的擴(kuò)散，DNA會(huì)形成粘性DNA容液基因組DNA形成粘性DNA容液， 從而抑制酶的擴(kuò)散，并降低酶活建議酶切反應(yīng)的基因組 DNAS度為0 DNA濃度為ug/ul o同時(shí)RNA RN版性。建議酶切反應(yīng)的基因組 DNA濃度為 0.1-0.4ug/ul 0同時(shí)RNAE該盡量消化去除。該盡量消化去除。當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割 DNA才必須選擇好通用緩沖液，當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割 DNAM,必須選擇好通用緩沖液，DNA則兩種酶才可同時(shí)切割。 則兩種酶才可同時(shí)切割。 反應(yīng)混合液中加入濃度為0.1mg/ml BSA可維持酶的穩(wěn)定性。0.1mg

26、/ml的 反應(yīng)混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA可維持酶的穩(wěn)定性。酶切底物DNAE具備一定的純度，如果溶液中含有跡量酚、 氯仿、DNA應(yīng)具備一定的純度 酶切底物DNA 應(yīng)具備一定的純度，如果溶液中含有跡量酚、氯仿、乙 大于 10mM EDT，A SDS以及過(guò)量的鹽離子濃度 10mM的以及過(guò)量的鹽離子濃度，醇，大于10mM勺EDTA SDS以及過(guò)量的鹽離子濃度，都會(huì)不同程度影響限制酶的活性。 度影響限制酶的活性。 Your company slogan 連接反應(yīng) 連接比例的設(shè)置 連接比例目的基因與載體量3: 18 : 1,具體比例按 照跑膠條帶的亮度與寬度設(shè)計(jì)。經(jīng)驗(yàn)公式：n (L1XK1

27、XM2/L2X K2X M1) =1(1<n<10) L1,K1,M1 為目的基因的亮度， 寬度， 分子量， 對(duì)應(yīng)的為 載體的。如果超出范圍按極值計(jì)算。連接在16c , 1216h. Your companyslogan實(shí)例分析 此時(shí)目的條帶與載體亮度比 寬度比為 2：， 為 1.5 ： 1 ，寬度比為 ： 1 ， ： 目的條帶 600 堿基， 目的條帶 堿基， 堿基 載體按 6000算，算出比例約為 ： 3，根據(jù)總載體按 算 算出比例約為 10：， 體積為 20ul, 則加 則加 13ul 基因， 4ul 載體， 2ul 連 基因， 載體， 體積為 則加 基因 載體 連 接 bu

28、ffer,1ul 酶。 酶 Your company slogan 轉(zhuǎn)化 熱擊溫度， 熱擊溫度， 時(shí)間42 , 90s 這里溫度與時(shí)間一定要控制精確 轉(zhuǎn)化體系 連接產(chǎn)物不能超過(guò)體系總體積的 連接產(chǎn)物不能超過(guò)體系總體積的 1/5 對(duì)照設(shè)置 初次做克隆， 建議設(shè)置雙對(duì)照， 陰性對(duì)照： 初次做克隆，建議設(shè)置雙對(duì)照，陰性對(duì)照：以切開 的質(zhì)粒作為連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。陽(yáng)性對(duì)照： 的質(zhì)粒作為連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。陽(yáng)性對(duì)照：以載體質(zhì)粒作為對(duì)照Your company slogan陽(yáng)性克隆的鑒定 菌落PC螳定 菌落PCRg定對(duì)于大腸桿菌而言，一般10 16h 基本能長(zhǎng)出克隆 超過(guò) 16h 10 基本能長(zhǎng)出克隆， 16

29、h 長(zhǎng)出的小菌落對(duì)于大腸桿菌而言， 一般 10-16h 基本能長(zhǎng)出克隆，超過(guò)16h 長(zhǎng)出的小菌落 或者衛(wèi)星菌落一般不是重組子。 或者衛(wèi)星菌落一般不是重組子。連接產(chǎn)物生長(zhǎng)的菌落一般不是很多，如果平板中菌落數(shù)非常多，可能是連接產(chǎn)物生長(zhǎng)的菌落一般不是很多，如果平板中載體酶載體酶切不完全，自連嚴(yán)重。也有可能是污染。切不完全，自連嚴(yán)重。也有可能是污染。 挑取克隆的時(shí)候以在規(guī)定時(shí)間范圍內(nèi)長(zhǎng)出的單一菌落為主，挑取克隆的時(shí)候以在規(guī)定時(shí)間范圍內(nèi)長(zhǎng)出的單一菌落為主，最好不要在菌落叢生很密的區(qū)域挑取克隆。菌落叢生很密的區(qū)域挑取克隆。 挑取的克隆至小管培養(yǎng)4 5h, 即可以用菌液做模板進(jìn)行菌落PC螳定 即可以用菌液做

30、模板進(jìn)行菌落PC螳定。挑取的克隆至小管培養(yǎng)4-5h,即可以用菌液做模板進(jìn)行菌落PC堞定。雙酶切鑒定 菌落PCRg定為陽(yáng)性的克隆要進(jìn)一步小提質(zhì)粒做雙酶切鑒定。PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆要進(jìn)一步小提質(zhì)粒做雙酶切鑒定菌落PCR1定為陽(yáng)性的克隆要進(jìn)一步小提質(zhì)粒做雙酶切鑒定。對(duì)于插入片 段小的酶切鑒定，酶切時(shí)間不要太長(zhǎng)， 3h 足夠 足夠。 段小的酶切鑒定，酶切時(shí)間不要太長(zhǎng)， 2-3h足夠。防止切下的小片段 彌散。 彌散。 Your company slogan 示例圖片Your company slogan 表達(dá)鑒定經(jīng)過(guò)菌落PCRS定和雙酶切鑒定的重組子，PCR鑒定和雙酶切鑒定的重組子經(jīng)過(guò)菌落PCR1定和

31、雙酶切鑒定的重組子，一定要進(jìn)行最后的表達(dá)鑒定。 行最后的表達(dá)鑒定。只有看到與預(yù)期大小相近的 蛋白表達(dá)，原核載體的構(gòu)建才算成功。 蛋白表達(dá)，原核載體的構(gòu)建才算成功。將菌落PCR雙酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆子，PCR, 將菌落PCR雙酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆子，提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)工程菌中，BL21,然后誘導(dǎo)表達(dá)， 化至表達(dá)工程菌中，如 BL21,然后誘導(dǎo)表達(dá)，PET 系列載體使用的是T7啟動(dòng)子，使用IPTG誘導(dǎo)。T7啟動(dòng)子IPTG誘導(dǎo) 系 列載體使用的是T7啟動(dòng)子，使用IPTG誘導(dǎo)。SDS-PAG遵定 鑒定。SDS-PAGEE定。以未誘導(dǎo)作對(duì)照，以分子量marker作為大小鑒定。marker作為大小鑒定 以未

32、誘導(dǎo)作對(duì)照，以分子量marker 作為大小鑒定。 確定目的蛋白的表達(dá)。 確定目的蛋白的表達(dá)。 Your company slogan 蛋白質(zhì)表達(dá)策略 1. 可溶性表達(dá)A: 優(yōu)化表達(dá)條件實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá) 降低誘導(dǎo)溫度， 降低誘導(dǎo)溫度， 振搖速度 降低誘導(dǎo)物濃度培養(yǎng)基中添加促溶物質(zhì)B:融合表達(dá) 采用 NusMBD、 GST、 thioredoxin 融合表達(dá) 采用 NusMBD、 GST、 thioredoxin 融合表達(dá) C: 選擇適宜宿主菌采用 Origami ， 采用 Origami ，Rosetta 等宿主菌 D:周質(zhì)腔表達(dá) CBD融合（pET36/37）、Dsb融合CBD 融合（pET36

33、/37） 、Dsb融合（pET39/40） 采用帶pelB/ompT引導(dǎo)肽的載體采用帶 pelB/ompT 引導(dǎo)肽的載體（pET12/20/22） 引導(dǎo)肽的載體（pET12/20/22） 采用帶 MBD蟲合（pMAL載體載體，SUMO蟲合 采用帶 MBD 融合（pMAL 載體,Biolabs） 、SUMO蟲合 Your company slogan 2. 包涵 體表達(dá) 并不是所有蛋白都能在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)， 并不是所有蛋白都能在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，絕大多數(shù)真核蛋白 在大腸桿菌中是以包涵體形式存在的。 在大腸桿菌中是以包涵體形式存在的。 包涵體表達(dá)有以下優(yōu)點(diǎn) 表達(dá)量高 表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿

34、主細(xì)胞沒有毒性 表達(dá)條件不苛刻 Your company slogan Your company slogan主要內(nèi)容 1 基因工程及其應(yīng)用 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)與表達(dá) 常見問(wèn)題以及解決辦法 2 3 4 生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物-領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 基 因 工 程基因工程：是用分離純化或人工合成的DNA在體外與載體DNA結(jié)合，成為重組DNA用以轉(zhuǎn) 化宿主（細(xì)菌或其它細(xì)胞），篩選出能表達(dá)重組 DNA勺活細(xì) 胞， 加以純化 , 傳代 , 擴(kuò)增 , 成為克隆 , 產(chǎn)生出人類所需要 的基因產(chǎn)物或改造,創(chuàng)造新的 生物類型 .

35、 生物秀論壇 Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 基因工程的應(yīng)用 1. 抗蟲轉(zhuǎn)基因植物 生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 - 領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe生物秀 -專心做生物 ! bbioo 2. 抗病轉(zhuǎn)基因植物 生物秀論壇 Bbs.bbioo易生物 - 領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo3.The camelecow 生物秀論壇 Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 其他 基因工程產(chǎn)品抗蟲害的玉米轉(zhuǎn)魚抗寒基

36、因 的番茄易生物 - 領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) 轉(zhuǎn)基因鮭 魚 生物秀論壇 Bbs.bbioo ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 乳汁中含有人生長(zhǎng)激素 的轉(zhuǎn)基因牛（ 阿根廷 ） 轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒生物秀論壇 Bbs.bbioo 易生物 - 領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 基因工程的應(yīng)用領(lǐng)域1. 2. 3. 4. 5. 6. 蛋白質(zhì)功能研究生物制藥和疫苗生產(chǎn) 疾病的基因治療食品 , 化工用酶制劑 抗蟲 , 抗逆植物改良 細(xì)胞代謝產(chǎn)物的富集生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 -專心做生物

37、 ! bbioo 基因工程一般流程人的細(xì)胞 提取 目的基因 與運(yùn)載體DNA拼接 導(dǎo)入 細(xì)菌（含目的基因）生產(chǎn)重組蛋白 生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 - 領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái)ebioe 生物秀 -專心做生物 ! bbioo 基因工程的操作工具一. 核酸分子剪刀 限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別回文序列 , 產(chǎn)生粘性或平性末端, 具有相同粘性或平性 末端的不同DNNt段可連接起來(lái)形成重組 DNA#子，故DNA限制性內(nèi)切酶是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中重要的工具酶.識(shí)別雙鏈DNArt部特異位點(diǎn)并裂解磷酸二酯鍵分類：I型，II型，田型 命名：EcoR I （E:屬名;co:種名;R:株；發(fā)現(xiàn)次序）生物秀論壇Bbs.

38、bbioo易生物-領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 第一類 （I 型） 限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核昔酸順序，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意 切割DNAS, 其切割的核昔酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的.這類限制性內(nèi)切酶在 DNA重 組技術(shù)或 基因工程中用處不大,無(wú)法用于分析DNA吉構(gòu)或 克隆基因.這類 酶如EcoB,EcoK等.第三類（III型）限制性內(nèi)切酶也有專一的 識(shí)別順序， 在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈. 但這幾個(gè)核苷酸對(duì)也不是特異性的 . 因此 , 這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度 DNA片段 , 具有各種單鏈末端. 因此也不 能

39、應(yīng)用于基因克隆. 生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 -專心做生物 !bbioo 第二類 （II 型） 限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序, 并在該順序內(nèi)的固定位置上 切割雙鏈 . 由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和 切割的核音酸都是專一的.因此，這種限制 性內(nèi)切酶是 DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶 之一 . 這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見的 是 4 個(gè)或 6 個(gè)核苷酸 , 少數(shù)也有識(shí)別 5 個(gè)核苷 酸以及 7 個(gè),8 個(gè),9 個(gè),10 個(gè)和 11 個(gè)核苷酸 的. 這種酶的切割可以有兩種方式: 生物秀論壇 Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥

40、商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 粘性末端 ; 是交錯(cuò) 切割 , 結(jié)果形成兩條單鏈末端 , 這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的 , 可形 成氫鍵，所以稱為粘性末端.如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?' G|AATTC3' 3'CTTAA|G5'在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置切割 后生成 5'G 3'CTTAA AATTC3' G5'各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過(guò)DNA連接酶生物秀論壇 Bbs.bbioo 的作用而 "粘合 ". 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) eb

41、ioe 生物秀 -專心做生物 ! bbioo 平頭末端 : II 型酶切割方式的另一種是在同一位置上 切割雙鏈 , 產(chǎn)生平頭末端. 例如 EcoRV 的識(shí)別 位置是 :5'GAT|ATC3' 3'CTA|TAG5'切割后形成 5'GAT 3'CTA ATC 3' TAG5'這種末端同樣可以通過(guò)DNA連接酶連接起來(lái). 生物秀論壇 Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái)ebioe 生物秀 -專心做生物 ! bbioo 同裂酶和同尾酶: 同裂酶 : 有時(shí)兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順序和切割位置都相同 , 這些有相同切 點(diǎn)

42、的酶稱為同裂酶（ 同切酶或異源同工酶）. 同裂酶差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化 的核苷酸時(shí), 一種限制性內(nèi)切酶可以切割 , 另 一種則不能. 例如Hpan和Mspl的識(shí)別順序都 是5'G|CG G3' 3'G GC|G5' 如果其中有 5'-甲基胞口密噬，則只有Hpan能夠切割.生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 -專心做生物 ! bbioo 同尾酶 : 有時(shí)兩種酶切割序列不完全相同 , 但卻能 產(chǎn)生相同的粘 性末端 , 這類酶被稱為同尾酶 同尾酶的切割產(chǎn)物可以通過(guò)DNA 連接酶將這類末端連接起來(lái),但原來(lái)的

43、酶切位點(diǎn)將被破 壞. 生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 -專心做生物 !bbioo 如 Xba1 和 Nhe1: 5'T|CTAGA 3'3'AGATC|T 5'5'TCTAGA3' 3'AGATC T 5' 5'G|CTAGC 3' 3'CGATC|G5' 5'GCTAGC3' 3'CGATC G5' 5'TCTAGC3' 3'AGATCG5'這些粘性 末端連接后,Xba1和Nhe1酶

44、將不 能再切割，但可以利用Bfa1（酶切識(shí)別位 點(diǎn)為GATC）來(lái)進(jìn)行再切割.生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物-領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái)ebioe 生物秀-專心做生物！ bbioo 二,DNA連接酶 催化雙鏈DNA-端的3'OH與 另一雙鏈DNA5'的磷酸根形成3',5'-磷酸二酯鍵,使具有 相同粘性末端或平末端的 DNA 末 端連接起來(lái). 生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ！bbioo三,DNA聚合酶(DNA polymerase)大腸桿菌DN課合酶I及其大片段(Klenow片段)生物秀論壇Bb

45、s.bbioo 易生物-領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái)ebioe 生物秀-專心做生物！ bbioo DNAK合酶的3種功能 聚合酶功能3' 5' 功能 5' 外切功能 3' 外切 生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái)ebioe 生物秀-專心做生物！ bbioo 5' "3'DNA聚合酶活性 聚合酶 dATP 5' CCG3' GGCTATCGA5d'TTPdGTPdCTP5' CCGATAGCT3'3' GGCTATCGA5'生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物-

46、領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái)ebioe 生物秀-專心做生物！ bbioo 3'f 5'外切酶活性 5' CCGATAGCT3'3' GGC5'聚合酶5' CCG3' 3' GGC5'易生物-領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái)AT A G C T 生物秀論壇 Bbs.bbioo ebioe 生物秀 - 專心做生物 ！ bbiooKlenow片段從大腸桿菌 DNA聚合酶I中去除5' ”3'外切酶活性，即得Klenow片段.其只具有5' ”3'聚合酶活性 生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物-領(lǐng)先的生物醫(yī)藥

47、商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 -專心做生物 ！ bbioo Taq DNA聚合酶特性：耐熱的DNA聚合酶來(lái)自于嗜熱的棲熱水生菌Thermusaquaticus 中純化而來(lái)的.5' f3 '聚合酶活性 5' f 3'外切酶活性最佳作用溫度為 75- 80° C 生物秀論壇 Bbs.bbioo 易生物 - 領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ！ bbioo 載體 基因工程中常用的載體 (vector) 主要包括質(zhì)粒 (plasmid), 噬菌體 (phage) 和病毒 (virus)三大類 . 這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建, 除去致病基因

48、 , 并賦 予一些新的功能如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因 , 單一的限制酶切點(diǎn)等. 生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 -專心做生物bbioo 質(zhì)粒載體 是存在于天然細(xì)菌體內(nèi)的一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA,具有獨(dú)立復(fù)制的能力，通常帶有細(xì)菌的抗藥基因.最早使 用的質(zhì)粒DNA1人工構(gòu)建的pBR322，該質(zhì)粒分子大小為4.3kb,帶有抗四環(huán) 素 和抗氨葦青霉素基因，含EcoRI ,BamHI , Hindm等單一的限制酶切點(diǎn).生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀- 專心做生物 ! bbioo 目錄

49、生物秀論壇 Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 質(zhì)粒載體的特征1. 自主穩(wěn)定復(fù)制 松弛型質(zhì)粒2. 具有多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn) 3. 遺傳標(biāo)記 4.插入容量大5. 分子量小 , 拷貝多 6. 安全 生物秀論壇 Bbs.bbioo 易生物- 領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 目前常用商用載體 pJLA50X 系列 pcDNAII; etc pET 系列 （T7 promoter, Novagen公司 ） pQE 系列 （T5 promoter, Qiagen公司 ） pMAL 系列（

50、周質(zhì)表達(dá) ,BioLabs 公司 ） pGEX 系列 （GST 融合表達(dá), Pharmacia 公司 ） pBAD 系列（Arabinose 誘導(dǎo)型 ） 生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物-領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái)ebioe 生物秀 -專心做生物 ! bbioo 二, 原核表達(dá)載體的構(gòu)建1. 目的基因的獲取2. 克隆載體的選擇與構(gòu)建3. 外源基因與載體的連接 4.重組DNAII入受體菌5.重組體的篩選6.克隆基因的表達(dá)生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 - 領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平

51、臺(tái)ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 生物秀論壇 Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 目的基因的獲取目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因 . 如蘇云 金芽孢桿菌的抗蟲基因, 還有植物的抗病(抗病 毒, 抗細(xì)菌 ) 基因 , 種子貯藏蛋白的基因 , 以及人的胰島素基因 , 干擾素基因等. 獲取目的基因 的方法有 1. 從染色體 DNA中分離2.人工合成 3.從mRNA合成cDNA 4.基因文庫(kù)生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 -專心做生物 !bbioo 雙酶切

52、生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái)ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 連接反應(yīng) 生物秀論壇 Bbs.bbioo 易生物 - 領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo 重組體的轉(zhuǎn)化 1. 重組體導(dǎo)入大腸桿菌(1) 氯化鈣法 (2) 電擊法 (3) 體外包裝法 2. 重組體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞 (1) 磷酸鈣共沉淀法(2) 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 (3) 病毒感染法(4) 顯微注射法生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 - 專心做生物 ! bbioo DNA 重組體的篩選與鑒定 1. 目的

53、基因檢測(cè) 2.DNA 限制酶切圖譜分析3. 根據(jù)重組載體的表型進(jìn)行篩選 4. 利用核酸雜交和放射自顯影進(jìn)行鑒定 生物秀論壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 -專心做生物 !bbioo 常見注意事項(xiàng) 1. 載體的選擇2. 酶切位點(diǎn)的選擇與克隆引物的設(shè)計(jì) 3. 酶切反應(yīng)的設(shè)計(jì)4. 酶切實(shí)驗(yàn) 5. 連接比例的設(shè)置6. 連接溫度與時(shí)間 7. 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 的 制 備 8. 轉(zhuǎn) 化 9. 重 組 子 的 鑒 定 生 物 秀 論 壇Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 -專心做生物 !bbioo 載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)具有兩個(gè)以上的

54、遺傳標(biāo)記物 , 便于重組體的篩選和鑒定 有多個(gè)限制性內(nèi)酶切位點(diǎn) , 至少有兩種酶能在同一體系 中反應(yīng) .拷貝數(shù)高 , 表達(dá)量高 , 表達(dá)穩(wěn)定 . 具有強(qiáng)啟動(dòng)子和相應(yīng)的表達(dá)標(biāo)簽和蛋白酶位點(diǎn) , 便于表 達(dá)產(chǎn)物的鑒定純化 . 生物秀論壇 Bbs.bbioo 易生物 -領(lǐng) 先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 -專心做生物 ! bbioo 酶切位點(diǎn)的選 擇 必須是選定載體的 MCSk的兩種酶切位點(diǎn)盡量選用能產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) , 并 且上游酶切位點(diǎn)盡量靠近起始密碼子. 目的基因中不能含有選用的酶切位點(diǎn) 兩種酶盡可能在同一體系中反應(yīng) , 并且具有 相近 的切割效率 為了保證切割效率,

55、在設(shè)計(jì)的克隆引物的酶切位 點(diǎn)前面必須加上合適的保護(hù)堿基. 生物秀論壇 Bbs.bbioo 易生物 - 領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺(tái) ebioe 生物秀 -專心做生物 ! bbioo 酶切反應(yīng)大多數(shù)限制 酶貯存在50%甘油溶液中, 以避免在 -20 條件下結(jié)冰. 當(dāng)最終反應(yīng)液中甘油濃度大于12%時(shí), 某些限制酶的識(shí)別特異性降低 , 從而抑制酶活性. 因此加入反應(yīng)的酶體積不超過(guò)反應(yīng)總體積的10%.反應(yīng)混合物中基因組 DN醺物的濃度不宜太大，小體積中過(guò)高濃度的基因組DN砥形成粘性DNA容液,從而抑制酶的擴(kuò)散, 并降低酶活性 . 建議酶切反應(yīng)的基因組DNA 濃度為0.1-0.4ug/ul. 同時(shí)RN值該盡量消化去除.當(dāng)要用兩種或兩種以上限制 酶切割DNA 時(shí), 必須選擇好通用緩沖液, 則兩種酶才可同時(shí)切割 . 反應(yīng)混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA,可維持酶的穩(wěn)定性.酶切底物DNA立 具備一定的純度,如果溶液中含有跡量酚，氯仿，乙 醇，大于10mM的EDTA,SDS以及過(guò)量的鹽離子濃度，都會(huì)不同程 度影響限制酶的活性.生 物秀論壇 Bbs.b