金屬離子對柔紅霉素與人血清白蛋白相互作用的影響.doc

1、金屬離子對柔紅霉素與人血清白蛋白相互作用的影響華南農(nóng)業(yè)大學 理學院 06應用化學 陳偉銳 38634877南農(nóng)業(yè)大學 理學院 06應用化學 林謀宏 38634877南農(nóng)業(yè)大學 理學院 06應用化學 謝哲銘 38634877 要柔紅霉素是蒽環(huán)類抗生素，是治療急性白血病的首選藥，也用于治療各種癌癥。本實驗采用平衡透析法，結(jié)合紫外可見光分光光譜法研究柔紅霉素與人血清白蛋白（）的相互作用。根據(jù)Langmuir等溫吸附方程，得到柔紅霉素與的結(jié)合常數(shù)。在此基礎(chǔ)上，考慮不同金屬離子的作用下，柔紅霉素與結(jié)合的變化，通過數(shù)學模型研究金

2、屬離子對藥物與蛋白作用過程中的影響。本實驗在綜合文獻方法和結(jié)合實驗條件的基礎(chǔ)上,對藥物小分子與人血清白蛋白相互作用進行探討，并對生理條件下金屬離子與藥物作用機理進行研究，能夠?qū)λ幬锷a(chǎn)起到一定的作用。關(guān)鍵詞 柔紅霉素 人血清白蛋白 平衡透析 可見光吸收1 前言研究藥物分子與蛋白質(zhì)的作用，對理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及闡明藥物動力學、耐藥性和毒副作用的機理有著重要的意義。隨著科學的進步和技術(shù)方法的發(fā)展，這方面的研究內(nèi)容也在不斷深入。蛋白質(zhì)分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸殘基都具有特殊的光學活性。許多藥物分子本身也具有光學活性,或與蛋白質(zhì)分子結(jié)合后產(chǎn)生光學活性，因此用光譜方法通過蛋白質(zhì)分

3、子結(jié)合藥物分子后結(jié)構(gòu)的變化研究結(jié)合機理，是有效和廣泛的方法.紫外-可見光譜法也是研究藥物與生物分子相互作用機理最常用、最方便的方法,因為有效藥物與生物分子結(jié)合后，它們的吸收光譜會有一定的改變,出現(xiàn)吸收峰位移或譜峰寬度變化，由此可研究生物分子與藥物間的結(jié)合強弱及結(jié)合機理.柔紅霉素（DNR，結(jié)構(gòu)如圖1所示)作為一種重要的蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素,是目前治療急性淋巴細胞性白血病和急性粒細胞性白血病的首選藥,但長期使用這類藥物使心肌肌原纖維失去肌球蛋白，引起不可逆的心力衰竭，限制了它在化療中的廣泛應用。因此,有關(guān)DNR心臟毒性的基礎(chǔ)與臨床研究成為重要的課題。對柔紅霉素與血清白蛋白的圖1反應和測定進行研究具有

4、非常重要的現(xiàn)實意義。本實驗采用平衡透析法，以紫外可見光分光光譜法研究柔紅霉素與人血清白蛋白(）的相互作用。根據(jù)Langmuir等溫吸附方程，得到柔紅霉素與的結(jié)合常數(shù)。同時，考慮不同金屬離子的作用下，柔紅霉素與結(jié)合的變化,通過數(shù)學模型研究金屬離子對藥物與蛋白作用過程中的影響。以此來研究柔紅霉素與的反應及其作用規(guī)律,為了解柔紅霉素的人體作用機理和藥物生產(chǎn)改進提供了實驗依據(jù)。2 實驗目的（1) 探究平衡透析與紫外分光法相結(jié)合研究藥物小分子與HAS相互作用的方法；（2） 綜合文獻方法，進一步研究不同數(shù)學模型對實驗數(shù)據(jù)的處理方法；（3) 研究柔紅霉素與的相互作用，探討不同金屬離子的存在對其藥效的影響,為

5、了解其作用機理并改進生產(chǎn)工藝提供實驗依據(jù)。3 實驗原理3。1平衡透析法的實驗原理平衡透析法是利用與血漿蛋白結(jié)合的藥物不能透過半透膜的特性進行測定的。此方法是將血清白蛋白置于透析袋內(nèi)，將透析袋置于裝有緩沖液的容器中。本實驗采用的透析袋容許分子量小于14000的物質(zhì)透過，可以讓系統(tǒng)中游離的藥物自然透過,而不能讓蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)透過.實驗中采用離心管作為透析的容器,將透析袋置于離心管中。當達到平衡后，透析袋內(nèi)外游離型藥物濃度相等，而透析袋內(nèi)除含有游離型藥物外，還保留了藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合物（即結(jié)合型藥物）。若已知體系中藥物總量,并且用適當?shù)姆治龇椒y定透析袋內(nèi)藥物總濃度和透析袋外游離型藥物濃度，則可

6、以通過透析袋內(nèi)藥物總濃度與透析袋外游離型藥物濃度之差，計算藥物與血漿蛋白的結(jié)合率。 （1）式中，為透析袋外游離型藥物濃度，為透析袋內(nèi)藥物總濃度。和可以由相應的吸光度通過6.1節(jié)建立的吸光度濃度標準曲線求得。3。2 柔紅霉素含量的測定根據(jù)柔紅霉素的紫外可見光掃描圖可知，柔紅霉素的最大吸收波長在（233±1）nm，（254±1)nm和（499±1)nm,本實驗中柔紅霉素的含量測定方法選擇可見分光光度法，測定波長為499 nm.3.3 根據(jù)Langmuir等溫吸附方程求結(jié)合常數(shù)在透析袋內(nèi)濃度一定時，根據(jù)Langmuir等溫吸附方程，即 (2）其中是結(jié)合率，是結(jié)合常數(shù)，是

7、柔紅霉素的本體濃度.并且 （3)其中，是濃度不同時的柔紅霉素與的結(jié)合量，是在實驗條件下即濃度一定時柔紅霉素與的最大結(jié)合量。因此,聯(lián)合方程（2)和(3)可以得到 （4)進一步變形可以得到 (5)以對作圖并進行擬合，可以計算得到結(jié)合常數(shù)。3。4 金屬離子的影響與柔紅霉素的結(jié)合常數(shù)，也可以通過與柔紅霉素發(fā)生相互作用前后的吸光度值與柔紅霉素濃度之間的關(guān)系求出。 （5)其中和分別為與柔紅霉素發(fā)生相互作用前后的吸光度值，為柔紅霉素的本體濃度，為與柔紅霉素之間的結(jié)合常數(shù).以對作LineweaverBurk雙倒數(shù)曲線圖，通過斜率和可以求得。正常的生理條件下,體內(nèi)Ca2+濃度為2。0×10- 3mol

8、/L，Mg2+濃度為1。2×103mol/L。本實驗模擬正常生理條件下Ca2+ 、Mg2+單獨存在以及兩者同時存在下,對DNR與相互作用的影響。將金屬離子與HSA培育一段時間后,再加入柔紅霉素，記錄吸光度變化.探討金屬離子對藥物與蛋白相互作用的影響。4 實驗設(shè)備電子分析天平，電熱恒溫水浴鍋,紫外可見吸收光譜儀離心管，吸量管,容量瓶,吸耳球，燒杯，玻璃棒,鐵架臺5 實驗材料及試劑柔紅霉素（DNR,純品原料粉末，深圳制藥廠,自備)人血清蛋白（,分子量66478，Sigma公司，自備）磷酸緩沖溶液(PBS, pH=7.4，10mL，自備)CaCl2溶液(0.1mol·L-1，1m

9、L，自備）MgCl2溶液(0。1mol·L-1,1mL，自備)透析袋（14000Da,購自上海生工,自備)所有試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。a.試劑的配制磷酸緩沖溶液（PBS， pH=7.4):由1/15 mol·L-1磷酸二氫鉀、1/15 mol·L1磷酸氫二鈉以及0.1 mol·L-1氯化鉀溶液按一定比例配制于250mL容量瓶中；溶液(200 µmol·L1）：準確稱取粉末0。0133g，以PBS為溶劑，于1mL離心管中配制。CaCl2溶液(0.1mol·L-1):稱取0.0111g無水CaCl2,于1mL離心管

10、中，用蒸餾水溶解。MgCl2溶液(0。1mol·L-1）：稱取0.0095gMgCl2，于1mL離心管中,用蒸餾水溶解。b.材料的處理透析袋使用前在二次蒸餾水中浸泡過夜6 實驗操作步驟6.1 繪制標準曲線 稱取柔紅霉素標準品0。0053g于1mL離心管中,以PBS溶液為溶劑溶解定容1mL，得到濃度為1.0×10-2mol/L柔紅霉素溶液，并依次稀釋，得到濃度分別為5。0×103mol/L、1.0×10-3mol·L1、5。0×10-4mol·L1、1.0×104mol·L-1的標準溶液.并以2mL PBS

11、緩沖溶液為空白對照，在499nm處測定其紫外可見吸光度。以吸光度值為縱坐標，柔紅霉素濃度為橫坐標繪制標準曲線。6。2 柔紅霉素與相互作用的研究向5個透析袋中均加入30µL的200 µmol·L-1 ，然后分別加入15、20、30、50、60 µL 1。0×10-2mol·L-1柔紅霉素溶液后封閉。再把透析袋放入2mL PBS緩沖溶液的離心管中，使之完全浸沒。在37 的水浴中恒溫培養(yǎng)2h,取出,移取100µL透析袋外面溶液于1mL PBS中測定其紫外可見吸光度，繪制紫外可見吸收曲線。6。3 Ca2+ Mg2+對柔紅霉素與相互作

12、用的影響向三個5mL離心管中均加入2mL PBS緩沖溶液，100µL 200 µmol·L1溶液，標記管號,1號管加入0.045mL 0。1mol·L1 CaCl2溶液,2號管加入0.027mL 0.1mol·L-1 MgCl2溶液,3號管同時加入兩種溶液,在37的水浴中恒溫培養(yǎng)30min，測定吸光度,再分別加入100µL 1。0×10-2mol·L-1柔紅霉素溶液，在37的水浴中恒溫培養(yǎng)1.5h。再次測定吸光度。將柔紅霉素溶液的濃度換成同體積5。0×10-3mol/L、1.0×103mol&#

13、183;L-1、5。0×104mol·L1、1.0×104mol·L1的溶液，重復以上步驟。7 結(jié)果及計算7。1 表一 柔紅霉素濃度與吸光度關(guān)系柔紅霉素濃度（mol·L1）499nm處吸光度(nm）空白01。0×1025.0×1031.0×10-35。0×10-41.0×104以吸光度值為縱坐標，柔紅霉素濃度為橫坐標繪制標準曲線。7.2 表二 柔紅霉素濃度與結(jié)合度的關(guān)系柔紅霉素透析袋外透析袋內(nèi)結(jié)合量(mol·L1)體積（µL）濃度（mol·L1）吸光度(nm)濃度(

14、mol·L1)吸光度(nm）濃度(mol·L1)空白-1520305060以對作圖并進行擬合，計算結(jié)合常數(shù)。7.3 表三 Ca2+ Mg2+對柔紅霉素與相互作用的影響DNR濃度（mol·L1）管號恒溫30min后吸光度（nm)恒溫2h后吸光度(nm）（nm）1.0×10-21235。0×1031231。0×10-31235.0×1041231。0×104123以對作圖，通過斜率和計算與柔紅霉素之間的結(jié)合常數(shù).8 注意事項1 為防止污染，透析袋須戴手套取用，使用前要在二次水中浸泡5min；2 平衡透析法透析時間長短和

15、溫度與藥物的擴散速度有關(guān)。應當在正式實驗前進行預試驗來確定，以保證平衡時間足夠（即袋內(nèi)外濃度不再隨時間而改變)。3 在平衡透析法中,藥物有可能與膜發(fā)生結(jié)合。藥物與膜結(jié)合程度取決于藥物的性質(zhì)，當結(jié)合程度高時，會對試驗結(jié)果產(chǎn)生干擾.所以在進行光譜分析時，應設(shè)立空白對照組。9 費用預算人血清白蛋白（HSA) 0.02g（自備) 10元柔紅霉素標準品 0.01g(自備) 5元透析袋(購自上海生工) 10個(自備) 10元其它試劑 5元總計 30元參 考 文 獻1 ChongQiu Jiang， MingXia Gao, Xian-Zhe Meng, Study of the interaction b

16、etween daunorubicin and human serum albumin， and the determination of daunorubicin in blood serum samples， Spectrochimica Acta， 2003, Part A 59:160516102 Fengling Cui, Lixia Qin， Guisheng Zhang， Xiaojun Yao, Beilei Lei， Study of the interaction of aglycon of daunorubicin with human serum albumin by spectroscopy and modeling， Micormolecular Bioscience， 2008， 8：107910893 葉志鈞, 劉英菊， 朱麗. 平衡透