酶制劑生產(chǎn)與應(yīng)用

1、第一章 概述第一節(jié) 酶制劑的定義一、 酶制劑的定義 從生物 (包括動(dòng)物、植物、微生物）中提取的具有生物催化能力的酶，輔以其他成分，用于加速加工過(guò)程和提高產(chǎn)品質(zhì)量的制品，稱為酶制劑。二、 酶制劑的分類1.從形態(tài)上分類 從形態(tài)上可以將酶制劑分為固體酶制劑和液體酶制劑。 2.按酶制劑在應(yīng)用領(lǐng)域上的分類 按酶制劑的應(yīng)用領(lǐng)域可以分為:用于工業(yè)生產(chǎn)上作為催化劑的工業(yè)酶制劑，如a-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、葡萄糖異構(gòu)酶、青霉素酰化酶、天冬氨酸酶、富馬酸酶等;2.按酶制劑在應(yīng)用領(lǐng)域上的分類 用于飼料中提高動(dòng)物消化率的酶制劑，又稱飼料酶制劑; 用于食品生產(chǎn)加工的酶制劑，又稱為食品酶制劑; 用于臨床檢測(cè)的診斷酶制劑;

2、 用于化學(xué)分析的酶分析制劑; 用作藥物的藥物酶制劑; 用于洗滌劑的洗滌酶制劑等。3.按酶的來(lái)源不同分類 按酶的來(lái)源不同，可將酶制劑分為植物酶制劑、動(dòng)物酶制劑和微生物酶制劑。4.按酶生產(chǎn)加工方法的不同分類 針對(duì)應(yīng)用的需要，可將酶分為游離酶制劑、固定化酶制劑、酶試紙、酶電極等。5.按酶的組成成分分類 根據(jù)酶制劑中所含酶種類的多少可分為單一酶制劑 (只含有一種酶，如淀粉)和復(fù)合酶制劑。 復(fù)合酶制劑由一種或幾種單一酶制劑為主體，加上其他單一酶制劑混合而成，或由一種或幾種微生物發(fā)酵獲得。復(fù)合酶制劑可利用各種酶的協(xié)同作用，降解各種底物，最大限度地達(dá)到酶制劑的作用。6.按酶的含量分類 根據(jù)酶制劑中酶的濃度，

3、可將酶分為普通酶和濃縮酶。普通酶具有價(jià)格低、效果好等優(yōu)點(diǎn)。濃縮酶顏色較深，具有成本較低、用量少的特點(diǎn)。第二節(jié) 酶分析一、反應(yīng)速率用來(lái)測(cè)定催化活性 酶作為生物催化劑，提高了反應(yīng)的速率或允許該反應(yīng)進(jìn)行。因此，可以檢測(cè)底物的轉(zhuǎn)化率來(lái)確定酶的催化活性。 酶動(dòng)力學(xué)的各個(gè)方程中，底物的濃度保持在一個(gè)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于米氏常數(shù)的水平上，這樣，所有的酶都被底物所飽和，反應(yīng)以恒速即最大速率進(jìn)行。因此，酶的催化活性與所用的酶量線性相關(guān)。在酶的活性的測(cè)定中，往往要設(shè)法達(dá)到這一條件。 二、單位定義 酶活單位最初是由第一個(gè)發(fā)現(xiàn)酶并對(duì)酶進(jìn)行描述的研究者來(lái)定義的。因此在一些較早的文獻(xiàn)中，酶的活性以任意各種形式來(lái)表示，如吸光度的變化、

4、還原基團(tuán)的增加，以mg或µg表示的被轉(zhuǎn)化底物的數(shù)量。這些參數(shù)和各種時(shí)間單位，如1min、30min或1h。 1961年，世界生物化學(xué)協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)用國(guó)際單位U來(lái)定義酶的活性，定義為在優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)條件下，1U即每分鐘催化1mol的底物的量。 有關(guān)酶基本的國(guó)際單位（SI），世界臨床化學(xué)家協(xié)會(huì)數(shù)量和單位專家小組以及國(guó)際理論和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)臨床化學(xué)數(shù)量和單位委員會(huì)定義了一個(gè)基本單位，katal，定義為測(cè)定體系中，每秒鐘催化1mol的轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率所需要的酶的數(shù)量，但這個(gè)單位并不常用。每一次測(cè)定中必須標(biāo)明溫度。通常，在040范圍內(nèi)，溫度每提高10酶催化反應(yīng)的速率會(huì)變?yōu)?倍。而為獲得可重復(fù)性的結(jié)果，

5、必須精確控制溫度，并保持其恒定。 但由于許多實(shí)際的原因，對(duì)于許多酶反應(yīng)的監(jiān)控并不能夠通過(guò)消耗的底物或生成的產(chǎn)物的化學(xué)計(jì)量來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，對(duì)于某一特定的酶，它的催化活性也許根本不能用國(guó)際單位來(lái)表示。在分子生物學(xué)中，大部分的酶的單位定義相當(dāng)隨意。例如，限制性內(nèi)切酶（E.C.3.1.21.3-5）的酶活定義為：在一定的溫育條件下，酶使DNA某一特定鍵斷裂，在電泳后可以檢測(cè)到的精確數(shù)量（通常1mg）的DNA時(shí)酶的催化活性。 還有其他一些定義這些酶活的參數(shù)，如以微克、納摩爾、吸光度單位或者是堿基對(duì)的數(shù)目來(lái)表示的核酸降解以及核苷在核酸分子中的結(jié)合，由于一些實(shí)際的原因，不同的時(shí)間周期如1min、10min 、

6、30min或60min被選作參考。 三、吸光度法 基本的考慮因素。由于吸光度法技術(shù)上簡(jiǎn)單可靠，所用儀器價(jià)格合理，因此是目前酶活測(cè)定中首選的方法之一。當(dāng)?shù)孜锘虍a(chǎn)物是有顏色的，或者是在紫外區(qū)有光吸收的，吸光度法就可以非常快速和方便地進(jìn)行，因?yàn)槲猱a(chǎn)物的出現(xiàn)速率或者消失速率可以用分光光度法來(lái)跟蹤檢測(cè)。 催化活性z對(duì)應(yīng)于每分鐘的吸光度的變化為：z=（AV×100）/dt式中，V是測(cè)量體積，L;t是時(shí)間，min；z的單位是mmol/min，對(duì)英語(yǔ)前面章節(jié)里給出的國(guó)際單位制U的定義。四、熒光光度法 熒光光度計(jì)的方法很少用于粗酶或者是純酶制備中催化活性的檢測(cè)。由于它具有很高的靈敏度，可以用于器官或

7、者組織區(qū)域的微量酶的測(cè)定。 總體上，這種方法的靈敏度是吸光光度法的1000多倍。 五、發(fā)光法測(cè)定 發(fā)光法應(yīng)用熒光、磷光以及化學(xué)發(fā)光等作為檢測(cè)器體系?；畹纳矬w中觀察的化學(xué)放光稱作生物體發(fā)光。生物體發(fā)光是由成為熒光素酶的酶類催化產(chǎn)生的，這類酶的底物即蟲(chóng)熒光素，被轉(zhuǎn)化為發(fā)光產(chǎn)物。在發(fā)光法中，單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)體系發(fā)射的光子數(shù)目可以由特殊設(shè)計(jì)的儀器照度計(jì)來(lái)測(cè)量，這類儀器是以單光子探測(cè)器為基礎(chǔ)的，通常是光電倍增管。由來(lái)源于螢火蟲(chóng)的熒光素酶催化的反應(yīng)就是一個(gè)例子，螢火蟲(chóng)熒光素4-單加氧酶（ATP水解酶） ATP+D-蟲(chóng)熒光素+O2氧合蟲(chóng)熒光素+AMP+pp+CO2+0.9h 在該反應(yīng)中，ATP作為底物被消耗

8、掉，光子在562nm的波長(zhǎng)處發(fā)射。每摩爾的蟲(chóng)熒光素的量子產(chǎn)量是0.9愛(ài)因斯坦，也即消耗掉一分子ATP，大約發(fā)射1個(gè)光子。因此該反應(yīng)適合用來(lái)測(cè)定ATP，從而測(cè)定那些能夠催化ATP消耗或者是ATP生產(chǎn)的反應(yīng)的那些酶。 為借助于螢火蟲(chóng)的生物發(fā)光來(lái)檢測(cè)酶的活性，光強(qiáng)度必須在幾分鐘內(nèi)呈線性增加，而且必須嚴(yán)格正比于酶的催化活性。這些測(cè)定條件在測(cè)定肌酸激酶的催化活性時(shí)，已經(jīng)得到了實(shí)現(xiàn)。 磷酸肌酸+ADP肌氨酸+ATP 其他依賴于NAD（P）的反應(yīng)可以通過(guò)來(lái)源于發(fā)光細(xì)菌的生物發(fā)光來(lái)跟蹤檢測(cè)。六、輻射線測(cè)定 當(dāng)使用一些放射性標(biāo)記的底物時(shí)，一些酶的活性就可以得到高靈敏度的測(cè)定了。這種技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域以

9、檢測(cè)：（1）放射性標(biāo)記的核苷結(jié)合入不溶于酸的核苷酸或者多核苷酸（DNA或RNA聚合酶）；（2）放射性標(biāo)記的DNA的分解（核酸外切酶）；（3）放射性標(biāo)記的磷酸基團(tuán)從g-32P-ATP到多核苷酸的5-羥基端（多核苷酸激酶）的轉(zhuǎn)移；（4）載體基質(zhì)上放射性標(biāo)記的焦磷酸鹽之間的交換（T4DNA連接酶）。標(biāo)記最常用的同位素是32P,14C，3H，用的較少的是35S。七、電位測(cè)定法 pH敏感的玻璃電極可以用于測(cè)定那些產(chǎn)生或消耗質(zhì)子的反應(yīng)。出于這個(gè)目的，利用反滴定法保持pH的恒定，所需要的酸或堿的消耗量就可以被測(cè)定。電極控制著自動(dòng)滴定器，這個(gè)概念就是BUCHER描述的pH-stat技術(shù)。 一個(gè)典型的例子是脂肪

10、酶（E.C.3.1.1.3）9001-62-1催化活性的測(cè)定。某脂（甘油三酯）被該酶水解，生產(chǎn)的脂肪酸被NaOH在pH-stat的模式下反滴定中和。 甘油三酯+H2O甘油二酯+脂肪酸 橄欖油作為底物，和含有脂肪酶的稀釋樣品溶液混合溫育，混合物在恒定pH下滴定。紀(jì)錄器標(biāo)繪出了NaOH的消耗量隨時(shí)間的變化曲線，所得到的斜率與酶的催化活性相關(guān)。其他的例子如木瓜蛋白酶（E.C.3.4.22.2）9001-73-4的測(cè)定和葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, E.C.1.1.3.4）9001-37-0的測(cè)定。八、電導(dǎo)測(cè)定法 原則上，所有酶的反應(yīng)只要能夠引起總離子流動(dòng)性的變化，就能夠通過(guò)電導(dǎo)測(cè)定

11、法來(lái)測(cè)定。這樣，使用未修飾的彈性蛋白作為底物，胰肽酶（elastase，E.C.3.4.21.36）的胰肽水解活性已得到了測(cè)定。其他的一些應(yīng)用也有報(bào)道。反應(yīng)中肽鍵的斷裂導(dǎo)致質(zhì)子的釋放。九、量熱法 許多酶反應(yīng)會(huì)放出熱，因此引起人們對(duì)量熱（量焓的）法的興趣。在合適的實(shí)驗(yàn)安排下，溫度傳感器用作測(cè)定酶催化活性的裝置。根據(jù)這種方法，分析化學(xué)出現(xiàn)了一個(gè)新的領(lǐng)域。以前稱為微量熱法，現(xiàn)在大家所熟知的稱為熱焓測(cè)量法。這種方法主要應(yīng)用于研究領(lǐng)域。 十、旋光測(cè)定法 旋光測(cè)定法很少被使用，一定程度上是因?yàn)槠洳环奖阈浴５窃跍y(cè)定變旋酶（mutarotase，E.C.5.1.3.3）9031-76-9的催化活性時(shí)確是必需

12、的，該酶催化a-葡萄糖和b-葡萄糖之間的轉(zhuǎn)化平衡。十一、測(cè)壓法 測(cè)壓法是生物化學(xué)中的經(jīng)典方法之一，它不再用于酶的常規(guī)測(cè)定。以前，葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）和精氨酸酶（arginase, E.C.3.5.3.1）9000-96-8以及其他的一些酶是用這種方法測(cè)定的。十二、黏度測(cè)定法 黏度測(cè)定法在酶活檢測(cè)中在實(shí)際上已經(jīng)被摒棄了。例如，以前纖維素酶（cellulase，E.C.3.2.1.4）9012-54-8的活性是通過(guò)單位時(shí)間黏度的變化來(lái)測(cè)定的。現(xiàn)在纖維素酶的測(cè)得是通過(guò)顯色法反應(yīng)來(lái)測(cè)定。 纖維素低聚糖+n葡萄糖紅色染料十三、比濁法 濁度法能夠擁有不同酶的測(cè)定。例如，用溶菌酶胞

13、壁質(zhì)酶（muramidase），E.C.3.2.1.17裂解細(xì)菌細(xì)胞壁。使用標(biāo)準(zhǔn)的底物懸浮液（藤黃微球菌（Micrococcus luteus）的干芽孢），25在450nm處測(cè)定吸光度的降低。十四、固定化酶 固定化酶用于在分析化學(xué)中，并在化學(xué)品、醫(yī)藥品以及食品的生產(chǎn)中用作催化劑，它們還可以作為研究結(jié)合酶的簡(jiǎn)單明確的模型。 由于固定化酶的特殊結(jié)構(gòu)，需要采用專門(mén)的測(cè)定法。除了需要不同于可溶酶的最佳條件外，孔徑、孔徑分布、機(jī)械和化學(xué)結(jié)構(gòu)、基質(zhì)的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)異界用作固定化酶的催化活性等等，都必須考慮到。 對(duì)于不可溶酶至少有兩種不同的測(cè)定步驟：一個(gè)是在容器中攪拌懸浮，另一個(gè)是利用填充床和柱反應(yīng)器。這樣的

14、測(cè)定條件非常接近于工業(yè)應(yīng)用中所使用的條件。酶的活性檢測(cè)可以連續(xù)或者是分批測(cè)定。 電導(dǎo)分析法，電勢(shì)測(cè)定法以及旋光測(cè)定法比光度測(cè)定法更適合用于檢測(cè)，因?yàn)槟切y(cè)定方法可以使反應(yīng)能夠被連續(xù)跟蹤檢測(cè)，而不需要添加另外的指示酶、輔酶或者第二個(gè)底物。一個(gè)例子就是固定化青霉素酰胺酶（penicillin amidase, E.C.3.5.1.11）9014-06-6的測(cè)定。 青霉素G+H2O 6-氨基青霉素+乙酸苯酯+H+十五、電泳 對(duì)于測(cè)定核酸酶，尤其是限制性內(nèi)切酶的催化活性，電泳是必不可少的一個(gè)工具。它也用于其他一些基因工程中重要的酶，如DNA甲基化酶。限制性酶催化DNA的特異性切割，如大腸桿菌（Esch

15、erichia coli）的噬菌體DNA的切割，該DNA是基因工程中一個(gè)典型的底物。該DNA被切割成一些確定長(zhǎng)度的小片段。對(duì)于所有的DNA片段，每個(gè)堿基對(duì)所帶的負(fù)電荷是相同的，因此根據(jù)片段的長(zhǎng)度來(lái)分離。 對(duì)于每一個(gè)特異的酶-底物反應(yīng)，仔細(xì)地優(yōu)化條件，就可以通過(guò)電影將切割產(chǎn)物完整地的或不完全切割的分子相分離。 電泳通常使用高質(zhì)量的瓊脂糖凝膠作為載體材料。對(duì)于每一個(gè)分辨率問(wèn)題，都需要一個(gè)特定的瓊脂糖濃度，如對(duì)于大片段，采用相對(duì)較低的瓊脂糖濃度（每100mL0.5g），對(duì)于小片段，則采用相對(duì)高一些的瓊脂糖濃度（每100mL 1.62g）。 當(dāng)必須要分離很小的片段時(shí)，則可以用聚丙烯酰胺作為替代的載體材

16、料。分離的DNA片段可以通過(guò)瑛姑染料溴化乙錠染色來(lái)進(jìn)行觀察。在電泳后，將膠片至于一個(gè)單獨(dú)的容器中染色，用來(lái)標(biāo)記DNA片段，或更容易的做法，膠片染色后直接在膠和緩沖液中（如1mg/ml）進(jìn)行電泳，將DNA片段進(jìn)行標(biāo)記。 當(dāng)膠片在長(zhǎng)波長(zhǎng)（如366nm）的紫外燈照射下，分離的DNA片段就變得可見(jiàn)并可以拍攝圖片了。例如，限制性酶Hind的電泳檢測(cè)簡(jiǎn)單描述如下，見(jiàn)圖10。（1）單位定義 在0.025mL體積內(nèi)，完全切割1mgDNA的Hind催化活性為一個(gè)單位。反應(yīng)在0.025mL的一定緩沖液混合物中進(jìn)行，37溫育60min后結(jié)束。（2）測(cè)定 不同體積（13mL）的幾種稀釋倍數(shù)（1:10,1:20,1：:

17、30）的酶液與1mgDNA一起溫育，總體積均為0.025mL。60min后，將反應(yīng)混合物放在冰上冷卻，并加入0.015mL的終止液終止反應(yīng)；然后將反應(yīng)的混合物（0.02mL）放置于瓊脂糖凝膠的泳道中。（3）瓊脂糖凝膠 該膠是由1g/100mL 瓊脂糖和1mg/mL的溴化乙錠組成。膠的尺寸是（200×200）mm2；總體積250mL；并用梳子制備（1×7）mm2的泳道。（4）電泳： 儀器設(shè)置為液面下電泳（100V，2h）。緩沖液體系是三-（羥甲基） 氨基甲烷乙酸t(yī)ris(hydroxymethyl) aminomethane-acetate,40mmol/L,乙二胺四乙酸鈉（

18、disodium ethylenediamine-tetraacetate，EDTA），2mmol/L；pH8.2.。緩沖液中含有1mg/mL溴化乙錠。 （5）檢測(cè) 電泳結(jié)束后，凝膠直接用長(zhǎng)波長(zhǎng)的紫外燈（366nm）照射并拍攝（人造偏光板CU5/薄膜類型107）；在膠上對(duì)應(yīng)完全特征的DNA片段處估算酶量如圖10中泳道c。催化活性計(jì)算如下。原始酶液的活性：活性=（稀釋倍數(shù)/樣品體積，mL）×(單位/體積，mL) 在上面的例子中，原始酶液以1:30稀釋后，實(shí)現(xiàn)完全切割所需要的最小體積為0.003mL，因而計(jì)算其活性為10000U/mL。第三節(jié) 酶制劑的質(zhì)量評(píng)估一、質(zhì)量指標(biāo) 酶制劑的質(zhì)量是

19、由其活性、純度、穩(wěn)定性、配方和包裝來(lái)表征。這些參數(shù)互相影響，但是配方和包裝很容易控制并保持恒定。其他的參數(shù)互相影響，因而質(zhì)量被認(rèn)為是活性、純度和穩(wěn)定性的函數(shù)。二、 比活 酶制劑一個(gè)最重要的質(zhì)量指標(biāo)是其比活，也即與其蛋白含量相關(guān)的催化活性。比活單位通常表示為，U/mg(單位每毫克)，或者對(duì)于不夠純的產(chǎn)物，U/g（單位每克）只有當(dāng)酶的比活能夠和其同一來(lái)源的高純度酶相比較時(shí)才能夠準(zhǔn)確的求取。因此，酶活性測(cè)定必須在完全相同的條件下測(cè)定，包括蛋白質(zhì)量的測(cè)定。三、蛋白質(zhì)測(cè)定 蛋白質(zhì)含量是酶制劑的比活測(cè)定中的最重要參考，下面的幾個(gè)段落中簡(jiǎn)單介紹了幾種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法。所有的這些方法基于不同原理，并取決于酶

20、蛋白的氨基酸組成。因此，不同的方法會(huì)得到不同的數(shù)值。（1）紫外吸收（2）縮二脲法（3）BCA法（4）Lowry法（5）蛋白質(zhì)-染料的結(jié)合 （6）Kjeldahl分析法四、污染活性 污染活性，也就是原料酶中含有的其他酶量，是酶的一個(gè)非常重要的質(zhì)量指標(biāo)。這通常和主體酶的活性有關(guān)，并以百分?jǐn)?shù)的形式表示。由于它的絕對(duì)值通常很小，不能用蛋白量（毫克）來(lái)表示，因此并不影響酶制劑的總比活。 五、電泳純度 電泳由于其高的靈敏度（能檢測(cè)出50 mg/mL的污染蛋白），在酶的純度評(píng)估中非常重要。該方法對(duì)于測(cè)定污染活性而言并不占有優(yōu)勢(shì)，而且喪失了酶活的蛋白質(zhì)通常并不影響酶的分析。電泳在分析同工酶時(shí)就突顯出了其重要性

21、，因?yàn)橥っ覆荒芡ㄟ^(guò)其催化作用而分開(kāi)，只能通過(guò)其物理性質(zhì)如電荷，才能分開(kāi)。對(duì)于確認(rèn)同工酶中的乳酸脫氫酶而言，電泳是一個(gè)必不可少的工具。六、高壓液相色譜 自從20世紀(jì)80年代以來(lái)，該方法在蛋白質(zhì)方面使用已經(jīng)非常普及了。通過(guò)峰圖評(píng)估，高效液相色譜測(cè)定法用來(lái)測(cè)定酶的純度或者獲得相關(guān)同工酶的信息。如過(guò)氧化物酶（peroxidase，E.C.1.11.1.7），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，E.C.3.1.3.1）以及過(guò)氧化氫酶（catalase，E.C.1.1.1.6）。七、性能測(cè)試 對(duì)于許多應(yīng)用場(chǎng)合，如果酶制劑不含有任何有干擾的污染活性，就可以使用部分純化的酶制劑，因?yàn)橄鄬?duì)于

22、高純的產(chǎn)品而言其價(jià)格便宜。但是，舉個(gè)例子，它們也許含有未知的副產(chǎn)物，會(huì)干擾酶的分析。為避免這些問(wèn)題，應(yīng)該進(jìn)行性能測(cè)試。如用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）和過(guò)氧化氫酶（peroxidase，E.C.1.11.1.7）來(lái)檢測(cè)葡萄糖，或者用甘油激酶（glycerokinase，E.C.2.7.1.30）來(lái)測(cè)定甘油。八、氨基酸分析和蛋白質(zhì)序列分析 這兩種方法通常都被用來(lái)估算酶的數(shù)量以及確定它們的組成。對(duì)于氨基酸分析，蛋白質(zhì)首先被完全水解（化學(xué)法或者酶法），釋放的氨基酸通過(guò)定量色譜來(lái)測(cè)定。氨基酸需要衍生化來(lái)改善其色譜性能或可檢測(cè)性。盡管這種方法很費(fèi)力，但是經(jīng)常使用。九、穩(wěn)定性 酶應(yīng)用中一

23、個(gè)重要的因素就是，濃縮或稀釋的酶液在和別的物質(zhì)混合時(shí)的穩(wěn)定性。酶的穩(wěn)定性應(yīng)用于醫(yī)藥產(chǎn)品的生產(chǎn)、食品化學(xué)以及酶的分析中。一些酶可以通過(guò)其水溶液中加入甘油（50vol%）、硫酸銨（大約3.2mol/L）或者氯化鈉（3mol/L）來(lái)保持其穩(wěn)定性。此外，許多酶可以在如鹽、防腐劑、惰性蛋白（主要是牛血清蛋白）或碳水化合物等穩(wěn)定劑存在的條件下，以冷凍干燥的形式保持很長(zhǎng)的一段時(shí)間。十一、酶制劑的劑型 酶制劑應(yīng)該根據(jù)它的應(yīng)用而采用不同的劑型。如果用于分析，應(yīng)該容易用移液管吸取，而且最好沒(méi)有添加穩(wěn)定劑和防腐劑，因?yàn)樗鼈儠?huì)消弱酶的活性。例如，如果用谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，E.

24、C.1.4.1.3）9029-12-3來(lái)測(cè)定尿素或者是銨，應(yīng)該不能含有任何痕量的氮。. 包裝 仔細(xì)地選擇包裝材料對(duì)于酶的操作也是非常重要的。用于保存冷凍干燥的酶所用的瓶子和塞子必須絕對(duì)緊密以防止?jié)駳馇秩搿２ＡШ退芰掀孔右埠腿樱ㄏ鹉z的或塑料的）一樣，絕對(duì)不能讓一絲痕量的重金屬和其他使酶失活的物質(zhì)泄漏進(jìn)入酶溶液或懸浮液中。有些情況下，酶必須避光保存，包裝在棕色的玻璃瓶?jī)?nèi)。第二章 粗酶制劑的生產(chǎn)技術(shù)第一節(jié) 提取分離法產(chǎn)酶技術(shù)提取分離法產(chǎn)酶技術(shù)主要包括細(xì)胞破碎、酶的提取、酶的粗分離和酶的精制等技術(shù)環(huán)節(jié)，其中酶的精制在第三章中介紹。一、細(xì)胞破碎（一）機(jī)械破碎法 1、搗碎法 2、珠磨法 3、勻漿法 （二

25、）物理破碎法 1、超聲波破碎法 2、凍融法（三）化學(xué)破碎法 1、有機(jī)溶劑滲透法 2、表面活性劑滲透法（四） 酶溶法二、酶的抽提 酶的抽提是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┗蛉芤褐械倪^(guò)程，也稱為酶的提取。該過(guò)程實(shí)際上經(jīng)常是在細(xì)胞破碎時(shí)已經(jīng)同時(shí)進(jìn)行。（一）抽提方法1、稀鹽法：0.020.5mol/L2、稀酸法: pH不能太低；3、稀堿法：pH不能太高；4、有機(jī)溶劑法：適用結(jié)合酶；5、雙水相萃取法：（二）提取條件的控制1、溫度2、pH3、鹽濃度4、雜菌三、酶的粗分離（一） 沉淀分離1、鹽析沉淀法2、有機(jī)溶劑沉淀法3、等電點(diǎn)沉淀法4、有機(jī)聚合物沉淀法5、選擇性變性沉

26、淀法（二） 粗濾分離1、常壓過(guò)濾2、加壓過(guò)濾3、減壓過(guò)濾：真空過(guò)濾或抽濾（三） 離心分離1、差速離心法2、密度梯度離心法3、等密度梯度離心法第二節(jié) 微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶技術(shù)一、產(chǎn)酶微生物及其保藏（一） 常用產(chǎn)酶微生物（二）菌種的保藏1、斜面冰箱保藏法2、沙土管保藏法3、石蠟油保藏法4、真空干燥冷凍保藏法5、液氮超低溫保藏法（二）發(fā)酵培養(yǎng)基的配制 1、培養(yǎng)基的基本組分 2、培養(yǎng)基配制實(shí)例（三)發(fā)酵方式 固體發(fā)酵、液體深層發(fā)酵和固定化細(xì)胞發(fā)酵 1、固體發(fā)酵法 2、液體深層發(fā)酵法 3、固定化細(xì)胞發(fā)酵法 固定化細(xì)胞又稱為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞，是指采用各種方法固定在載體上，在一定空間范圍進(jìn)行生長(zhǎng)、繁

27、殖和新陳代謝的細(xì)胞。固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶與游離細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶相比，具有以下特點(diǎn):細(xì)胞密度大，可提高產(chǎn)酶能力；發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)使用或連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間；細(xì)胞固定在載體上，有利于連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)；發(fā)酵液中含菌體較少，利于產(chǎn)品分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量等。和游離細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶相比，固定化細(xì)胞發(fā)酵在以下幾個(gè)方面應(yīng)加以注意：固定化細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)；溶解氧的供給；溫度的控制；培養(yǎng)基的控制。（四）發(fā)酵條件的控制 1、pH 2、溫度 3、溶解氧三、提高產(chǎn)酶的措施 1、添加誘導(dǎo)物： 誘導(dǎo)物一般分為三類：酶的作用底物、酶的反應(yīng)物和酶的底物類似物。 2、控制遏制物濃度 3、添加表面活性劑：非離子型表面活性劑 4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)

28、劑 第三節(jié) 酶的濃縮、干燥與保藏經(jīng)過(guò)發(fā)酵或細(xì)胞破碎、抽提等操作，所得發(fā)酵液或提取液中酶蛋白濃度很低，如發(fā)酵液中酶蛋白濃度一般為0.1%1%，需進(jìn)一步濃縮、干燥，制備成一定形態(tài)的酶制劑，以便使用、運(yùn)輸和保藏。濃縮與干燥是使酶與溶劑（通常是水）分離的技術(shù)過(guò)程，在酶制劑的制備過(guò)程中是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。一、酶的濃縮1、蒸發(fā)濃縮法2、離子交換濃縮法3、吸水濃縮法（1）用葡聚糖凝膠（分子篩）濃縮：（2）用聚乙二醇濃縮：二、酶的干燥 干燥是將固體、半固體或濃縮液中的水分（或其他溶劑）除去一部分，以獲得含水較少的固體的過(guò)程。其目的主要是提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性，使之易于保存、運(yùn)輸和使用。干燥通常是生物產(chǎn)物成品化前的最后

29、加工過(guò)程。因此，加工的質(zhì)量直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和價(jià)值。 酶干燥的方法很多，根據(jù)酶在高溫、干燥條件下容易失活變性的特點(diǎn)，常用的干燥方法有以下幾種：1、真空干燥2、冷凍干燥3、噴霧干燥4、氣流干燥5、吸附干燥 三、酶制劑的保藏 要使酶制劑較長(zhǎng)時(shí)間保持活性和穩(wěn)定性，必須根據(jù)酶的特性，采取合適的保存條件。下面介紹酶制劑保存的主要條件。1、維持合適的溫度 酶保存的溫度一般為04，少量精制的純酶常在-20 冰箱中保存，甚至在-80 或液氮中保存，冷凍干燥保存酶更好。2、維持合適的pH3、進(jìn)行抗氧化保護(hù)：二硫蘇糖醇、二巰基乙醇、還原型谷胱甘肽4、提高酶的濃度和純度 一般地說(shuō)，酶的濃度越高，雜蛋白越少，酶越穩(wěn)定

30、；低濃度時(shí)酶易于解離、吸附或發(fā)生表面變性失效。將酶制備成晶體或干粉更有利于保存。 此外，還可通過(guò)加入酶的各種穩(wěn)定劑來(lái)加強(qiáng)酶穩(wěn)定性，延長(zhǎng)酶的保存時(shí)間。第三章 酶的精制技術(shù)酶的精制也叫精細(xì)純化是指將酶與雜質(zhì)進(jìn)一步分離，使之達(dá)到較高純度的技術(shù)過(guò)程。 第一節(jié) 酶的膜分離技術(shù) 膜分離技術(shù)是指借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的多組分的溶質(zhì)或溶劑進(jìn)行分離或濃縮的技術(shù)。 膜分離技術(shù)根據(jù)過(guò)程推動(dòng)力的不同，大體可分為兩類。一類是以壓力為推動(dòng)力的過(guò)程，如微濾(孔徑為0.110 mm)、超濾(0.0010.1 mm)和反滲透(0.00010.001 mm)分別需至0.050.5MPa、011.

31、0MPa、1.010MPa的操作壓力(壓差)：另一類足以電化學(xué)相互作用為推動(dòng)力的膜過(guò)程，如電滲透、透析。在酶的精細(xì)純化過(guò)程中，應(yīng)用最多的是透析與超濾技術(shù)。 一、透析（一）透析原理 透析是利用半透膜兩側(cè)溶質(zhì)濃度差為傳質(zhì)推動(dòng)力和小分子物質(zhì)的擴(kuò)散作用，從溶液中分離出小分子物質(zhì)而截留大分子物質(zhì)的過(guò)程。（二）透析膜 可以充當(dāng)透析膜的材料很多，如禽類的嗉囊、獸類的膀胱、羊皮紙、玻璃紙（賽璐珞）、硝化纖維等。人工制作透析膜多以纖維素的衍生物作為材料。 （三）透析操作 透析操作時(shí)，透析袋一端用橡皮筋或線繩扎緊，也可以使用特制的透析袋夾夾緊，由另一端灌的滿水，用手指稍加壓，檢查不漏，方可裝入待透析液，通常要留1

32、/31/2空間，以防透析過(guò)程中，透析的小分子量較大時(shí)，袋外的水和緩沖液過(guò)量進(jìn)入袋內(nèi)將袋漲破。二、超濾（一）超濾原理 超濾是最常用的膜分離技術(shù)，利用有選擇通透性的微孔膜，在液壓作用下，小溶質(zhì)分子隨溶劑透過(guò)膜轉(zhuǎn)移到膜的另一側(cè)，而大溶質(zhì)分子（酶）則被截留下來(lái)，因此大小溶質(zhì)分子得以分離。 超濾是借助超濾膜對(duì)溶質(zhì)在分子水平上進(jìn)行物理篩分的分離技術(shù)。超濾時(shí)的操作壓力一般控制在0.050.7Mpa，壓力可由壓縮氣體或壓力泵來(lái)維持。（二）超濾膜組件 在工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)中，膜過(guò)濾裝置由膜組件構(gòu)成。由膜、固定膜的支撐體、間隔物以及收納這些部件的容器構(gòu)成的一個(gè)單元稱為膜組件或膜裝置。膜組件的結(jié)構(gòu)根據(jù)膜的形式而異，目前

33、，市售商品膜組件主要有管式、平板式、螺旋卷式和中空纖維（毛細(xì)管）式四種，其中管式和中空纖維式膜組件根據(jù)操作方式不同，又分為內(nèi)壓式和外壓式。圖3-3為主要膜組件的結(jié)構(gòu)示意圖。四種膜組件的性能如表3-1所示。 目前，在超濾中常用的是離心泵和旋渦泵，對(duì)某些具有生理活性的物質(zhì)的超濾分離，為了防止葉輪高速旋轉(zhuǎn)所造成的失活常選用蠕動(dòng)泵。(三)超濾裝置 (1) 攪拌式超濾器。攪拌式超濾器內(nèi)裝磁力攪拌器（圖3-4），用以加速膜面大分子的擴(kuò)散作用，保持流速。單位時(shí)間內(nèi)透過(guò)液體量與有效膜面積成正比，工作壓力為303.95065kPa。它適合于實(shí)驗(yàn)室處理少量濃度稀的酶液。（2）小棒超濾器。棒心為多孔高聚物支持物，外

34、裹各種規(guī)格的超濾膜，使用時(shí)將其插入待分離液中，開(kāi)動(dòng)連接的真空系統(tǒng)即進(jìn)行超濾，它適合于處理少量濃度稀的大分子樣液，一次可以同時(shí)處理多個(gè)樣品。小棒超濾器裝置見(jiàn)圖3-5（3）淺道系統(tǒng)超濾裝置。這類超濾器使液體通過(guò)螺旋形淺道，向與膜平行的方向流動(dòng)。淺道底部有膜，由于液體在超濾膜表面高速流動(dòng)，濃度差極化不顯著。而且液體與膜的接觸面積也大于一般攪拌型裝置，故有很好的濾速。淺道系統(tǒng)超濾裝置見(jiàn)圖3-6 （4）中空纖維式超濾器。該超濾器的過(guò)濾介質(zhì)是具有與超濾膜類似結(jié)構(gòu)的中空纖維絲，每根纖維絲即為一個(gè)微型管狀超濾器。中空纖維絲很細(xì)，它能承受很高壓力而不需任何支撐物，使得設(shè)備結(jié)構(gòu)大大簡(jiǎn)化。中空纖維的內(nèi)徑一般為0.2

35、mm，表面積與體積的比率極大，所以濾速很高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)操作。中空纖維系統(tǒng)超濾器分外流型和內(nèi)流型兩種（圖3-7）。 超濾系統(tǒng)可以采用間歇操作或連續(xù)操作(圖3-8)。連續(xù)操作的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)品在系統(tǒng)中停留時(shí)間短，這對(duì)熱敏或剪切力敏感的產(chǎn)品是有利的，主要用于大規(guī)模生產(chǎn)。它的主要缺點(diǎn)是在較高的濃度下操作，故通量較低。間歇操作平均通量較高，所需膜面積較小，裝置簡(jiǎn)單，成本也較低，但需要較大的儲(chǔ)槽。 (四)膜的污染與清洗 超濾器的使用性能除了與其工藝參數(shù)有關(guān)外，還與膜的污染程度有關(guān)。膜在使用過(guò)程中，盡管操作條件保持不變，但通量仍逐漸降低的現(xiàn)象稱為膜污染。膜污染的主至原因是顆粒堵塞和膜表面的物理吸附造成。膜的

36、污染被認(rèn)為是超濾過(guò)程中最主要的障礙。1減輕膜污染的方法 (1)預(yù)處理。將料液經(jīng)過(guò)濾器進(jìn)行預(yù)過(guò)濾，以除去較大的粒子，特別對(duì)中空纖維和螺旋卷繞式超濾器尤為重要。蛋白質(zhì)吸附在膜表面上常是形成污染的原因，調(diào)節(jié)料液的pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)可使吸附作用減弱，但如果吸附是由于靜電引力，則應(yīng)調(diào)節(jié)至等電點(diǎn)。另外，鹽類對(duì)污染也有很大影響，pH高時(shí)，鹽類易沉淀；pH低時(shí)，鹽類沉淀較少。加入絡(luò)合劑如EDTA等可防止Ca2+等沉淀。 (2)改變膜的表面性質(zhì)。在膜制備時(shí)，改變膜的表面極性扣電荷，常可減輕污染。可以將膜先用吸附力較強(qiáng)的溶質(zhì)吸附，則膜就不會(huì)兩吸附蛋白質(zhì)，如聚礬膜可用大豆卵磷脂的酒精溶液預(yù)先處理，醋酸纖維膜用陽(yáng)離子表面

37、活性劑處理，可防止污染。 2膜的清洗方法超濾運(yùn)轉(zhuǎn)一段時(shí)間以后，必須對(duì)膜進(jìn)行清洗，除去膜表面聚集物，以恢復(fù)其透過(guò)性。對(duì)膜清洗可用物理法、化學(xué)法，或兩者結(jié)合起來(lái)使用。 (1)物理方法(機(jī)械方法) 是借助于液體流動(dòng)所產(chǎn)生的機(jī)械力將膜面上的污染物沖刷掉。通過(guò)加海綿球、增大流速、逆流(對(duì)中空纖維超濾器)、脈沖流動(dòng)和使用超聲波等方法，可以使膜得以清洗。 (2)化學(xué)方法。物理清洗往往不能把膜面徹底洗凈，這時(shí)可根據(jù)體系的情況適當(dāng)加些化學(xué)藥劑進(jìn)行化學(xué)清洗。 使用起溶解作用的物質(zhì)：如酸、堿、酶(蛋白酶)、螯合劑和表面活性劑等； 使用起氧化作用的物質(zhì)：如過(guò)氧化氫、次氯酸鹽等 使用起滲透作用的物質(zhì)：如磷酸鹽、聚磷酸鹽

38、等。膜清洗后，如暫時(shí)不用，可將其貯存在清水中，并加少量甲醛以防止細(xì)菌的生長(zhǎng)。 第二節(jié) 酶的層析分離技術(shù) 層析分離(也叫色譜分離)是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)(分子的大小、形狀、分子極性、吸附力 、分子親和力和分配系數(shù)等)的不同使各組分在兩相(固定相與流動(dòng)相)中的分布程度不同而使各組分得以分離的方法。 常用的方法有離子交換層析、凝膠層析、親和層析、疏水層析等。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，要根據(jù)酶的不同特性選用適宜的層析方法，或用幾種層析方法配合進(jìn)行酶的分離純化。一、離子交換層析（一）基本原理 離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)對(duì)各種離子的親和力不同，而使溶液中不同溶質(zhì)得以分離的方法。 離于交換劑具

39、有酸件或堿性基團(tuán)，能分別與水溶液中的陽(yáng)離子或陰離子進(jìn)行交換，分別稱為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。 離子交換的過(guò)程可分為五個(gè)步驟： (1)離子向交換劑顆粒表面擴(kuò)散。在均一的溶液中，這個(gè)過(guò)程進(jìn)行得很快。 (2)離子在交換劑顆粒內(nèi)部向它的帶電部分?jǐn)U散。擴(kuò)散的速度取決于交換劑的交聯(lián)度和溶液的濃度。這一步是整個(gè)離子交換過(guò)程中限速的一步。 (3)離子在交換劑的帶電部分進(jìn)行交換。這一步能瞬間發(fā)生且呈平衡關(guān)系。如果是陽(yáng)離子交換劑，(4)被交換的離子通過(guò)交換劑擴(kuò)散到表面。 (5)用洗脫液脫附，被交換的離子擴(kuò)散到周圍的溶液中。(二)離于交換劑的種類 離子交換劑的種類很多。根據(jù)可供交換的離子的性質(zhì)，可分為陽(yáng)離子型和

40、陰離子型。 可以和陰離子交換的交換劑稱為陰離子交換劑；可以和陽(yáng)離子進(jìn)行交換的交換劑稱為陽(yáng)離子交換劑。按酸堿性的強(qiáng)弱，離子交換劑又可分強(qiáng)酸、弱酸型和強(qiáng)堿、弱堿型等多種類型。按其骨架的化學(xué)組成可分為離子交換纖維素、離子交換凝膠和離于交換樹(shù)脂等基本類型。 (三)離子交換層析的基本操作 1交換劑的處理 確定了層析所用的交換劑的類型后，要對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚矸娇墒褂谩Ｌ幚戆ㄒ韵滤牟剑撼ソ粨Q劑中的雜質(zhì)；交換劑的溶脹，使交換劑的帶電基團(tuán)更多地暴露在溶液中；除去交換劑中很小的細(xì)粒，以免影響流速；離子交換劑的平衡離子轉(zhuǎn)變成所需要的形式，即改型。 通常陽(yáng)離子交換劑的處理順序?yàn)閴A洗去離子水酸洗去離子水，而陰離子交

41、換劑的處理順序?yàn)樗嵯慈ルx子水洗堿洗去離子水洗。2裝柱 為了得到成功的分離，裝柱是最關(guān)鍵的一步。裝柱的方式主要用以下兩種：(1)重力裝柱(2)加壓裝柱。3平衡4加樣5洗脫和收集洗脫方式分為階段洗脫和連續(xù)梯度洗脫兩種。 (1)階段洗脫法。又稱逐次洗脫、階梯梯度洗脫法，是指分段逐次改變洗脫液中的pH或鹽濃度，使吸附在柱上的各組分洗脫下來(lái)。它是用幾個(gè)具有定pH和鹽濃度的緩沖液按設(shè)計(jì)好的梯度依次洗脫，從而使混合酶液中幾個(gè)對(duì)交換劑親和力明顯不同的組分分開(kāi)，達(dá)到分離的目的。 (2)連續(xù)梯度洗脫法。又稱線性梯度洗脫法，是通過(guò)連續(xù)改變洗脫液中的pH或鹽濃度，使吸附柱上的各組分被洗脫下來(lái)。通常采用一種低濃度的鹽溶

42、液為起始溶液，另一種高濃度的鹽溶液作為最終溶液。它的分辨率大大超過(guò)分段洗脫。在酶的制備中常用連續(xù)梯度洗脫法，它優(yōu)于階梯梯度洗脫法。6交換劑的再生和貯存 為了使用過(guò)的離子交換劑能再次使用，就需要對(duì)其進(jìn)行再生處理。再生的方法通常是先用0.52mol/L高鹽溶液洗滌。鹽溶液應(yīng)包含有離子交換劑的相反離子。然后，用0.2 mol/L 酸、堿反復(fù)洗滌以除去脂類、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。最后用水洗至中性，就可再次上柱使用。二、凝膠層析 (一)基本原理 凝膠層析又稱分子排阻層析、分子篩層析或凝膠過(guò)濾。它是指混合物隨流動(dòng)相經(jīng)固定相(凝膠)的層析柱時(shí)，混合物中各組分按其分子人小不同而被分離的技術(shù)。(二)凝膠的種類 凝膠的種

43、類很多，常用的有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等。(1)葡聚糖凝膠凝膠顆粒大小一般分為粗、中、細(xì)和超細(xì)四類。顆粒越細(xì)，分離效果越好，因?yàn)樗菀走_(dá)到平衡，但流速慢。顆粒越粗，流速越快，會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，使洗脫峰變得平和寬。在一般柱層析中，使用干顆粒直徑在70 m 左右較合適(2)瓊脂糖凝膠。(3)聚丙烯酰胺凝膠。(三)凝膠特性的參數(shù)用于表示凝膠特性的參數(shù)主要有以下幾項(xiàng)：(1)排阻極限。(2)分級(jí)范圍。(3)水滯流量。(4)凝膠顆粒的大小。(5)床體積。(6)空體積(四)凝膠層析的操作 凝膠居析的基本操作與離子交換層析大致相同。所要注意的事項(xiàng)有以下方面：(1)凝膠的選擇(2)溶膠(3)裝柱(4

44、)加樣(5)洗脫(6)再生與保存(五)凝膠層析的優(yōu)點(diǎn)與用途凝膠層析具有以下優(yōu)點(diǎn)：分離條件溫和，因此不易引起生物樣品的變性失活；每次分離操作之后，層析劑無(wú)須再生就可重復(fù)利用；工作范圍廣，分離的分子質(zhì)量范圍可從幾百到數(shù)百萬(wàn)；設(shè)備簡(jiǎn)單，分離機(jī)理簡(jiǎn)單，易于操作；樣品回收率高，幾乎可達(dá)100。凝膠層析主要有脫鹽與分級(jí)分離兩大用途.三、親和層析 親和層析也稱親和吸附層析，是利用生物活性物質(zhì)之間的專一親和吸附作用而進(jìn)行的層析方法。親和吸附層析原理如圖312所示，大致可分為以下三步：配基固定化：選擇合適的配基與不溶性的支撐載體偶聯(lián)，或共價(jià)結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)；吸附樣品：親和吸附介質(zhì)選擇性吸附酶或其他

45、生物活性物質(zhì)，雜質(zhì)與層析介質(zhì)間沒(méi)有親和作用，故不能被吸附而被洗滌去除；樣品解析：選擇適宜的條件，使被吸附的親和介質(zhì)上的酶或其他生物活性物質(zhì)解吸。 （二）親和吸附介質(zhì)親和層析中常用輔酶、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑等小分子物質(zhì)作為配基。 (三)親和層析的操作 親和層析操作一般分進(jìn)料吸附、雜質(zhì)清洗、目標(biāo)產(chǎn)物洗脫和層析柱再生4個(gè)步驟。 親和層析的洗脫方法有兩種：一種是特異性洗脫，另一種是非特異性洗脫。特異性洗脫是利用含有與親和配基或酶具有結(jié)合作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過(guò)洗脫劑與親和配基或酶的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，使酶脫附。非特異性洗脫是采用較多的洗脫方法，是通過(guò)調(diào)節(jié)洗脫液的pH、離子強(qiáng)度、離子種類或溫度來(lái)使被吸附的大

46、分子構(gòu)象有所改變，從而降低了酶與固相配基之間的親和力。 在酶的親和層析過(guò)程中，為了防止酶變性失活，親和層析劑免受損害，一般應(yīng)在低溫(010)的條件下進(jìn)行操作。 四、疏水層析 疏水層祈也叫疏水親和吸附層析，是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)(疏水性配基)的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水件性相互作用的差別進(jìn)行分離純化的層析技術(shù)。 （二）疏水性吸附劑 各種凝膠過(guò)濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。常用的疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基(C3C8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。(三)疏水層析的操作疏水層析的基本操作與其他層析大致相同。所要注意的事項(xiàng)有以下方面：、層析柱的制備2

47、平衡3加樣與洗脫4再生第三節(jié) 酶的電泳分離技術(shù)利用電泳技術(shù)可對(duì)酶進(jìn)行分離、純化。 電泳的方法多種多樣，根據(jù)所用支持物的不同，可以分為紙電泳、薄層電泳、薄膜電泳、凝膠電泳、等電聚焦電泳等。 現(xiàn)主要針對(duì)酶工程領(lǐng)域個(gè)采用較多的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和等電聚焦電泳兩種電泳技術(shù)。凝膠電泳是以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支持體的電泳技術(shù)。凝膠電泳與其他電泳的主要區(qū)別在于凝膠電泳同時(shí)具有電泳和分子篩的雙重作用，具有很高的分辨力。 凝膠電泳的支持體主要有聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在酶學(xué)領(lǐng)域中，最常用的是聚丙烯酰胺凝膠。不連續(xù)電泳系統(tǒng)存在4個(gè)不連續(xù)性：凝膠層的不連續(xù)性；緩沖液離子成分的不連續(xù)性；p

48、H的不連續(xù)性；電位梯度的不連續(xù)性。 由于上述4種不連續(xù)性，電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生3種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)以及凝膠的分子篩效應(yīng)。 (1)濃縮效應(yīng)。(2)電荷效應(yīng)。(3)分子篩效應(yīng)。(二)影響凝膠聚合的因素 聚丙烯酰胺凝膠是電泳支持介質(zhì)，其質(zhì)量直接影響分離效果。影響聚丙烯酰胺凝膠聚合的因素有以下方面。 1試劑質(zhì)量 2凝膠濃度 3溫度和氧氣的影響（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)與用途 以聚丙烯酰胺凝膠為支持介質(zhì)進(jìn)行電泳，可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小及電荷多少來(lái)有效地分離酶和其他蛋白質(zhì)。與其他凝膠相比，聚丙烯酰胺凝膠具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)電滲作用比較小，樣品分離重復(fù)性好。 (2)凝膠孔徑可調(diào)。(3)電泳

49、分辨率高。(4)化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性好。(5)機(jī)械強(qiáng)度高，透明有彈性。PAGE應(yīng)用廣泛，可用于酶、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離純化、少量的制備及定性、定量檢測(cè)，還可用于其分子量、等電點(diǎn)的測(cè)定等。 需要指出的是，生化實(shí)驗(yàn)室中的常用的板式凝膠電泳裝置的處理量很小，不適于分離制備。 二、等點(diǎn)聚焦 等電聚焦電泳利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子等電點(diǎn)的不同，在一個(gè)穩(wěn)定、連續(xù)的線性梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離。等電點(diǎn)聚焦電泳的操作過(guò)程(1)pH梯度支持介質(zhì)的制備(2)電泳(3)分離組分的檢測(cè)(五)等電點(diǎn)聚焦電泳的特點(diǎn) 等電點(diǎn)聚焦電泳具有以下顯著的特點(diǎn)：(1)具有很高的分辨率。能將等電點(diǎn)僅相差0.010.02pH單

50、位的酶或蛋白質(zhì)分開(kāi)。(2)顯現(xiàn)的區(qū)帶窄。一般電泳由于受擴(kuò)散作用的影響，隨著時(shí)間和泳動(dòng)距離加長(zhǎng)，區(qū)帶越走越寬，而等電點(diǎn)聚焦能抵消擴(kuò)散作用，使區(qū)帶越走越窄(3)聚焦力強(qiáng)。不管樣品混合液加在電泳系統(tǒng)的什么部位，由于電聚焦作用，各組分都可聚焦到其等電點(diǎn)位置，很稀的樣品也可進(jìn)行分離。(4)可直接并準(zhǔn)確測(cè)出等電點(diǎn)。其精確度可達(dá)0.01pH單位。等電點(diǎn)聚焦電泳也存在一些缺點(diǎn)： (1)要求用無(wú)鹽溶液，而在無(wú)鹽溶液中有些酶和蛋白質(zhì)可能會(huì)發(fā)生沉淀。 (2)電泳后樣品中的各組分都聚焦于其等電點(diǎn)，不適用在等電點(diǎn)發(fā)生變性的某些酶蛋白質(zhì)。 (3)載體兩性電解質(zhì)對(duì)產(chǎn)品會(huì)產(chǎn)生一定的污染。第四節(jié) 酶的結(jié)晶技術(shù)一、鹽析結(jié)晶法 鹽

51、析結(jié)晶是指在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H等條件下，于接近飽和的酶液中緩慢增加某種濃度的個(gè)性鹽，使酶的溶解度慢慢降低，達(dá)到稍微過(guò)飽和狀態(tài)，而析出酶晶體的過(guò)程。二、有機(jī)溶劑結(jié)晶法有機(jī)溶劑結(jié)晶是在接近飽和的酶液中慢慢加入某種有機(jī)溶劑，使酶的溶解度降低，而析出酶晶體的過(guò)程。三、透析平衡結(jié)晶法 透析平衡結(jié)晶是將酶液裝進(jìn)透析袋，對(duì)一定濃度的鹽溶液進(jìn)行透析，使酶液逐步達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)而析出結(jié)晶的過(guò)程。四、等電點(diǎn)結(jié)晶法 等電點(diǎn)結(jié)晶是通過(guò)緩慢改變濃酶液的pH，使之逐漸達(dá)到酶的等電點(diǎn)，而使酶析出結(jié)晶的過(guò)程。第四章 酶制劑工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)例第一節(jié) 淀粉酶類的生產(chǎn) 淀粉酶屬于于水解酶類，是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷水解的一類酶的統(tǒng)稱。

52、此類酶廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物中，幾乎所有動(dòng)物、植物和微生物都含有淀粉酶。它是研究較多、生產(chǎn)最早、產(chǎn)量最大和應(yīng)用最廣泛的一類酶。按照水解淀粉的方式不同，主要的淀粉酶有: a-淀粉酶、b-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脫支酶、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶等。 a-淀粉酶可由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，也可從植物和動(dòng)物中提取。目前，工業(yè)生產(chǎn)上都以微生物發(fā)酵法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)a-淀粉酶。有實(shí)用價(jià)值的a-淀粉酶產(chǎn)生菌有：枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、凝聚芽抱桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、米曲霉、黑曲霉、擬內(nèi)孢霉等。不同菌株所產(chǎn)a-淀粉酶在耐熱，耐酸堿、耐鹽等方面各有差別。其中，最適反應(yīng)溫度在60以上的命名為中

53、溫型a-淀粉酶；最適反應(yīng)溫度在90以上的命名為高溫a-淀粉酶；最適反應(yīng)pH5的為酸性a-淀粉酶；最適反應(yīng)pH9的為堿性a-淀粉酶。 二) a-淀粉酶的生產(chǎn) 微生物隊(duì)a-淀粉酶可以用固體培養(yǎng)，也可用液體深層培養(yǎng)法生產(chǎn)?，F(xiàn)以枯草桿菌B.S.209誘變菌株B.S.796生產(chǎn)a-淀粉酶為例加以介紹。 1固體培養(yǎng)枯草桿菌JD-32生產(chǎn)法(2)操作要點(diǎn) 培養(yǎng)基的配制 斜面培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基 培養(yǎng)方法 斜面培養(yǎng)：從保藏斜面上挑取環(huán)菌體接到試管斜面培養(yǎng)基上，在35培養(yǎng)48h。 種子培養(yǎng)：從活化斜面上桃取一環(huán)菌體接到搖瓶種子培養(yǎng)基中，35搖瓶培養(yǎng)一段時(shí)間后，用發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)。 厚層通風(fēng)發(fā)酵：發(fā)酵培養(yǎng)

54、基冷卻到3840接入0.5種子，在厚層通風(fēng)培養(yǎng)室內(nèi)3841培養(yǎng)20 h左右出曲風(fēng)干。提取 麩曲用1食鹽水浸泡3h(用量34倍)，然后過(guò)濾，調(diào)節(jié)濾液pH 5.56.0，加入10的酒精使終濃度為70沉淀酶，沉淀經(jīng)離心，濃酒精洗滌脫水后，25下風(fēng)干粉碎即為成品。 2. 液體深層培養(yǎng)枯草桿菌B.S.209誘變菌株B.S.796生產(chǎn)法 目前，我國(guó)液體深層發(fā)酵生a-淀粉酶的菌株主要是枯草桿菌BF7658的突變菌株，如B.S.209、8a5、86315、K22、B. S.796等。下面以B.S.209誘變菌株B.S.796生產(chǎn)法為例進(jìn)行介紹。（1）工藝流程見(jiàn)圖5-32)操作要點(diǎn)搖瓶種子培養(yǎng) 500m1三角瓶?jī)?nèi)裝發(fā)酵培養(yǎng)基50 m1，其組成為麥芽糖6、豆粕水解液6、Na2HP0412H20 0.8、(NH4)2SO4 0.4、CaCl2 0.2、NH4C1 0.15，pH 6.57.0，接種后置旋轉(zhuǎn)式搖床上，(37±1)下培養(yǎng)28h左右備用。種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)采用130 L夾套標(biāo)準(zhǔn)式培養(yǎng)罐，轉(zhuǎn)速360r/min，37培