PCR設(shè)計(jì)流程與原則MicrosoftWord文檔

1、第一章微生物培養(yǎng)技術(shù)課題研究在江河湖海、土壤大氣、動(dòng)植物的體內(nèi)體表微生物無(wú)處不在。這些微小的生物在維持自然生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性上起著極其重要的作用。微生物具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、代謝產(chǎn)物多樣、生長(zhǎng)繁殖迅速、易于培養(yǎng)、突變率較高等特點(diǎn)是生物學(xué)基礎(chǔ)研究和實(shí)踐應(yīng)用中的重要材料。人類(lèi)利用自然界中豐富多樣的微生物資源解決了工業(yè)、農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域中的許多問(wèn)題。研究計(jì)劃1.查閱微生物培養(yǎng)技術(shù)的資料收集有關(guān)微生物培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)材料。2.運(yùn)用微生物培養(yǎng)技術(shù)完成所需要微生物的分離和培養(yǎng)。3.觀(guān)察微生物菌落的特征。4.測(cè)定特定樣品中的微生物數(shù)量?？偨Y(jié)交流1.總結(jié)微生物分離和培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)及注意事項(xiàng)。2.交流各小組測(cè)定的特定樣品中的

2、微生物數(shù)量提出改善環(huán)境或食品衛(wèi)生狀況的建議。第一章 微生物培養(yǎng)技術(shù)219世紀(jì)70年代德國(guó)科學(xué)家柯赫(R.Koch1843-1910圖1-1-1)研究牛的炭疽病時(shí)將病牛的血液轉(zhuǎn)移到人工配制的養(yǎng)料中在適宜條件下培養(yǎng)使得血液中的各種細(xì)菌大量繁殖形成了不同形狀和顏色的細(xì)菌群體。他將這些細(xì)菌分別注射到健康牛的體內(nèi)結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛的炭疽病是由炭疽芽孢桿菌引起的。在此過(guò)程中柯赫所采用的細(xì)菌培養(yǎng)方法開(kāi)創(chuàng)了微生物分離(isolation)和純培養(yǎng)(pure culture)技術(shù)的先河。自然界中的微生物(microorganism)主要包括細(xì)菌、放線(xiàn)菌、酵母菌、霉菌以及立克次氏體、支原體、病毒等類(lèi)群。這些微生物都需要從

3、生活環(huán)境中獲取各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以維持自身的生命活動(dòng)。由于微生物代謝方式的不同因而對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求也是有差異的。根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)在進(jìn)行微生物的分離和純培養(yǎng)時(shí)可根據(jù)微生物生長(zhǎng)繁殖和代謝的需要將各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混合在一起配制成適合微生物生存的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)基(culture medium)。其中將溶化后的固體培養(yǎng)基基質(zhì)倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿冷卻凝固后制成的培養(yǎng)基稱(chēng)為平板培養(yǎng)基。把相應(yīng)的研究對(duì)象移入培養(yǎng)基中的過(guò)程稱(chēng)為接種(inoculation)。在平板培養(yǎng)基上接種的方法有平板劃線(xiàn)法、稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法等。通過(guò)這些方法可將所需要的微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)獲得純種微生物這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為純培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中要根據(jù)實(shí)

4、驗(yàn)?zāi)康?、培養(yǎng)基種類(lèi)和實(shí)驗(yàn)器皿的差異采用不同的接種方法。接種技術(shù)是進(jìn)行微生物實(shí)驗(yàn)和相關(guān)研究(如植物的組織培養(yǎng))的基本技術(shù)。微生物的生長(zhǎng)繁殖還需要適宜的溫度一般是將接種后的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱中在一定的溫度下培養(yǎng)一定的時(shí)間以得到所需要的微生物。在微生物的分離和純培養(yǎng)中一定不能有外來(lái)的污染性雜菌所以必須采用無(wú)菌技術(shù)(aseptic technique)進(jìn)行操作。因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要對(duì)所用的器材、培養(yǎng)基進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌對(duì)工作場(chǎng)所進(jìn)行消毒。滅菌(sterilization)是指用強(qiáng)烈的理化因素殺死環(huán)境或物體內(nèi)外所有的微生物常用的是高溫滅菌法。而消毒(disinfection)一般是用相對(duì)溫和的理化方法殺死環(huán)

5、境或物體上的病原微生物和有害微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞常用的是射線(xiàn)消毒法和化學(xué)藥劑消毒法。大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)大腸桿菌是人體腸道中普遍存在且容易培養(yǎng)的一類(lèi)細(xì)菌常作為分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和基因工程研究的重要材料。材料器具含大腸桿菌的混合菌液牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基附錄二、無(wú)菌水酒精燈、接種環(huán)、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管等?；顒?dòng)程序1.配制培養(yǎng)基由教師提供配制好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法請(qǐng)參考本章第二節(jié)的內(nèi)容2.接種采用平板劃線(xiàn)分離法進(jìn)行接種。接種前的準(zhǔn)備工作將所用的實(shí)驗(yàn)器材全部放入超凈工作臺(tái)或無(wú)菌箱(室)用紫外燈照射30min。進(jìn)入無(wú)菌室前要用消毒液清潔雙手還需換好工作服、鞋、帽戴上口罩。第一節(jié)

6、 微生物的分離和純培養(yǎng)圖1-1-2接種環(huán)滅菌將接種環(huán)環(huán)端在酒精燈火焰上燒紅再將接種環(huán)斜放沿環(huán)向上燒至可能碰到培養(yǎng)皿的部分。來(lái)回?cái)?shù)次(圖1-1-2)。第一章 微生物培養(yǎng)技術(shù)4圖1-1-6平板劃線(xiàn)菌落圖在酒精燈火焰附近冷卻接種環(huán)。左手拿取混合菌液試管讓試管口緩緩?fù)ㄟ^(guò)火焰滅菌(圖1-1-3)。劃線(xiàn)的方法包括連續(xù)劃線(xiàn)法和交叉劃線(xiàn)法(圖1-1-6)。連續(xù)劃線(xiàn)法是從平板邊緣的一點(diǎn)開(kāi)始連續(xù)作緊密的波浪式劃線(xiàn)。交叉劃線(xiàn)法是從平板的一邊作第一次平行劃線(xiàn)若干條。轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角將接種環(huán)在火上灼燒并冷卻后通過(guò)第一次劃線(xiàn)部分將接種環(huán)伸入試管內(nèi)沾取一環(huán)混合菌液(圖1-1-4)。左手持培養(yǎng)皿并開(kāi)啟一條縫隙右

7、手將接種環(huán)迅速伸入平板進(jìn)行劃線(xiàn)(圖1-1-5)。采用連續(xù)劃線(xiàn)法經(jīng)培養(yǎng)得到的菌落采用交叉劃線(xiàn)法經(jīng)培養(yǎng)得到的菌落作第二次平行劃線(xiàn)。同法進(jìn)行第三次、第四次劃線(xiàn)。通過(guò)平板劃線(xiàn)聚集的多種微生物被分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線(xiàn)后可以分離得到由一個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。3.培養(yǎng)劃線(xiàn)完畢后蓋上培養(yǎng)皿蓋將培養(yǎng)皿倒置放入37的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h(圖1-1-7)。4.觀(guān)察記錄將觀(guān)察到的大腸桿菌的菌落特征記錄于表1-1-1中。5.純化培養(yǎng)挑取單個(gè)大腸桿菌菌落接種到培養(yǎng)基上仍在37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h可獲得大腸桿菌的純培養(yǎng)。檢查后如果發(fā)現(xiàn)有雜菌可進(jìn)一步劃線(xiàn)挑菌直至純化。第一節(jié) 微生物的分離和純培養(yǎng)在固體平板培養(yǎng)基上

8、單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子可生長(zhǎng)繁殖成一個(gè)具有特定形狀的菌落。在一定培養(yǎng)條件下微生物的菌落形狀、大小、邊緣、隆起度和顏色等是穩(wěn)定的。如放線(xiàn)菌菌落質(zhì)地致密菌落較小而不致廣泛延伸酵母菌菌落較細(xì)菌菌落大而厚霉菌形成的菌落較稀松多呈絨毛狀、絮狀。通過(guò)對(duì)菌落特征的觀(guān)察可以識(shí)別微生物的類(lèi)群。形態(tài)突起邊緣標(biāo)點(diǎn)狀圓形絲狀不規(guī)則狀假根紡錘狀扁平隆起凸透鏡狀墊狀臍突狀完整波形裂片狀腐蝕狀絲狀卷曲第一章 微生物培養(yǎng)技術(shù)6結(jié)果分析1.經(jīng)過(guò)第一次恒溫培養(yǎng)后培養(yǎng)基上是否只有大腸桿菌的菌落2.如果要進(jìn)一步認(rèn)識(shí)大腸桿菌的特征應(yīng)該如何操作不妨查閱有關(guān)資料學(xué)會(huì)觀(guān)察細(xì)菌形態(tài)的方法。探究特定微生物的分離和純培養(yǎng)在豆科植物根部生活的固氮菌能

9、直接固定空氣中的氮?dú)鉃橹参锏纳L(zhǎng)提供所需要的氮肥(圖1-1-8)。我們可以利用微生物的分離和純培養(yǎng)技術(shù)將根瘤菌從豆科植物的根部分離出來(lái)制成菌肥用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)會(huì)有明顯的增產(chǎn)效果?；顒?dòng)建議1.從豆科植物根瘤中分離和培養(yǎng)根瘤菌選用根系比較完整根瘤大而內(nèi)部紅潤(rùn)的新鮮豆科植物作為材料。由于根瘤表面雜菌多分離培養(yǎng)的關(guān)鍵是殺死表面雜菌。2.從酒曲中分離和培養(yǎng)酵母菌酒曲中含有霉菌、酵母菌、細(xì)菌等大量微生物(圖1-1-9)。宜選用酸性液體培養(yǎng)基培養(yǎng)再用劃線(xiàn)分離法在固體培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)。培養(yǎng)不同的微生物使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)的溫度和時(shí)間有所不同。大多數(shù)微生物適宜生長(zhǎng)的溫度在2540之間實(shí)驗(yàn)室中常采用2830培養(yǎng)微生物。

10、一般的細(xì)菌適合于中性環(huán)境生長(zhǎng)放線(xiàn)菌適合于偏堿性環(huán)境而酵母菌和霉菌適合于微酸性環(huán)境配制培養(yǎng)基時(shí)需要根據(jù)微生物的類(lèi)群調(diào)節(jié)pH。析討論1.在本次活動(dòng)中你是否獲得了所需微生物的純培養(yǎng)你認(rèn)為取得成功的關(guān)鍵技術(shù)是什么2.你在實(shí)驗(yàn)中獲得的細(xì)菌或其他微生物的純培養(yǎng)如果需要保留便于以后使用應(yīng)該如何保存如果不需要保留應(yīng)該如何處理瓊脂平板培養(yǎng)基分離純化技術(shù)是一種簡(jiǎn)便有效的微生物學(xué)常規(guī)技術(shù)它至今仍廣泛應(yīng)用于微生物菌種的篩選、鑒定、育種、計(jì)數(shù)以及各種微生物的測(cè)定工作中。純種分離技術(shù)還在不斷發(fā)展完善如許多用于活菌計(jì)數(shù)的平板等已日趨微型化、簡(jiǎn)便化、商品化和系列化。1.在平板劃線(xiàn)時(shí)若需再次取菌液劃線(xiàn)需要先將接種環(huán)灼燒。這是為

11、什么2.接種以后為什么要將培養(yǎng)皿倒置放入恒溫箱中培養(yǎng)第一章 微生物培養(yǎng)技術(shù)8 第二節(jié) 培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用我們食用的火腿腸等熟肉制品中常常添加食用色素紅曲從而使這些食品顯得更加誘人(圖1-2-1)。你知道嗎早在宋代我國(guó)就根據(jù)紅曲霉有耐酸和耐高溫的特點(diǎn)采用明礬調(diào)節(jié)酸度和用酸米抑制雜菌的方法培養(yǎng)出純度很高的紅曲。這實(shí)際上是利用培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用。有些微生物可以分泌纖維素酶使纖維素分解以作為生命活動(dòng)所需要的碳源。如果在固體培養(yǎng)基中加入纖維濾紙作為惟一碳源則只有能分解纖維素的微生物可以生存其他微生物由于缺乏纖維素酶不能利用纖維素作為碳源而無(wú)法生存。這樣就可以分離到能分解纖維素的微生物。這種能

12、讓特定的微生物生長(zhǎng)抑制其他微生物生長(zhǎng)從而將所需要的微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)的培養(yǎng)基稱(chēng)為選擇培養(yǎng)基(selective medium)。很多微生物都可以通過(guò)選擇培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化。配制選擇培養(yǎng)基時(shí)可以根據(jù)某一種或某一類(lèi)微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求加入某些物質(zhì)或除去某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等)抑制其他微生物的生長(zhǎng)從而有利于某一類(lèi)群或某一種特定的微生物生長(zhǎng)。此外也可以根據(jù)某些微生物對(duì)一些物理、化學(xué)因素的抗性在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)繁殖造成有利于特定微生物種類(lèi)優(yōu)先生長(zhǎng)的條件。用惟一碳源培養(yǎng)基分離微生物自然界的纖維素資源十分豐富在植物的枝葉、秸稈和糠

13、殼中都含有大量的纖維素但是多數(shù)的纖維素原料都作為燃料或廢物處理掉了(圖1-2-2)。如果我們利用分解纖維素的微生物將纖維素轉(zhuǎn)變成糖類(lèi)等可溶性的碳水化合物將為飼料、食品及發(fā)酵工業(yè)開(kāi)辟新的原料來(lái)源。材料器具土壤懸液赫奇遜培養(yǎng)基附錄二、蒸餾水濾紙、酒精燈、電爐、高壓蒸汽滅菌鍋、電子秤、培養(yǎng)皿、pH試紙、棉花、錐形瓶、鑷子、吸管、干燥器等?；顒?dòng)程序1.配制培養(yǎng)基原料稱(chēng)量、溶解 根據(jù)培養(yǎng)基的配方準(zhǔn)確稱(chēng)取各原料成分置于錐形瓶中并加入適量蒸餾水在電爐上邊加熱邊攪拌直至瓊脂完全溶化然后加蒸餾水至1000mL(圖1-2-3圖1-2-4)。調(diào)節(jié)pH 先用精密pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的原始pH再滴加物質(zhì)的量濃度為1mol

14、/L的NaOH或鹽酸溶液邊加邊攪拌并隨時(shí)用pH試紙測(cè)試pH直至pH達(dá)7.27.4。分裝、包扎 將配制好的培養(yǎng)基分裝到錐形瓶?jī)?nèi)不超過(guò)其容積一半為宜用棉塞塞緊(圖1-2-5)。棉塞外包一層牛皮紙。用記號(hào)筆注明名稱(chēng)、組別、日期。圖1-2-3原料稱(chēng)量圖1-2-2樹(shù)皮中含有大量的纖維素圖1-2-5培養(yǎng)基滅菌 將上述培養(yǎng)基放置于高壓蒸汽滅菌鍋中121下滅菌20min。2.倒平板將滅菌后的培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿中(圖1-2-6abc)。待培養(yǎng)基冷卻至50左右時(shí)在酒精燈火焰旁拔出棉塞。手拿錐形瓶瓶口通過(guò)火焰灼燒滅菌。將長(zhǎng)玻璃吸管在酒精燈火焰上灼燒把一端彎成30°呈“了”字形制成涂布器。(a)(b) 左手持

15、培養(yǎng)皿打開(kāi)皿蓋。右手將錐形瓶中的約15mL培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿。立即蓋上皿蓋待平板冷卻后備用。3.接種采用稀釋涂布平板法進(jìn)行接種(圖1-2-7abc)。將長(zhǎng)玻璃吸管在酒精燈火焰上灼燒把一端彎成30°呈“了”字形制成涂布器。用無(wú)菌鑷子取無(wú)菌濾紙覆蓋于培養(yǎng)基上并用涂布器壓平。用無(wú)菌吸管吸取0.05mL的土壤稀釋液滴于平板上再用無(wú)菌涂布器涂布。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使涂布均勻。4.培養(yǎng)將培養(yǎng)基置于盛有水以便保持一定的濕度的干燥器隔板上于2830條件下恒溫培養(yǎng)10d左右(圖1-2-8)。手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法加水 打開(kāi)高壓蒸汽滅菌鍋將里面的滅菌桶取出向鍋內(nèi)加水水面與底架平齊為宜。裝料 將錐形

16、瓶瓶口向上豎放在滅菌桶內(nèi)再將滅菌桶放回滅菌鍋。物品之間要保留空隙以利于通氣。密封 加蓋將排氣軟管插入滅菌鍋的排氣管內(nèi)。以?xún)蓛蓪?duì)稱(chēng)的方式同時(shí)擰緊相對(duì)的兩個(gè)緊固螺栓以防漏氣。排氣 加熱當(dāng)壓力上升到49kPa時(shí)打開(kāi)排氣閥放氣當(dāng)壓力降到0時(shí)關(guān)閉排氣閥。重復(fù)上述放氣過(guò)程一次以徹底排出鍋內(nèi)的冷空氣。升壓 當(dāng)鍋內(nèi)的壓力升到98kPa左右時(shí)保持20min。降壓 停止加熱讓其自然降壓。當(dāng)壓力降至0以后打開(kāi)排氣閥10min后擰開(kāi)緊固螺栓取出錐形瓶。最后將滅菌鍋里的水排放干凈。結(jié)果分析1.如何判斷培養(yǎng)基中的微生物能分解纖維素2.觀(guān)察培養(yǎng)基上的菌落判斷培養(yǎng)基上有哪些類(lèi)群的微生物?利用選擇培養(yǎng)基分離微生物蘇云金芽孢桿菌

17、細(xì)胞內(nèi)形成的伴孢晶體能夠殺死包括棉鈴蟲(chóng)在內(nèi)的許多農(nóng)作物害蟲(chóng)。1993年我國(guó)科學(xué)家成功地將蘇云金芽孢桿菌中的抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入棉植株培育出抗棉鈴蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉(圖1-2-9)。利用選擇培養(yǎng)基可極大地提高從蟲(chóng)體中分離蘇云金芽孢桿菌的效率。圖1-2-9抗蟲(chóng)棉(左)和普通棉(右)活動(dòng)建議1.分離蘇云金芽孢桿菌在未使用農(nóng)藥的田間染病死亡的棉鈴蟲(chóng)等幼蟲(chóng)大多是因?yàn)楦腥玖颂K云金芽孢桿菌中毒所致?？梢岳萌静〉拿掴徬x(chóng)、玉米螟、菜青蟲(chóng)為材料配制菌液采用附錄二提供的選擇培養(yǎng)基分離出蘇云金芽孢桿菌。2.分離分解纖維素的細(xì)菌實(shí)踐案例只是分離到能分解纖維素的微生物類(lèi)群?？梢栽诖嘶A(chǔ)普通棉葉抗蟲(chóng)棉葉上根據(jù)附錄二中所提供的相關(guān)培

18、養(yǎng)基配方進(jìn)一步分離出能分解纖維素的細(xì)菌。分析討論1.在活動(dòng)方案中是否需要設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)如果需要應(yīng)該如何設(shè)計(jì)2.如何利用活動(dòng)中分離到的微生物進(jìn)一步培養(yǎng)以獲得大量的生產(chǎn)用菌種應(yīng)該使用哪種類(lèi)型的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基分離法是分離微生物的另一種方法。當(dāng)需要分離的微生物在混合樣品中數(shù)量很少時(shí)如果直接采用平板稀釋法或劃線(xiàn)法進(jìn)行分離很難奏效。采用選擇培養(yǎng)基則能使分離對(duì)象大量繁殖同時(shí)抑制了其他微生物的生長(zhǎng)。通過(guò)這種方法可以選擇性地分離和培養(yǎng)不同的微生物。1.為什么選擇培養(yǎng)基能分離出不同的微生物2.試比較灼燒滅菌與高壓蒸汽滅菌的適用范圍。第三節(jié) 測(cè)定微生物的數(shù)量在學(xué)習(xí)生態(tài)系統(tǒng)中的種群數(shù)量變動(dòng)時(shí)我們?cè)?jīng)利用微生物的計(jì)數(shù)方

19、法探究培養(yǎng)液中酵母菌的數(shù)量變化。其實(shí)微生物的計(jì)數(shù)方法不僅用于科學(xué)研究而且還廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生檢驗(yàn)、環(huán)境污染檢測(cè)等領(lǐng)域。測(cè)定微生物數(shù)量的方法可分為兩類(lèi)直接計(jì)數(shù)法和間接計(jì)數(shù)法。直接計(jì)數(shù)法中常用的是顯微鏡直接計(jì)數(shù)法這種方法是先將待測(cè)樣品制成懸液然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)(圖1-3-1)。根據(jù)在顯微鏡下觀(guān)察到的微生物數(shù)目來(lái)計(jì)算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)。直接計(jì)數(shù)法所需設(shè)備簡(jiǎn)單可迅速得到結(jié)果而且在計(jì)數(shù)的同時(shí)能觀(guān)察到所研究微生物的形態(tài)特征其缺點(diǎn)是難以計(jì)數(shù)微小的細(xì)菌。這種方法一般適用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。間接計(jì)數(shù)法最常用的是稀釋平板計(jì)數(shù)法它是根據(jù)微生物的培養(yǎng)特征而設(shè)計(jì)的計(jì)數(shù)方法。這

20、種方法在樣品中含菌數(shù)較少的情形下也可以完成計(jì)數(shù)。應(yīng)用稀釋平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)時(shí)需要將待測(cè)樣品配制成均勻的系列稀釋液盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開(kāi)。再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)或是將一定量的稀釋液與溶化后冷卻至45左右的瓊脂培養(yǎng)基混合傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿中搖勻、靜置待凝。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后就由單個(gè)微生物生長(zhǎng)繁殖形成菌落這樣的一個(gè)菌落就代表著一個(gè)微生物個(gè)體。統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基中出現(xiàn)的菌落數(shù)即可推算出檢測(cè)樣品中的活菌數(shù)。圖1-3-1顯微鏡直接計(jì)數(shù)示意圖視野土壤中好氣性細(xì)菌的計(jì)數(shù)土壤中生活的微生物種類(lèi)和數(shù)量是極其豐富的這些數(shù)量眾多的微生物對(duì)提高土壤肥力有重要作用。因此測(cè)定土壤中的含菌量

21、可以作為判定土壤肥力的一個(gè)重要指標(biāo)。材料器具土壤樣品牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(附錄二)、無(wú)菌水培養(yǎng)皿、移液管、天平、錐形瓶、試管、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、搖床等?；顒?dòng)程序1.制備土壤稀釋液取土壤表層510cm處的土樣。準(zhǔn)確稱(chēng)取1g土樣放入盛有99mL無(wú)菌水的錐形瓶(250mL放有小玻璃珠)中用手或搖床振蕩20min即制成102倍的稀釋液。用1mL無(wú)菌移液管吸取102倍稀釋液0.5mL移入裝有4.5mL無(wú)菌水的試管中配制成103倍稀釋液。用同樣的方法可制成稀釋倍數(shù)為104、105、106的系列稀釋菌液(圖1-3-2)。圖1-3-2稀釋平板計(jì)數(shù)操作示意圖土樣無(wú)菌水恒溫培養(yǎng)1g0.5mL0.5mL0.5m

22、L0.5mL99mL0.2mL0.2mL0.2mL樣品稀釋液4.5mL無(wú)菌水106移液時(shí)要將移液管插入液面吹吸3次每次吸上的液面要高于前一次讓菌液混合均勻并減少稀釋中的誤差。每配一個(gè)稀釋度要換用一支移液管。2.取樣及倒平板將無(wú)菌培養(yǎng)皿編號(hào)依次為104、105、106每一號(hào)碼設(shè)置三個(gè)重復(fù)。用無(wú)菌移液管三支分別吸取稀釋倍數(shù)為104、105、106的土壤稀釋液各0.2mL注入到相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿中(每個(gè)稀釋倍數(shù)各三個(gè)培養(yǎng)皿)。將已滅菌牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基溶化待冷卻至4550左右傾入到無(wú)菌培養(yǎng)皿中每皿約15mL輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使土壤稀釋液與培養(yǎng)基混合均勻。3.培養(yǎng)將上述接種好的平板培養(yǎng)基冷卻后倒置放入2

23、830的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2436h直至長(zhǎng)出菌落為止。4. 觀(guān)察記錄將實(shí)驗(yàn)中得到的菌落數(shù)填入表1-3-1。結(jié)果分析1.選取具有合適菌落數(shù)的稀釋倍數(shù)并計(jì)數(shù)。在計(jì)算結(jié)果時(shí)從接種的3個(gè)稀釋度中選擇一個(gè)合適稀釋倍數(shù)統(tǒng)計(jì)出菌落數(shù)(圖1-3-3)。選擇的原則是過(guò) 多適 中過(guò) 少圖1-3-3培養(yǎng)皿中菌落數(shù)表1-3-1 不同稀釋倍數(shù)下菌落數(shù) 104105 106 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均(1) 細(xì)菌、放線(xiàn)菌、酵母菌以每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)有30300個(gè)菌落為宜。霉菌以每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)有10100個(gè)菌落為宜。(2) 同一稀釋倍數(shù)各個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差不太懸殊。2.將統(tǒng)計(jì)出的菌落數(shù)按下列公式計(jì)算得出每克

24、樣品菌數(shù)。每克土壤樣品菌數(shù)=某稀釋倍數(shù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)測(cè)定特定樣品中的微生物數(shù)量人的糞便中含有致病菌但是通常因數(shù)量較少而不易檢測(cè)。大腸桿菌是生存于人體腸道中的正常菌群每克糞便中含有109個(gè)大腸桿菌且能夠與致病菌混雜生長(zhǎng)。如果食品和飲用水中出現(xiàn)大腸桿菌就意味著食物可能被糞便污染而帶上致病菌。因而常將大腸桿菌數(shù)量作為食品衛(wèi)生的檢測(cè)指標(biāo)之一?；顒?dòng)建議1.檢測(cè)天然水源中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)細(xì)菌總數(shù)通常是指1g或1mL檢測(cè)樣品中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)單位用cfu/g(mL)表示。大腸菌群數(shù)通常是指每100g或100mL檢測(cè)樣品中所含大腸菌群的實(shí)際數(shù)值以(MPN)表示。大腸菌群是指在37條件下

25、24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的一類(lèi)需氧或兼性厭氧型革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌的總稱(chēng)。大腸菌群數(shù)的檢測(cè)常用多管發(fā)酵法使用乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB培養(yǎng)基)和乳糖發(fā)酵管(附錄二圖1-3-4)。第三節(jié) 測(cè)定微生物的數(shù)量圖1-3-4大腸桿菌使EMB培養(yǎng)基發(fā)出藍(lán)綠色金屬光澤(右) 2.檢測(cè)某種食品中的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)食品在原料加工、成品包裝等生產(chǎn)環(huán)節(jié)中可能受到外界的污染。一般說(shuō)來(lái)菌落總數(shù)越多遭受病原菌污染的可能性越大說(shuō)明食品的衛(wèi)生質(zhì)量越差。3.土壤中分解尿素細(xì)菌的計(jì)數(shù)有些細(xì)菌含有尿素分解酶能將尿素瓊脂培養(yǎng)基(附錄二)中的尿素分解生成氨氨溶于水變成氫氧化銨導(dǎo)致培養(yǎng)基變成堿性使酚紅指示劑呈

26、現(xiàn)紅色(圖1-3-5)。分析討論1.如果你和你的同學(xué)選擇的探究活動(dòng)內(nèi)容是相同的所得到的結(jié)果一致嗎如果有不同請(qǐng)分析造成這種誤差的原因。2.食品中檢測(cè)出的菌落數(shù)是該食品中所有的細(xì)菌數(shù)嗎為什么顯微鏡直接計(jì)數(shù)法和稀釋平板計(jì)數(shù)法是測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法。通過(guò)測(cè)定微生物數(shù)量可以研究微生物在土壤、水、空氣、糧食和食品中的繁殖狀況為監(jiān)測(cè)環(huán)境質(zhì)量、檢測(cè)食品衛(wèi)生質(zhì)量等方面提供科學(xué)依據(jù)。1.影響菌落總數(shù)測(cè)定準(zhǔn)確性的主要因素有哪些2.測(cè)定土壤放線(xiàn)菌、真菌數(shù)量時(shí)制備的土壤稀釋液濃度與測(cè)定細(xì)菌的土壤稀釋液濃度一樣嗎為什么微生物的分離和純培養(yǎng)技術(shù)是微生物最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)它包括培養(yǎng)基的制備、滅菌和消毒、接種、培養(yǎng)等步驟。根

27、據(jù)培養(yǎng)微生物的種類(lèi)、研究對(duì)象和內(nèi)容的不同可配制相應(yīng)的培養(yǎng)基。其中選擇培養(yǎng)基用于特定目標(biāo)微生物的分離。在微生物的分離和培養(yǎng)中一定要在無(wú)菌條件下進(jìn)行操作。接種時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、培養(yǎng)基種類(lèi)、實(shí)驗(yàn)器皿等的不同需采用不同的接種方法。在平板接種時(shí)運(yùn)用的劃線(xiàn)法、稀釋平板涂布法、混合平板法等也可用于分離純化菌種、活菌計(jì)數(shù)、觀(guān)察菌落形態(tài)以及在平板上進(jìn)行各種生理、生化實(shí)驗(yàn)。微生物的培養(yǎng)應(yīng)根據(jù)不同種類(lèi)的微生物及實(shí)驗(yàn)的目的設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間和溫度并注意在培養(yǎng)過(guò)程中適時(shí)觀(guān)察直至培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌落為止。純種分離和培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展純種分離技術(shù)是人類(lèi)揭開(kāi)微生物世界奧秘的重要手段要知曉在自然條件下處于混生狀態(tài)的某一種微生物的特點(diǎn)以及它對(duì)人類(lèi)

28、是有益或是有害之謎就必須采用在無(wú)菌技術(shù)基礎(chǔ)上的純種分離方法。利用固體培養(yǎng)基來(lái)分離和純化微生物經(jīng)歷了馬鈴薯塊切面、明膠平板、瓊脂平板等階段。最初使用明膠作為培養(yǎng)基成分中的凝固劑但明膠在28以上就會(huì)熔化因此對(duì)于培養(yǎng)人類(lèi)病原菌(最適溫度3537)極不合適。此外有些細(xì)菌可以分解明膠使它失去作為培養(yǎng)基支撐物的作用。純種分離技術(shù)的真正突破來(lái)自于柯赫學(xué)派發(fā)明的培養(yǎng)皿瓊脂平板。柯赫的助手皮特里(J.Petri)設(shè)計(jì)了透明的玻璃培養(yǎng)皿這種培養(yǎng)皿既便于容納培養(yǎng)基也便于觀(guān)察細(xì)菌等微生物的菌落同時(shí)它還可以達(dá)到通氣而不易污染雜菌的目的。迄今為止這種培養(yǎng)皿仍是微生物學(xué)中廣泛使用的器材之一。柯赫的另一名助手海塞(W.Hes

29、se)在妻子的啟發(fā)下用她做果凍的瓊脂作為固體培養(yǎng)基的支撐物。瓊脂是從一種海藻中提取出來(lái)的在水中加熱可溶解當(dāng)溶液溫度降至42以下則凝固為膠體且不為微生物所分解。瓊脂固體平板培養(yǎng)基的問(wèn)世和普遍應(yīng)用為微生物的純種分離技術(shù)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。以后用于霉菌孢子和酵母菌體等的單孢子或單細(xì)胞分離純化技術(shù)也相繼問(wèn)世。上述方法的綜合應(yīng)用不但糾正了微生物學(xué)早期因分離不純而將微生物誤認(rèn)為是多形態(tài)的觀(guān)點(diǎn)還為尋找病原微生物提供了方法上的保證。從此許多奪走人、畜生命的嚴(yán)重傳染病的病原體如結(jié)核桿菌、霍亂弧菌、白喉?xiàng)U菌、傷寒桿菌、破傷風(fēng)桿菌、鼠疫桿菌、痢疾桿菌、腦炎雙球菌、梅毒螺旋菌等被逐個(gè)分離出來(lái)為人們有效地防治這些傳染病奠

30、定了基礎(chǔ)。在微生物發(fā)酵工業(yè)中要使微生物良好地生長(zhǎng)或累積代謝產(chǎn)物就需要應(yīng)用微生物純種培養(yǎng)技術(shù)。微生物純種培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展表現(xiàn)為從固體培養(yǎng)法為主發(fā)展到液體培養(yǎng)法為主從淺層培養(yǎng)法為主發(fā)展到深層發(fā)酵法從靜止培養(yǎng)法發(fā)展到通氣攪拌培養(yǎng)法從單罐培養(yǎng)發(fā)展到連續(xù)培養(yǎng)以及多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)從利用分散的微生物細(xì)胞發(fā)展到固定化細(xì)胞從利用自然菌種到利用變異菌株以至“工程菌”等等。其中大規(guī)模液體深層通氣攪拌發(fā)酵裝置(即發(fā)酵罐)的發(fā)明和普及使用為生物工程學(xué)開(kāi)辟了嶄新的前景同時(shí)也使微生物發(fā)酵工業(yè)成為國(guó)民經(jīng)濟(jì)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。展開(kāi)相關(guān)動(dòng)漫作品脫衣卡片少年少女18禁我把魔王變成妹了熱呼呼的戀曲manga戀愛(ài)親吻還是肉體浮戀少女彩葉調(diào)教

31、男友我的老婆是小學(xué)生亦兄亦妹親吻姐姐oad給百度提建議Robert Sapolsky從維基百科,自由的百科全書(shū)歌手,明白了Amahl和游客.羅伯特·莫里斯SapolskyRobert Sapolsky,綽號(hào)Subtlesky由學(xué)生和朋友(2009)出生1957(age58-59)布魯克林,紐約住宅美國(guó)國(guó)籍美國(guó)字段神經(jīng)科學(xué),神經(jīng)生物學(xué),生物人類(lèi)學(xué),靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物學(xué)機(jī)構(gòu)斯坦福大學(xué)母校哈佛大學(xué) (文學(xué)士學(xué)位)洛克菲勒大學(xué) (博士學(xué)位。)論文壓力和衰老的神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)(1984年)博士生導(dǎo)師Bruce McEwenOtheracademic顧問(wèn)麥爾文·康納是1羅伯特&

32、#183;莫里斯Sapolsky(生于1957年)是一個(gè)美國(guó)人neuroendocrinologist教授生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和神經(jīng)外科在斯坦福大學(xué)研究員兼作家。他是目前生物科學(xué)教授和神經(jīng)病學(xué)和神經(jīng)科學(xué)教授,禮貌,神經(jīng)外科,斯坦福大學(xué)。此外,他是一個(gè)研究員肯尼亞國(guó)家博物館.2內(nèi)容 hide · 1早期的生活和教育· 2職業(yè)生涯· 3榮譽(yù)· 4另請(qǐng)參閱· 5書(shū)· 6引用· 7外部鏈接早期的生活和教育編輯Sapolsky出生在布魯克林,紐約移民的蘇聯(lián)。他是作為一個(gè)正統(tǒng)派猶太人和把時(shí)間花在了閱讀和想象和銀背大猩猩生

33、活在一起大猩猩。12歲,他喜歡寫(xiě)信靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物學(xué)家。他參加了約翰·杜威高中到那個(gè)時(shí)候,他是在主題閱讀教科書(shū)和教學(xué)斯瓦希里語(yǔ).3Sapolsky描述自己是一個(gè)無(wú)神論者.45他說(shuō)在他的獲獎(jiǎng)感言皇帝沒(méi)穿衣服”,我成長(zhǎng)在一個(gè)正統(tǒng)的猶太家庭,我是虔誠(chéng)的教徒,直到13歲左右。在我的青春期,我定義的行為的一個(gè)生活脫離所有宗教信仰?！?1978年,Sapolsky收到了他的學(xué)士學(xué)位生物人類(lèi)學(xué)最優(yōu)等地從哈佛大學(xué).7然后他去了肯尼亞研究的社會(huì)行為狒狒在野外,之后他回到紐約,就讀洛克菲勒大學(xué)他收到了博士學(xué)位。在神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)在實(shí)驗(yàn)室的工作Bruce McEwen,一個(gè)世界知名的內(nèi)分泌學(xué)家.Sapolsky后最

34、初的一年半野外研究在非洲,每年夏天他回到二十五年觀(guān)察同一群狒狒,從70年代末到90年代初。他每天花8到10個(gè)小時(shí),每年大約四個(gè)月記錄這些靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的行為。8職業(yè)生涯編輯Sapolsky目前John a .和辛西婭·弗萊Gunn斯坦福大學(xué)教授舉行聯(lián)合任命在幾個(gè)部門(mén),包括生物科學(xué)、神經(jīng)病學(xué)和神經(jīng)科學(xué)和神經(jīng)外科。9neuroendocrinologist,他有他的研究關(guān)注的問(wèn)題壓力和神經(jīng)變性的可能性,以及基因治療策略來(lái)保護(hù)敏感神經(jīng)元免受疾病。目前,他在工作基因傳輸技術(shù)來(lái)加強(qiáng)神經(jīng)元禁用的影響糖皮質(zhì)激素。在肯尼亞每年Sapolsky花時(shí)間研究人口的野外狒狒為了確定在他們的環(huán)境中,生活的壓力來(lái)源

35、和人格之間的關(guān)系和模式與壓力相關(guān)的疾病在這些動(dòng)物。更具體地說(shuō),Sapolsky研究皮質(zhì)醇之間的水平男性和女性,下屬確定應(yīng)力水平。早期,但仍橄欖狒狒的相關(guān)的例子,他的研究是在1990年被發(fā)現(xiàn)科學(xué)美國(guó)人篇文章中,在野外“壓力”。10他還寫(xiě)過(guò)神經(jīng)損傷和精神錯(cuò)亂辯護(hù)在美國(guó)的法律體系.1112Sapolsky工作已經(jīng)出現(xiàn)廣泛的媒體,尤其是在國(guó)家地理特別強(qiáng)調(diào):肖像的殺手,13幾篇文章紐約時(shí)報(bào),1415連線(xiàn)雜志16和斯坦福大學(xué)雜志。17他也寫(xiě)一些科普文章關(guān)于他的工作(下面列出)。榮譽(yù)編輯Sapolsky為他的工作獲得了無(wú)數(shù)的榮譽(yù)和獎(jiǎng)勵(lì),包括著名的麥克阿瑟獎(jiǎng)學(xué)金天才格蘭特在1987年,18一個(gè)斯隆獎(jiǎng)學(xué)金,在神

36、經(jīng)科學(xué)Klingenstein獎(jiǎng)學(xué)金。他也獲得了國(guó)家科學(xué)基金會(huì)總統(tǒng)年輕調(diào)查員獎(jiǎng)和今年的青年科學(xué)家獎(jiǎng)神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì),國(guó)際社會(huì)Psychoneuro-Endocrinology,生物精神病學(xué)協(xié)會(huì).2007年,他收到了約翰·p·麥戈文行為科學(xué),獎(jiǎng)授予的美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì).192008年,他收到了Wonderfest的卡爾·薩根科普獎(jiǎng).202010年2月Sapolsky命名的宗教自由基金會(huì)榮譽(yù)的杰出成就,21在早些時(shí)候皇帝沒(méi)穿衣服為2002年。22另請(qǐng)參閱編輯· 漢斯Selye· 沃爾特·布拉德福德大炮· 保羅·雷丁書(shū)編輯

37、83; 壓力、老化的大腦和神經(jīng)細(xì)胞死亡的機(jī)制 (麻省理工學(xué)院出版社,1992)ISBN 0-262-19320-5· 睪酮的麻煩:和其他論文在生物學(xué)的人類(lèi)困境 (斯克里布納爾出版社,1997)ISBN 0-684-83891-5· 垃圾食品的猴子 (標(biāo)題發(fā)布,1997)ISBN 978-0-7472-7676-0(英國(guó)版的麻煩與睪酮)· 靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的回憶錄 (試金石的書(shū),2002)ISBN 0-7432-0247-3· 為什么斑馬沒(méi)有潰瘍(1994年,霍爾特平裝書(shū)/貓頭鷹第三眾議員埃德。2004)ISBN 0-80

38、50-7369-8· Monkeyluv:對(duì)我們的生活和其他論文的動(dòng)物(斯克里布納爾出版社,2005年)ISBN 0-7432-6015-5引用編輯1. Jump up漢森,e·西蒙(2001年1月5日)。“Robert Sapolsky對(duì)話(huà)”。大腦的連接。檢索 6月3日2014年.公元前:你最大的導(dǎo)師是誰(shuí)?拉爾夫-舒馬赫:我已經(jīng)處理的人,主要的人是一位人類(lèi)學(xué)家/醫(yī)生名叫梅爾文Konnor。他我的導(dǎo)師在學(xué)院和仍然是一個(gè)主要的導(dǎo)師。換行字符 |quote=在36個(gè)位置(幫助)2. Jump up“Robert Sapolsky”。檢索 2月22日

39、2009年.3. Jump up克里斯托弗·沃恩?！耙吧飳W(xué)家與他內(nèi)心的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物?！?斯坦福雜志。檢索 8月20日2011年.4. Jump upShwartz,馬克(2007年3月7日)。“Robert Sapolsky討論壓力的生理效應(yīng)”。新聞。斯坦福大學(xué)。檢索 10月13日2012年.5. Jump up”Sapolsky教授解釋了宗教的起源部分1/2 ".6. Jump up“Sapolsky教授、信仰和生物學(xué)”.7. Jump up“關(guān)于Robert Sapolsky:推進(jìn)我們對(duì)壓力幾十年”的理解。斯坦福大學(xué)。檢索 8月20日2011年.8. Jump up“我的成績(jī)單和Robert Sapolsky寫(xiě)對(duì)話(huà)”。斯坦福大學(xué)。檢索 8月20日2011年.9. Jump up“斯坦福大學(xué)教授Sapolsky的細(xì)節(jié)”。檢索 2007-07-2710. Jump up Sapolsky Robert m .(1990)。在野外“壓力”。科學(xué)美國(guó)人,262年版。106 - 11311. Jump up &quo