臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)講義

1、第十五章免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)免疫細(xì)胞是指參與機(jī)體免疫應(yīng)答的細(xì)胞，大致可分為兩類，一類能識別特異性抗原，一旦被激活則顯 示出特異性應(yīng)答的功能，主要指淋巴細(xì)胞群， 包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、K細(xì)胞等；另一類能捕獲抗原，處理抗原，以一定方式提呈給淋巴細(xì)胞或表現(xiàn)其他免疫功能，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等。測定這些細(xì)胞功能可以有效評價(jià)機(jī)體特異性和非特異性免疫功能。第一節(jié) 淋巴細(xì)胞的功能檢測淋巴細(xì)胞功能測定可分為體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。體內(nèi)試驗(yàn)主要是進(jìn)行遲發(fā)型超敏反應(yīng)，借此間接了解淋巴細(xì)胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反 應(yīng)；體外試驗(yàn)主要包括淋巴細(xì)胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性

2、試驗(yàn)及淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn) 物的測定。一、T細(xì)胞功能檢測T細(xì)胞具有多種免疫生物學(xué)功能，如直接殺傷靶細(xì)胞、輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，對特異性抗原或絲裂原刺激產(chǎn)生增殖反應(yīng)及產(chǎn)生各種細(xì)胞因子。據(jù)此，建立了一系列檢測T細(xì)胞功能的體內(nèi)和體外試驗(yàn)。（一）T細(xì)胞增殖試驗(yàn)1. 原理：T細(xì)胞在體外受到有絲分裂原或抗原的刺激后，細(xì)胞增殖，并轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞。因此，淋巴 細(xì)胞增殖反應(yīng)又稱淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。2. 刺激物：植物血凝素（PHA、刀豆素 A （ConA）和美洲商陸（PWM、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、 純化蛋白衍生物（PPD和白色念珠菌等。3. 方法學(xué)：檢測T細(xì)胞增殖反應(yīng)的方法有：（1）形態(tài)學(xué)檢查法：運(yùn)用普通光學(xué)顯微

3、鏡，簡便易行。缺點(diǎn)是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易 受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。（2）細(xì)胞免疫水平的常用指標(biāo)，特別是測定腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，常作為判斷預(yù)后和觀察療效的指標(biāo)之一。（四）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)正常機(jī)體對某種特殊抗原建立了細(xì)胞免疫后，如用相同的抗原做皮膚試驗(yàn)，?？沙霈F(xiàn)陽性的遲發(fā)型超 敏反應(yīng)。目前臨床上常用于診斷某些病原微生物感染（結(jié)核、麻風(fēng)等）和細(xì)胞免疫缺陷等疾病，也常用于 觀察細(xì)胞免疫功能在治療過程中的變化及判斷預(yù)后等。 特異性抗原皮膚試驗(yàn)：常用的特異性抗原皮膚試驗(yàn)為結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)。其他皮試抗原還有白色念珠菌素、皮膚毛癬菌素、腮腺炎病毒等。 PHA皮膚試驗(yàn)：將定量PH

4、A注射到受試者前臂皮內(nèi)， 可非特異性刺激 T細(xì)胞發(fā)生母細(xì)胞轉(zhuǎn)化， 呈現(xiàn)以單個(gè)核細(xì)胞浸潤為主的炎性反應(yīng)。PHA皮膚試驗(yàn)敏感性高，比較安全可靠，臨床常用于檢測機(jī)體的細(xì)胞免疫 油鏡下觀察、計(jì)數(shù)，通過計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)來反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能，并通過觀察雞紅細(xì)胞的 消化程度，判斷巨噬細(xì)胞消化功能。濾膜小室法是檢測哪種細(xì)胞趨化運(yùn)動的功能A. 巨噬細(xì)胞B. 中性粒細(xì)胞C. T細(xì)胞D. B細(xì)胞E. 漿細(xì)胞正確答案B答案解析中性粒細(xì)胞 趨化功能檢測方法學(xué)：濾膜滲透法（Boyden小室法）；瓊脂糖平板法。溶血空斑試驗(yàn)檢測的是A. T淋巴細(xì)胞B. 巨噬細(xì)胞C. NK細(xì)胞D. B淋巴細(xì)胞E. LAK細(xì)胞正確答案D

5、答案解析B細(xì)胞功能檢測包括 B細(xì)胞增殖試驗(yàn)和溶血空斑試驗(yàn)。H-TdR摻入法：敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好，但需一定設(shè)備條件，及存在放射性核素污染問 題。（3） MTT比色法：本方法的敏感性雖不及 3H-TdR摻入法，但操作簡便，無放射性污染。較常采用。（二）T細(xì)胞分泌功能測定體外培養(yǎng)的T細(xì)胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后，分泌各種細(xì)胞因子，可借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分 子生物學(xué)技術(shù)通過對于 T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的含量、生物學(xué)活性和基因表達(dá)水平，以反映T細(xì)胞功能。（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)常選用可傳代的已建株的人腫瘤細(xì)胞，與待檢淋巴細(xì)胞混合，觀察腫瘤細(xì)胞殺傷的情況。是評價(jià)機(jī)體B細(xì)胞功能檢測B細(xì)胞主要產(chǎn)

6、生Ig參與機(jī)體體液免疫應(yīng)答，B細(xì)胞功能低下或缺乏者對外源性抗原刺激的應(yīng)答能力減弱或缺陷，特異性抗體產(chǎn)生減少或缺如。因此，B細(xì)胞功能試驗(yàn)方法有受試者血清Ig含量檢測和體外 B細(xì)胞增殖和產(chǎn)生抗體能力檢測等。（一）B細(xì)胞增殖試驗(yàn)：原理與T細(xì)胞增殖試驗(yàn)相同，但刺激物不同，小鼠B細(xì)胞可用細(xì)菌 脂多糖（LPS） 作為刺激物，人則用含 SPA的金黃色葡萄球菌菌體及抗IgM抗體等刺激。（二）溶血空斑試驗(yàn)1. 原理：將SRBC免疫的小鼠脾臟（或家兔淋巴結(jié)）制成單個(gè)細(xì)胞懸液，與SRBC在瓊脂糖凝膠內(nèi)混合后傾注于小平皿或玻片上。脾細(xì)胞中的抗體生成細(xì)胞釋放抗SRBC抗體，使其周圍的 SRBC致敏，在補(bǔ)體參與下可將SR

7、BC溶解，形成肉眼可見的溶血空斑。每一個(gè)空斑中央含一個(gè)抗體形成細(xì)胞，空斑數(shù)目即為抗體形成細(xì)胞數(shù)。空斑大小表示抗體形成細(xì)胞產(chǎn)生抗體的多少。2. 方法學(xué)（1）經(jīng)典溶血空斑形成試驗(yàn)：用于檢測實(shí)驗(yàn)動物抗體形成細(xì)胞的功能?？煞譃橹苯臃ê烷g接法。（2） 被動溶血空斑試驗(yàn)：是指抗體形成細(xì)胞產(chǎn)生的Ig與SRBC上的抗原結(jié)合，在補(bǔ)體參與下出現(xiàn)溶血 反應(yīng)。3臨床應(yīng)用與評價(jià)：溶血空斑試驗(yàn)主要用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響，評價(jià)免疫 治療或免疫重建后機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力。（三）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ ELISPOT1. 原理：用抗原包被固相載體，加入待檢的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，即可誘導(dǎo)抗體的分泌。分泌的抗體與包被 抗

8、原結(jié)合，在抗體分泌細(xì)胞周圍形成抗原抗體復(fù)合物，使細(xì)胞吸附于載體上，加入酶標(biāo)記的第二抗體與細(xì) 胞上的抗體結(jié)合，通過底物顯色反應(yīng)的深淺，可測定出生成的抗體量，并可在鏡下計(jì)數(shù)著色的斑點(diǎn)形成細(xì) 胞。2. 應(yīng)用與方法學(xué)評價(jià)該方法既可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可檢測抗體分泌量。其優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時(shí)檢測不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞。（四）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)B細(xì)胞功能減低或缺陷，可表現(xiàn)為體內(nèi)Ig和血型抗體量下降或缺如。常用于體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、多價(jià)肺炎鏈球菌菌苗等。將適量抗原皮下或肌內(nèi)注射免疫，并于免疫前及免疫后1、2、3周分別采血

9、，分離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價(jià)，判斷受檢者體內(nèi)B細(xì)胞的功能。三、NK細(xì)胞活性測定NK細(xì)胞具有ADCC能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，故將單個(gè)核細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞存活率低，NK細(xì)胞的活性則高。測定人NK細(xì)胞活性的靶細(xì)胞多用 K562細(xì)胞株，而測定小鼠NK細(xì)胞活性則常采用 YAC-1 細(xì)胞株。體外檢測NK細(xì)胞活性的方法有形態(tài)學(xué)法、酶釋放法、放射性核素釋放法、化學(xué)發(fā)光法、流式細(xì)胞術(shù)法 等。第二節(jié)吞噬細(xì)胞功能檢測技術(shù)大吞噬細(xì)胞：包括血液中的大單核細(xì)胞及其進(jìn)入各種組織后發(fā)育而成的巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等。功能：以吞噬功能為主，發(fā)揮非特異性免疫防疫作用并參與機(jī)體的免疫應(yīng)答炎癥損傷等。吞噬細(xì)胞

10、的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個(gè)階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。一、中性粒細(xì)胞功能檢測（一）趨化功能檢測1. 原理：中性粒細(xì)胞在趨化因子如微生物的細(xì)胞成分及其代謝產(chǎn)物、補(bǔ)體活性片段（C5a、C3a）、某些細(xì)胞因子等作用下產(chǎn)生趨化運(yùn)動，其趨化運(yùn)動強(qiáng)度可反映中性粒細(xì)胞的趨化功能。2. 方法學(xué)：（1）濾膜滲透法（Boyden小室法）；（2）瓊脂糖平板法。（二）吞噬和殺菌功能測定1. 顯微鏡檢查法：將白細(xì)胞與 葡萄球菌或白色念珠菌 懸液混合溫育，涂片，固定，堿性亞甲藍(lán) 液染色。油鏡下計(jì)數(shù)吞噬細(xì)菌和未吞噬細(xì)菌的白細(xì)胞數(shù)。對有吞噬作用的白細(xì)胞，應(yīng)同時(shí)記錄所吞噬的細(xì)菌數(shù)。2. 溶菌法：將白細(xì)胞懸

11、液與 經(jīng)新鮮人血清調(diào)理 過的細(xì)菌（大腸桿菌或金黃色葡萄球菌 ）按一定比例混合，溫育。每隔一定時(shí)間取定量培養(yǎng)物，稀釋后接種固體平板培養(yǎng)基。37C培養(yǎng)18小時(shí)后，計(jì)數(shù)生長菌落數(shù)，以了解中性粒細(xì)胞的殺菌能力。3. 硝基四氮唑藍(lán)還原試驗(yàn)（NBT還原試驗(yàn)）。二、巨噬細(xì)胞功能檢測人巨噬細(xì)胞一般從外周血或經(jīng)斑蝥敷貼形成的皮泡液中獲取，也可從肺泡灌洗液或患者腹膜透析液中 分離。實(shí)驗(yàn)室研究中常用 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。（一）炭粒廓清試驗(yàn)（二）吞噬功能檢測巨噬細(xì)胞對顆粒性抗原物質(zhì)具有很強(qiáng)的吞噬功能，常用 雞紅細(xì)胞（CRBC、白色念珠菌、酵母細(xì)胞等 作為吞噬顆粒。將巨噬細(xì)胞與雞紅細(xì)胞懸液在體外混合，溫育，涂片，染色，油

12、鏡下觀察、計(jì)數(shù)，通過計(jì) 算吞噬率和吞噬指數(shù)來反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能，并通過觀察雞紅細(xì)胞的消化程度，判斷巨噬細(xì)胞消化功 能。（三）巨噬細(xì)胞溶酶體酶的測定巨噬細(xì)胞富含溶酶體酶，如酸性磷酸酶、非特異性酯酶和溶菌酶等，測定這些酶的活性也是衡量巨噬 細(xì)胞功能的指標(biāo)之一。（四）細(xì)胞毒作用的測定（五）巨噬細(xì)胞促凝血活性測定第三節(jié) 免疫細(xì)胞功能檢測的臨床應(yīng)用免疫細(xì)胞功能檢測可以反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)，同時(shí)還可用于腫瘤、免疫缺陷病等疾病的診斷和預(yù)后答案解析人巨噬細(xì)胞一般從外周血或經(jīng)斑蝥敷貼 形成的皮泡液中獲取，也可從肺泡灌洗液或患者腹膜透析液中分離。檢測巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)常采用A. NBT還原試驗(yàn)B. 殺菌試驗(yàn)C. 斑蝥發(fā)泡試驗(yàn)D. 趨化試驗(yàn)E. 雞紅細(xì)胞吞噬試驗(yàn)正確答案E答案解析吞噬功能檢測：巨噬細(xì)胞對 顆粒性抗原 物質(zhì)具有很強(qiáng)的吞噬功能， 常用雞紅細(xì)胞（CRBC、 白色念珠菌、酵母細(xì)胞等作為吞噬顆粒。將巨噬細(xì)胞與雞紅細(xì)胞懸液在體外混合，溫育，涂片，染色，水平。功能：非特異性地吞噬殺滅病原體、衰老病殘和突變的細(xì)胞；在特異性免疫形成過程中，參與抗 原識別和遞呈，生成多種細(xì)胞