gpd的臨床生化化學(xué)檢測(cè)

1、1會(huì)計(jì)學(xué)gpd的臨床生化化學(xué)檢測(cè)的臨床生化化學(xué)檢測(cè)一、一、G6PD與與G6PD缺乏癥缺乏癥1、什么是、什么是G6PD？ G6PD是葡萄糖葡萄糖6磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶的簡(jiǎn)稱，是一種存在于人體紅細(xì)胞內(nèi)，協(xié)助葡萄糖進(jìn)行新陳代謝的一種重要的酶類，在這代謝過程中會(huì)產(chǎn)生NADPH（還原型輔酶）的物質(zhì)能以保護(hù)紅細(xì)胞免受氧化物質(zhì)的威脅。 G6PD缺乏時(shí)，若身體接觸到具氧化性的特定物質(zhì)或服用了這類藥物，紅血球就容易被破壞而發(fā)生急性溶血反應(yīng)。G6PD 對(duì)于磷酸戊糖旁路至關(guān)重要，而該途徑可為髓鞘脂酸形成提供 NADPH 。2、什么是什么是G6PD缺乏癥？缺乏癥？ G6PD缺乏癥缺乏癥是由G6PD基因突變，導(dǎo)致該酶活

2、性降低，紅細(xì)胞因?yàn)槿狈ADPH而不能抵抗氧化損傷而遭受破壞，引起溶血性貧血的一種遺傳病。常因食用蠶豆而發(fā)病，俗稱“蠶豆病”。二、二、G6PD的發(fā)病機(jī)制的發(fā)病機(jī)制葡萄糖的代謝途徑，主要是糖酵解進(jìn)入三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生ATP，次要途徑是磷酸戊糖途經(jīng)，產(chǎn)生NADPH和磷酸核糖。二、二、G6PD的發(fā)病機(jī)制的發(fā)病機(jī)制磷酸戊糖途經(jīng)磷酸戊糖途經(jīng)G6PDG6P 6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)脂+NADPHG6PD谷胱甘肽還原型+氧化性物質(zhì) 谷胱甘肽氧化型 NADPH在紅細(xì)胞內(nèi)，谷胱甘肽還原型可以抵抗氧化性的物質(zhì)，在維持紅細(xì)胞的細(xì)胞膜穩(wěn)定方面起到重要作用，如果G6PD缺乏導(dǎo)致NADPH不足，谷胱甘肽的作用降低，從而使紅細(xì)胞模

3、受損，在一定條件下容易產(chǎn)生紅細(xì)溶血，引起一些不良癥狀。三、三、G6PD的流行病學(xué)與遺傳規(guī)律的流行病學(xué)與遺傳規(guī)律1、G6PD流行病學(xué)流行病學(xué) 據(jù)估計(jì), 全球約有4億人受累, 我國(guó)華南及西南各省較常見, 主要分布在熱帶和亞熱帶, 我國(guó)的南方地區(qū)是高發(fā)區(qū),尤其是廣西、廣東、云南、福建等省, 北方地區(qū)較少見。我國(guó)各地發(fā)生率報(bào)道不一,上海為0.78%、長(zhǎng)沙0.90%、南昌為1.20%、南寧南寧為7.20%、昆明為2.50%。此病廣東地區(qū)平均發(fā)病率為5% 10%, 廣州市為3.70%、東莞3.20%、深圳2.30%, 中山發(fā)生率4.20%。2、G6PD的遺傳規(guī)律的遺傳規(guī)律G6PD缺乏程度與性別的關(guān)系，G6

4、PD缺乏是伴伴X不完全顯性遺傳不完全顯性遺傳,基因位于X染色體上。 缺失：缺失： 男性只有一條X染色體, 一旦這唯一的染色體缺失G6PD基因, 則表現(xiàn)為G6PD重度缺乏, 而女性有兩條X染色體, 如果僅有1條X染色體缺失G6PD基因, 則為雜合子, 表現(xiàn)為中度缺乏, 只有兩條X染色體均缺G6PD基因才表現(xiàn)為重度缺乏。 基因突變：基因突變：不同的基因突變類型，可以導(dǎo)致G6PD結(jié)構(gòu)不一樣，酶活性有差異，即使G6PD基因沒有缺失，也有可能存在不同程度缺乏。四、四、G6PD臨床生物化學(xué)檢測(cè)臨床生物化學(xué)檢測(cè)1、G6PD檢測(cè)的臨床意義檢測(cè)的臨床意義紅細(xì)胞G6PD 催化反應(yīng)生成的NADPH 是谷胱甘肽還原酶

5、的輔酶，還原型谷胱甘肽(GSH) 是保持血紅蛋白穩(wěn)定性及紅細(xì)胞膜完整性的必要條件。紅細(xì)胞G6PD 缺乏者，在服用某些藥物(如抗在藥、酬類藥、伯氨哇附中、磺膠等)及食用蠶豆后，代謝產(chǎn)生的氧自由基，或與氧合血紅蛋白作用形成的H2O2使GSH 氧化成的琉基失去GSH 的保護(hù)，被氧化變性形成Heinz 小體。紅細(xì)胞膜失去疏基保護(hù)而功能受損，導(dǎo)致溶血。所以檢測(cè)患者G6PD，可以對(duì)多種溶血性病進(jìn)行早期診斷和早期預(yù)防。適用人群適用人群：新生兒及其父母：可以早期篩查新生兒是否缺乏G6PD，了解家庭遺傳方式?；闄z：分析后代可能缺乏G6PD的概率。溶血性疾病患者：鑒別和分析溶血性病類型和原因，有利于臨床采取適當(dāng)治

6、療措施和藥物治療。2、G6PD的檢測(cè)方法的檢測(cè)方法 2.1 比色法（生化儀）比色法（生化儀）G6PD 活性校正值測(cè)定活性校正值測(cè)定原理：原理：紅細(xì)胞G6PD 催化G6P 生成6-磷酸葡萄糖內(nèi)脂，后者很快氧化成6-磷酸萄糖酸(6-PGA) ，同時(shí)NADP 被還原成NADPH 。在340 nm 處監(jiān)視NADPH 吸光度的升高，計(jì)算酶的活性。紅細(xì)胞中還含有6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶( 6PGD)，催化6-PGA 脫羧，生成核酮體糖-5-磷酸，同時(shí)使輔酶NADP 還原成NADPH。在本測(cè)定系統(tǒng)中，由6-PGA和G6 P 組成的底物系統(tǒng)，測(cè)得的酶活性，減去單獨(dú)以6-PGA 為底物時(shí)測(cè)得的酶活性，代表真正G-

7、6-PD 的活性。本法測(cè)定包含如下2 個(gè)反應(yīng)式:（1）G6P+ NADP+ 6PGA+NADPH+H+ (2) 6PGA+NADP+ R-5-P+NADPH+H+CO2 G6PD6-PGD血紅蛋白測(cè)定血紅蛋白測(cè)定氰化高鐵血紅蛋白測(cè)定法氰化高鐵血紅蛋白測(cè)定法原理：原理： 血液在Hb轉(zhuǎn)化液中溶血后，除SHb外各種Hb均可被高鐵氰化鉀氧化為高鐵Hb再與CN-結(jié)合生成穩(wěn)定的棕紅色氰化高鐵Hb。HiCN最大波峰在540nm,最小吸收峰為504nm。特定標(biāo)準(zhǔn)條件下，毫摩爾消光系數(shù)為44Lmmol1cm。因此，根據(jù)標(biāo)本的吸光度，即可測(cè)定Hb濃度。 HiCN 試劑試劑:氰化鉀(KCN)高鐵氰化鉀無(wú)水磷酸二氫鉀

8、特別提醒：該法是測(cè)定血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是試劑中含有氰化鉀劇毒物，特別提醒：該法是測(cè)定血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是試劑中含有氰化鉀劇毒物，操作時(shí)必須小心。實(shí)驗(yàn)后的廢液也要小心處理。操作時(shí)必須小心。實(shí)驗(yàn)后的廢液也要小心處理。G6PD活力計(jì)算：活力計(jì)算： G6PD=(G6PD+6PGD )6PGD (U/L) G-6-PD , U/g Hb= G6PD/Hb意義：每克血紅蛋白中G6PD的活性參考值：參考值： 健康成年人，紅細(xì)胞G6PD 活性(己校正6-PGD) 8.341.59 U/g Hb 紅細(xì)胞活6PGD性為6.8 - 12.0U/g Hb注意一：注意一：NADPH比值法或比值法或G6PD/6G

9、PD法，在上面基礎(chǔ)上不采用兩個(gè)指標(biāo)相法，在上面基礎(chǔ)上不采用兩個(gè)指標(biāo)相減，而是相除，原理是減，而是相除，原理是6GPD尚未報(bào)道在尚未報(bào)道在G6PD患者和正常人之間有差異，通患者和正常人之間有差異，通過比值法篩查，一定程度上可以確認(rèn)女性雜合子，也就是過比值法篩查，一定程度上可以確認(rèn)女性雜合子，也就是G6PD基因缺陷攜基因缺陷攜帶者。此法受到一些試劑廠家和醫(yī)院青睞。帶者。此法受到一些試劑廠家和醫(yī)院青睞。G6PD 活性直接測(cè)定法活性直接測(cè)定法 G6PD 活性校正值測(cè)定雖然能提供G6PD 活性真值和6GPD的活性，但在溶血性疾病的檢查中尚未發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞6PGD活性正常而掩蓋G6PD活性缺乏的現(xiàn)象。因此，就

10、臨床使用而言，G6PD活性的的簡(jiǎn)易測(cè)定法己能滿足臨床。原理：原理：G6P+ NADP+ 6PGA+NADPH+H+ 在波長(zhǎng)340 nm 處監(jiān)測(cè)NADPH 的吸光度增高，計(jì)算G6PD活性。活性計(jì)算：活性計(jì)算： G-6-PD , U/g Hb= G6PD/Hb參考值：參考值：健康成年人，紅細(xì)胞G6PD 活性為8 -18 U/g Hb 。注意：醫(yī)院可以根據(jù)需要決定是否需要注意：醫(yī)院可以根據(jù)需要決定是否需要6PGD校正。校正。 G6PD其他方法：其他方法：2.2高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn):2.3免疫斑點(diǎn)雜交法：免疫斑點(diǎn)雜交法：G6PD活性測(cè)定注意事項(xiàng)活性測(cè)定注意事項(xiàng)： 1、Mg2+是G6

11、PD的激活劑，銅離子和鋅離子有輕度抑制作用，汞離子和對(duì)氯汞苯甲酸有完全抑制作用，因此日常使用中盡量避免抑制劑的污染。 2、避免樣本溶血，樣本溶血后G6PD活性不穩(wěn)定，影響其活性測(cè)定。溶血后活性降低很快，25min內(nèi)需要及時(shí)測(cè)定。五、華南常見五、華南常見G6PD試劑盒概況試劑盒概況 目前，市場(chǎng)常見的生化儀比色試劑盒分為兩種方法，一是G6PD直接測(cè)定法（速率法），直接測(cè)量G6PD活性，二是NADPH比值法，測(cè)定G6PD/6PGD。有的試劑盒提供血紅蛋白測(cè)定試劑，多數(shù)沒有提供血紅蛋白測(cè)試試劑。 G6PD直接測(cè)定法的廠家有：直接測(cè)定法的廠家有： 寧波美康、北京利德曼、上海執(zhí)成、長(zhǎng)春匯力、廣州科方 參考

12、值：成人參考值：成人1300-3600U/L 兒童兒童1700-4000U/L NADPH比值法的廠家有：比值法的廠家有： 廣州科方、廣州米基 參考值：成人參考值：成人G6PD/6PGD 1.0-2.3（0.95-1.05為可疑，建議復(fù)查）為可疑，建議復(fù)查） 新生兒（臍帶血、靜脈血）新生兒（臍帶血、靜脈血）1.1-2.5（1.05-2.05為可疑，建議復(fù)查）為可疑，建議復(fù)查）不同廠家試劑盒比較不同廠家試劑盒比較1、底物方面：、底物方面：長(zhǎng)春匯力說明書反應(yīng)底物為G6PDNa2外，其它廠家為G6P，但是實(shí)際上兩者是同一物質(zhì)的不同叫法。2、樣本類型、樣本類型：寧波美康、上海執(zhí)成、北京利德曼采用壓積紅

13、細(xì)胞，長(zhǎng)春匯力、廣州科方、廣州米基可以采用全血、臍帶血，長(zhǎng)春匯力還可以采用末梢血。3、參考值方面：、參考值方面： G6PD直接測(cè)定法一般為成人成人1300-3600U/L 兒童兒童1700-4000U/L NADPH比值法成人成人G6PD/6PGD 1.0-2.3（0.95-1.05為可疑，建議復(fù)查）為可疑，建議復(fù)查） 新生兒（臍帶血、靜脈血）新生兒（臍帶血、靜脈血）1.1-2.5（1.05-2.05為可疑，建議復(fù)查）為可疑，建議復(fù)查）長(zhǎng)春匯力與以上有所區(qū)別，具體如下：全血G6PD: 638-1980U/L 4.2-14.5U/gHb臍帶血或末梢血G6PD：832-2460U/L 4.9-14

14、.5U/gHb血清G6PD：0-5U/L北京利德曼對(duì)參考值也規(guī)定的比較細(xì):EDTA抗凝血：1300U/L以上正常，600-1300U/L可疑，需要血紅蛋白校正。肝素抗凝血： 1100U/L以上正常，500-1100U/L可疑，需要血紅蛋白校正。每克血紅蛋白中G6PD活性： 3.8U/gHb4、G6PD活性校正活性校正：G6PD活性測(cè)定與血紅蛋白含量和紅細(xì)胞老幼有關(guān)，因此正確的做法是與血紅蛋白求比值來校正，長(zhǎng)春匯力提供血紅蛋白試劑校正，其他均無(wú)此試劑。由于血紅蛋白測(cè)定有劇毒試劑以及占用通道和試劑，一般都不測(cè)定。G6PD/6PGD在篩查基因突變雜合子方面比較有優(yōu)勢(shì)，其他廠家沒有5、美康、美康G6P

15、D測(cè)定副波長(zhǎng)為測(cè)定副波長(zhǎng)為660nm，其他為，其他為405nm。六、美康六、美康G6PD調(diào)試經(jīng)驗(yàn)調(diào)試經(jīng)驗(yàn)1、參數(shù)按照說明書，定標(biāo)方式有因子法，兩點(diǎn)定標(biāo)。試劑盒自帶定標(biāo)液，配有兩個(gè)水平質(zhì)控。定標(biāo)液定出K因子為230000左右，與理論因子209084偏高10%，兩種方法做兩個(gè)水平質(zhì)控都比較好。2、個(gè)別標(biāo)本出負(fù)數(shù)。解決方案：有案例表明把副波長(zhǎng)改成405可以解決負(fù)數(shù)問題。七、案例分享七、案例分享案例：案例： 本人堂哥的兒子四歲，出生檢測(cè)G6PD屬于缺乏患者，其父母檢測(cè)均正常，今年曾經(jīng)得過嚴(yán)重小兒肺炎，經(jīng)合理治療好轉(zhuǎn)。分析分析：因?yàn)樾『⑹荊6PD缺乏癥患者，母親和父親正常，遺傳規(guī)律如下生男孩得病概率1/2，女兒1/2是攜帶者。看病時(shí)，向醫(yī)生說明小孩是G6PD缺乏者，醫(yī)生使用藥物時(shí)避免開了一些不良藥物。磷酸戊糖途經(jīng)G6PDG6P 6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)脂+NADPHG6PD2、G6PD的檢測(cè)方法的檢測(cè)方法 2.1 比色法（生化儀）比色法（生化儀）G6PD 活性校正值測(cè)定活性校正值測(cè)定原理：原理：紅細(xì)胞G6PD 催化G6P 生成6-磷酸葡萄糖內(nèi)脂，后者很快氧化成6-磷酸萄糖酸(6-PGA) ，同時(shí)NADP 被還原成NADPH 。在340 nm