G418篩選細(xì)胞(整合版)

1、G418篩選細(xì)胞G418簡介：G418是一種氨基糖苷類抗生素，在分子遺傳試驗中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性 篩選試劑。白色粉末，融點138144C，溶于水、甲醇。 CAS No.: 108321-42-2分子式：C20H40N4010?2H2S（分子量：692.71儲運(yùn)室溫下運(yùn)輸，干粉在室溫下儲存，溶液于-20°C儲存。G418工作原理：它通過抑制轉(zhuǎn)座子Tn601,Tn5的基因，干擾80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成， 對原核和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動物細(xì)胞，也包括 原生動物和蠕蟲。細(xì)菌Tn5轉(zhuǎn)座子序列（neo抗性基因）攜帶的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將G418轉(zhuǎn)變成無

2、毒形式。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后，則能啟動 neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效 表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有 G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。利用G418篩選細(xì)胞：1、準(zhǔn)備工作在篩選之前，一定要確定你的細(xì)胞對這一批G418的最佳篩選濃度。每種細(xì)胞對G418的敏感性不同，一般變動在 100ug/ml1000ug/ml范圍。分子克隆給岀的幾個常用細(xì)胞系所需G418最佳用量：細(xì)胞系或機(jī)體G418 濃度（ug/ml ）中國倉鼠卵巢細(xì)胞700800Madi n-Darby 犬腎細(xì)胞500人上皮A431細(xì)胞400猿CV-1細(xì)胞500盤基網(wǎng)柄菌屬

3、1035植物10酵母1255002、確定最佳篩選濃度最適用量通過建立細(xì)胞死亡曲線獲得 將細(xì)胞稀釋至1000cell/ml，每孔100ul加入有培養(yǎng)基的24孔板 G418濃度稀釋至 0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml等 12 個級別 , 培養(yǎng) 10-14 天，以細(xì)胞全部死亡最低濃度為基準(zhǔn)，一般 400-800 左右。 篩選時比該濃度再高一個級別， 維持時 使用篩選濃度的一半即可。匯合度對G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50%3、加藥時間 一般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加G418篩選（由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后

4、要 一段時間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。 所以篩選不能太早； 但是也不能太晚， 因為轉(zhuǎn)染了 外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大， 增殖較慢， 時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的 細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克?。?。 每35d更換一次含有G418的篩選液（因為隨著細(xì)胞的代謝 G418的濃度和活 性都會下降），這時藥物濃度可以降至 200ug/ml。4、培養(yǎng)液的使用加藥篩選約 6 天左右，細(xì)胞會大量死亡： 非選擇性死亡：死亡的細(xì)胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽 性細(xì)胞死亡。 陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡： 孔中細(xì)胞數(shù)目很少， 細(xì)胞之間的信號會變得很 弱，導(dǎo)致陽性細(xì)胞死亡這個時候需要一種 特殊的培養(yǎng)

5、液 ：轉(zhuǎn)染前，在細(xì)胞匯合度達(dá)到 80%的時候，換液， 培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按 1： 1 混合備用。 再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。5、挑選單克隆的優(yōu)化（篩選陽性克?。┠康模?盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響； 增加陽性克隆的得率。方法：加藥后，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽性克隆下用 記號筆做個標(biāo)記。之后： 套環(huán)法（結(jié)合有限稀釋法）：用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白 酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個新的孔中培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把 陽性克隆在 96孔板中篩選。 刮除法（結(jié)合有限稀釋法）：刮除陰性克隆，消化陽性克

6、隆后繼續(xù)篩選 培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在 96 孔板中篩選。6、鑒定之后一般經(jīng)過 4 周左右的篩選， 得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。 但是外源基因如果沒有 整合到基因組中的話， 目的基因還是很容易丟失的。 但是外源基因整合到基因組 中的概率太小了，而且是隨機(jī)整合，會導(dǎo)致表達(dá)的目的蛋白的量產(chǎn)生很大差異。 隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)， 那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達(dá)目的基因的細(xì)胞會 占據(jù)優(yōu)勢， 強(qiáng)表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞會越來越少。 這樣再次篩選是必不可少的 。只 有經(jīng)過 2次以上的篩選 之后才能找到那種我們想要的強(qiáng)分泌目的蛋白的， 遺傳穩(wěn) 定的細(xì)胞克隆。細(xì)胞克隆 有限稀釋法有限稀釋法采用 梯變倍數(shù)稀

7、釋 的原則，將稀釋的細(xì)胞懸液接種于微孔培養(yǎng)板中 （也可在板上的 96 孔中直接稀釋）培養(yǎng)一定時間后，孔中可出現(xiàn)單個細(xì)胞克隆。 本法不需特殊設(shè)備， 操作簡單快速， 適合大大批量克隆化培養(yǎng)。 現(xiàn)已廣泛用于異 質(zhì)性細(xì)胞系的克隆化培養(yǎng)、 誘導(dǎo)和分離， 如耐藥性細(xì)胞株或高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株或突 變細(xì)胞株以及單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的克隆篩選中。取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液 （貼壁細(xì)胞用 0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制 成），經(jīng)臺盼藍(lán)染色計數(shù)，測定活細(xì)胞數(shù)及濃度（細(xì)胞存活率及單個細(xì)胞百分率 應(yīng)高于 90%以上）。 將細(xì)胞懸液在試管中稀釋，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至 50個/ml、10個/ml、5個 /ml，將3種稀釋度的細(xì)胞分別接種于 96孔板中，每孔100卩,1于37C、5%CO2 下培養(yǎng)。 次日在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞數(shù)，挑選只含一個細(xì)胞的孔， 做好標(biāo)記并補(bǔ)加