水生生物學(xué)單胞藻的培育

1、單細(xì)胞藻種質(zhì)分離、培養(yǎng)和應(yīng)用的技術(shù)操作規(guī)范中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生物種質(zhì)庫(kù)聯(lián)系人：逄少軍一章 常見(jiàn)單細(xì)胞藻的生物學(xué)簡(jiǎn)介第一節(jié) 綠藻一、 扁藻扁藻屬綠藻門(mén)，綠藻綱，團(tuán)藻目，衣藻科，扁藻屬。常用種類(lèi)有青島大扁藻和亞心形扁藻。形態(tài)特征：亞心形扁藻的藻體一般扁壓，細(xì)胞前面觀廣卵形，前端較寬闊，頂端前部凹陷。鞭毛4條由凹陷處生出。細(xì)胞內(nèi)有一個(gè)大型、杯狀、綠色的色素體，后端有一個(gè)呈內(nèi)上開(kāi)口的杯狀蛋白核，有一個(gè)到數(shù)個(gè)紅色眼點(diǎn)比較穩(wěn)定地位于蛋白核附近、細(xì)胞中間略前。原生質(zhì)體里有一個(gè)細(xì)胞核。細(xì)胞外有一層薄薄的纖維質(zhì)細(xì)胞壁。細(xì)胞長(zhǎng)1116微米，寬79微米，厚3.55微米。能快速活潑

2、游動(dòng)。繁殖方式：無(wú)性繁殖，細(xì)胞縱分裂形成2個(gè)（少數(shù)情況下4個(gè)）子細(xì)胞，環(huán)境不良時(shí)形成休眠孢子。生態(tài)條件：1、鹽度 亞心形扁藻為廣鹽性，在880鹽度的水中均能生長(zhǎng)繁殖。最適鹽度在3040之間。 2、溫度 亞心形扁藻為廣溫性，在730的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適范圍在2028之間。3、光照 亞心形扁藻在光照強(qiáng)度為100020000勒克斯范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)繁殖，最適光照強(qiáng)度約在500010000勒克斯之間。4、酸堿度 一般在pH69的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適范圍約在pH7.58.5之間。綠藻門(mén)的藻類(lèi)在含有機(jī)質(zhì)豐富的水中生長(zhǎng)良好。二、 鹽藻鹽藻屬綠藻門(mén)，綠藻綱，團(tuán)藻目，鹽藻科，鹽藻屬。主要培養(yǎng)種類(lèi)是鹽藻，又

3、稱(chēng)杜氏藻。形態(tài)特征：鹽藻沒(méi)有細(xì)胞壁，細(xì)胞外只有一層彈性膜，所以體形變化很大，有梨形、橢圓形、長(zhǎng)頸形和紡錘形等。細(xì)胞內(nèi)有一個(gè)杯狀的色素體，色素體內(nèi)的色素主要是葉綠素，生活條件不良時(shí)產(chǎn)生血紅素，藻體呈紅色。在色素體內(nèi)靠近基部有一個(gè)大的蛋白核，有一個(gè)紅色眼點(diǎn)位于細(xì)胞上部。原生質(zhì)體中央有一個(gè)細(xì)胞核。前端生出兩條等長(zhǎng)的鞭毛，鞭毛比細(xì)胞長(zhǎng)約1/3。細(xì)胞長(zhǎng)1624微米，寬1013微米。繁殖方式：無(wú)性繁殖，細(xì)胞縱分裂形成2個(gè)子細(xì)胞，環(huán)境不良時(shí)行有性生殖。生態(tài)條件：1、鹽度 鹽藻在高鹽度水中生長(zhǎng)特別好。最適鹽度在6070之間。 2、溫度 鹽藻為廣溫性，可在440的范圍內(nèi)存活，最適范圍在2535之間。3、光照 鹽

4、藻對(duì)光的適應(yīng)性較強(qiáng)，最適光照強(qiáng)度約在20006000勒克斯之間。4、酸堿度 一般在pH79的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適范圍約在pH7.08.5之間。三、 小球藻小球藻屬綠藻門(mén)，綠藻綱，綠球藻目，卵孢藻科，小球藻屬。常見(jiàn)的有核蛋白小球藻、眼點(diǎn)小球藻、卵形小球藻、鹽生小球藻和海生小球藻等。形態(tài)特征：球形或廣橢圓形。細(xì)胞內(nèi)具有杯狀（核蛋白小球藻）或呈邊緣生板狀（卵形小球藻）的色素體，核蛋白小球藻的色素體中有一個(gè)球形的蛋白核，細(xì)胞中央有一個(gè)細(xì)胞核。細(xì)胞大小依種類(lèi)有所不同，核蛋白小球藻的細(xì)胞直徑35微米，在人工培養(yǎng)的情況下，生長(zhǎng)良好時(shí)，細(xì)胞會(huì)變小。繁殖方式：以擬親孢子的方式行無(wú)性繁殖。首先在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行原

5、生質(zhì)體分裂，成為多個(gè)孢子，然后這些孢子破母細(xì)胞而出，每個(gè)孢子長(zhǎng)成一個(gè)新個(gè)體。生態(tài)條件：小球藻的生態(tài)條件依種類(lèi)而不同。1、鹽度 海水小球藻對(duì)鹽度的適應(yīng)性很強(qiáng)，可以在河口、港灣、半咸水中生長(zhǎng)繁殖。 2、溫度 一般的小球藻在1036的溫度范圍內(nèi)都能比較迅速地繁殖，最適范圍在25左右。3、光照 最適光照強(qiáng)度約在10000勒克斯左右。4、酸堿度 最適范圍約在pH68之間。小球藻在有機(jī)質(zhì)豐富（特別是氮肥）的水中生長(zhǎng)特別繁茂。四、 微綠球藻微綠球藻（Nannochloropsis oculata）屬綠藻門(mén)，綠藻綱，四胞藻目，膠球藻科。形態(tài)特征：細(xì)胞球形，單獨(dú)或集合。色素體一個(gè)，淡綠色，側(cè)生。眼點(diǎn)淡橘紅色。在

6、生長(zhǎng)良好的情況下，色素體很深，不容易觀察到眼點(diǎn)。沒(méi)有蛋白核。有淀粉粒13個(gè)，明顯，側(cè)生。細(xì)胞壁級(jí)薄，細(xì)胞分裂時(shí)細(xì)胞壁與細(xì)胞之間形成空隙。繁殖方式：進(jìn)行二分裂繁殖，母細(xì)胞分裂成二個(gè)子細(xì)胞，子細(xì)胞由母細(xì)胞的細(xì)胞壁斷裂處脫出，子細(xì)胞附著在細(xì)胞壁上，成為一個(gè)松散的樹(shù)枝狀群體。生態(tài)條件：小球藻的生態(tài)條件依種類(lèi)而不同。1、鹽度 微綠球藻對(duì)鹽度的適應(yīng)性很廣，可以在436的范圍中生長(zhǎng)繁殖，并可保存在254的水中。 2、溫度 微綠球藻在1036的溫度范圍內(nèi)都能比較迅速地繁殖，最適溫度范圍在25-30。3、光照 最適光照強(qiáng)度約在10000勒克斯左右。4、酸堿度 最適范圍約在pH7.58.5之間。微綠球藻在有機(jī)質(zhì)豐

7、富，特別是氮肥多，氨鹽豐富的水中生長(zhǎng)特別繁茂。五、 塔胞藻塔胞藻在分類(lèi)上屬于綠藻們，綠藻綱，團(tuán)藻目，衣藻科，塔胞藻屬。形態(tài)特征：塔胞藻的藻體多數(shù)梨形、側(cè)卵形，少數(shù)半球形。頂端具一圓錐形凹陷。鞭毛4條由凹陷處生出。杯狀色素體，少數(shù)網(wǎng)狀。有一個(gè)蛋白核，眼點(diǎn)位于細(xì)胞的一側(cè)或無(wú)眼點(diǎn)。單核，位于細(xì)胞的中央偏前端。細(xì)胞不具細(xì)胞壁。塔胞藻易于培養(yǎng)，一般采用扁藻的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)液配方。其耐溫下限比扁藻低。細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)集群上浮，形成如扁藻一般的藻團(tuán)。第二節(jié) 硅藻一、 三角褐指藻三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohlin）在分類(lèi)上屬于硅藻們，羽紋藻綱，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻

8、屬。形態(tài)特征：褐指藻有卵形、棱形和三出放射形三種。這三種不同的形態(tài)可以在不同的生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)化。在正常的培養(yǎng)條件下，主要是三出放射形和少量的棱形細(xì)胞，這二種形態(tài)都沒(méi)有硅質(zhì)的細(xì)胞壁。三出放射形細(xì)胞長(zhǎng)度約為1018微米，棱形細(xì)胞長(zhǎng)約20微米，兩臂末端較鈍。卵形細(xì)胞長(zhǎng)約8微米，寬3微米，只有一個(gè)硅質(zhì)殼面，也沒(méi)有殼環(huán)帶。繁殖方式：一般是通過(guò)細(xì)胞平行分裂形成2個(gè)形態(tài)相同的子細(xì)胞。因?yàn)闆](méi)有硅質(zhì)殼，所以分裂是與一般的硅藻不同，藻體不會(huì)縮小。生態(tài)條件：1、鹽度 廣鹽性，在992鹽度的水中均能生長(zhǎng)繁殖。最適鹽度在2532之間。 2、溫度 在525的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適范圍在1020之間。3、光照 光照強(qiáng)度為1

9、0008000勒克斯范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)繁殖，最適光照強(qiáng)度約在30005000勒克斯之間，在小型培養(yǎng)時(shí)忌陽(yáng)光直射。4、酸堿度 一般在pH710的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適范圍約在pH7.58.5之間。二、 小新月菱形藻小新月菱形藻（Nitaschia closterium minutissima Allen et Nelson）是新月菱形藻的一個(gè)類(lèi)型，俗稱(chēng)“小硅藻”。在分類(lèi)上屬于硅藻門(mén)，羽紋綱，雙菱形目，菱形藻科，菱形藻屬。形態(tài)特征：細(xì)胞紡錘形，中央膨大，兩端漸尖，朝同一方向彎曲成月牙形。細(xì)胞長(zhǎng)度約為1223微米，寬23微米。細(xì)胞中央有一個(gè)細(xì)胞核。2個(gè)色素體，黃褐色，位于細(xì)胞核的兩側(cè)。繁殖方式：行縱分

10、裂繁殖。生態(tài)條件：1、鹽度 廣鹽性，在1861.5鹽度的水中均能生長(zhǎng)繁殖。最適鹽度在2532之間。 2、溫度 在528的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適范圍在1520之間。3、光照 最適光照強(qiáng)度約在30008000勒克斯之間，在小型培養(yǎng)時(shí)忌陽(yáng)光直射。4、酸堿度 一般在pH710的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適范圍約在pH7.58.5之間。三、 角毛藻角毛藻的培養(yǎng)種類(lèi)有牟氏角毛藻、鈣質(zhì)角毛藻、纖細(xì)角毛藻等。在分類(lèi)上屬于硅藻門(mén)，中心綱，盒形藻綱，角毛藻科，角毛藻屬。形態(tài)特征：細(xì)胞小形，細(xì)胞壁薄。大多數(shù)是單個(gè)細(xì)胞，也有數(shù)個(gè)細(xì)胞集成群體的。殼面橢圓形至圓形，中間略突起或少數(shù)平坦。殼環(huán)面呈長(zhǎng)方形至四角形。環(huán)面觀一般細(xì)

11、胞大小是3.454.6微米×4.69.2微米。殼環(huán)帶不明顯。角毛細(xì)而長(zhǎng)，末端尖。培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)常有變化，細(xì)胞中間膨大，角毛縮短或消失。繁殖方式：一般為無(wú)性的二分裂繁殖。環(huán)境不良是可形成休眠孢子，一個(gè)母細(xì)胞形成一個(gè)休眠孢子，也可形成增大孢子。生態(tài)條件：1、鹽度 牟氏角毛藻為沿岸性半咸水種類(lèi)，在2.5635鹽度的水中均能生長(zhǎng)繁殖。最適鹽度范圍低于正常海水鹽度。纖細(xì)角毛藻的最適鹽度在1535之間。 2、溫度 在530的范圍內(nèi)生長(zhǎng)率隨溫度的上升而增加，超過(guò)3則開(kāi)始下降。纖細(xì)角毛藻的最適范圍在2830之間。3、光照 牟氏角毛藻在50025000勒克斯的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適光照強(qiáng)度約在1

12、000015000勒克斯之間。4、酸堿度 一般在pH6.49.5的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適范圍約在pH8.08.9之間。四、 中肋骨條藻中肋骨條藻（Skeletonema costatum）在分類(lèi)上屬于硅藻門(mén)，中心綱，圓篩藻目，骨條藻科，骨條藻屬。形態(tài)特征：細(xì)胞為透鏡形或圓柱形，直徑67微米。殼面圓而鼓起，周緣有一圈細(xì)長(zhǎng)的刺，與鄰細(xì)胞的對(duì)應(yīng)刺相連接組成長(zhǎng)鏈。細(xì)胞核在細(xì)胞的中央。有110個(gè)色素體，但通常是2個(gè)。繁殖方式：一般為無(wú)性的二分裂繁殖。增大孢子圓形，直徑為母細(xì)胞的23倍。生態(tài)條件：1、鹽度 在750鹽度的水中均能生長(zhǎng)繁殖。最適鹽度范圍在1530之間。 2、溫度 在1034的范圍內(nèi)均可生存

13、，最適范圍在2030之間。3、光照 在50010000勒克斯的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適光照強(qiáng)度約在100005000勒克斯之間。4、酸堿度 最適范圍約在pH7.58.5之間。第三節(jié) 金藻一、 球等邊金藻球等鞭金藻（Isocrydid galbana）在分類(lèi)上屬于金藻門(mén)，普林藻綱，等鞭藻科，等鞭藻屬。其中OA-3011是球等鞭金藻的一個(gè)高溫品系。形態(tài)特征：球等鞭金藻細(xì)胞裸露，形狀多變，但大多數(shù)呈橢圓形，幼細(xì)胞有一略扁平的背腹面，側(cè)面觀為長(zhǎng)橢圓形或長(zhǎng)方形。鞭毛2條，等長(zhǎng)，由細(xì)胞前端生出，其長(zhǎng)度為細(xì)胞的12倍。鞭毛基部有液泡。細(xì)胞內(nèi)有一二個(gè)側(cè)生的色素體，其形狀和位置往往隨著細(xì)胞的變化而變化。有一個(gè)細(xì)

14、胞核，通常位于細(xì)胞的中央。細(xì)胞長(zhǎng)4.47.1微米，寬2.74.4微米，厚2.43微米。能活潑游動(dòng)。繁殖方式：主要行無(wú)性二分裂繁殖。環(huán)境不良時(shí)形成特殊的內(nèi)生孢子，環(huán)境變好時(shí)，內(nèi)生孢子分裂成16個(gè)新的藻體放出。生態(tài)條件：1、鹽度 球等鞭金藻OA-3011在純淡水中不能生長(zhǎng)，從鹽度010生長(zhǎng)率急劇上升達(dá)到最高峰，以后直到30，其生長(zhǎng)率幾乎無(wú)變化，超過(guò)30生長(zhǎng)減慢。 2、溫度 球等鞭金藻OA-3011在1035的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適范圍在2028之間。3、光照 球等鞭金藻OA-3011的最適光照強(qiáng)度約在70009000勒克斯之間。4、酸堿度 一般在pH69的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適范圍約在pH7.

15、58.5之間。二、 湛江等鞭金藻湛江等鞭（Isochrysis zhangjiangensis）在分類(lèi)上屬于金藻門(mén)，普林藻綱，等鞭藻目，等鞭藻科，等鞭藻屬。形態(tài)特征：細(xì)胞卵形或球形，大小為67微米×56微米。細(xì)胞表面具有幾層體鱗片，在細(xì)胞前端表面有一些小鱗片。鞭毛2條，等長(zhǎng)，由細(xì)胞前端生出，二條鞭毛之間有一條附鞭。鞭毛基部有液泡。二片周邊色素體呈金黃色，每個(gè)色素體內(nèi)含一個(gè)無(wú)淀粉鞘而僅一層膜包圍的蛋白核。一到幾個(gè)白糖素顆粒位于細(xì)胞中部或前端。繁殖方式：主要行無(wú)性二分裂繁殖。環(huán)境不良時(shí)形成膠群體。生態(tài)條件：1、鹽度 最適鹽度約在22.735.8之間。 2、溫度 在935的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁

16、殖，最適范圍在2532之間，達(dá)到37時(shí)死亡。3、光照 在100031000勒克斯的光照范圍內(nèi)均能正常的生長(zhǎng)繁殖，最適光照強(qiáng)度約在500011000勒克斯之間。4、酸堿度 一般在pH69的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖，最適范圍約在pH7.58.5之間。三、 綠色巴夫藻 綠色巴夫藻（Pavloca viridis）在分類(lèi)上屬于金藻門(mén)，普林藻綱，巴夫藻目，巴夫藻科，巴夫藻屬。形態(tài)特征：綠色巴夫藻無(wú)細(xì)胞壁。正面觀圓形，側(cè)面觀橢圓形至倒卵形。大小為6微米×4.8微米×4.0微米。細(xì)胞中上部生出2條不等長(zhǎng)的鞭毛和一條附鞭。長(zhǎng)鞭毛上有許多小的圓形鱗片覆蓋，長(zhǎng)度是細(xì)胞體長(zhǎng)的1.52倍，短鞭毛光滑，不

17、發(fā)達(dá)，僅0.3微米，向后彎曲成鉤形，位于二鞭毛之間。一個(gè)色素體裂成二大片圍繞著細(xì)胞。細(xì)胞核在細(xì)胞上部。無(wú)蛋白核和眼點(diǎn)。群體細(xì)胞成淡黃綠色至綠色。有微弱趨光性。繁殖方式：行無(wú)性二分裂繁殖。生態(tài)條件：1、鹽度 對(duì)鹽度的適應(yīng)范圍極廣，在580的鹽度范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)，最適鹽度約在1040之間。 2、溫度 適溫范圍廣，在-3不會(huì)凍死，在1035的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)繁殖。從1530生長(zhǎng)率變化很小。3、光照 最適光照強(qiáng)度約在400010000勒克斯之間。第四節(jié) 藍(lán)藻一、 螺旋藻常用于培養(yǎng)的螺旋藻有鈍頂螺旋藻、極大螺旋藻和鹽澤螺旋藻。螺旋藻在分類(lèi)地位上屬于藍(lán)藻門(mén)，藍(lán)藻綱，藻殖段目，顫藻科，螺旋藻屬。形態(tài)特征：藍(lán)藻類(lèi)

18、細(xì)胞無(wú)色素體，色素分布在原生質(zhì)體外部的色素區(qū)，藍(lán)綠色。原生質(zhì)體內(nèi)部有一無(wú)色的中央?yún)^(qū)，類(lèi)似其他藻類(lèi)的細(xì)胞核，但無(wú)核仁和核膜，因此螺旋藻是原核植物。鈍頂螺旋藻為絲狀體，藻絲螺旋狀，無(wú)橫隔壁，藍(lán)綠色。藻絲寬45微米，長(zhǎng)400600微米。藻絲的頂端細(xì)胞鈍圓，無(wú)異形胞。繁殖方式：行無(wú)性二分裂繁殖，繁殖結(jié)果使藻絲長(zhǎng)度迅速增加。鈍頂螺旋藻主要靠藻絲斷裂增加絲狀體的數(shù)量，有時(shí)也形成“藻殖段”，藻殖段細(xì)胞分裂成新的螺旋狀藻絲。生態(tài)條件：1、鹽度 鈍頂螺旋藻原生長(zhǎng)在堿性水中，可以被馴化培養(yǎng)在正常的海水中。 2、溫度 最適范圍在3037之間。3、光照 最適光照強(qiáng)度約在3000035000勒克斯之間。4、酸堿度 最適

19、范圍約在pH8.69.5之間。第五節(jié) 黃藻一、 異膠藻異膠藻（Hdterogloea sp.）在分類(lèi)上屬于黃藻門(mén)，黃藻綱，異囊藻目，異囊藻科，異膠藻屬。形態(tài)特征：異膠藻細(xì)胞多為長(zhǎng)圓形或橢圓形。一塊側(cè)生的黃綠色色素體，幾乎占細(xì)胞的大部分。無(wú)蛋白核。細(xì)胞寬2.54微米，長(zhǎng)44.5微米。繁殖方式：行無(wú)性二分裂繁殖。生態(tài)條件：1、鹽度 在鹽度1331的水中均能正常生長(zhǎng)繁殖，最適鹽度為2029。 2、溫度 一般在835的范圍內(nèi)都能正常生長(zhǎng)，最適范圍在1533之間。3、光照 最適光照強(qiáng)度約在30005000勒克斯之間。4、酸堿度 最適范圍約在pH7.58.2之間。第二章 藻種的分離技術(shù)第一節(jié) 采樣方法水樣

20、可以取自任何有可能生長(zhǎng)所需單胞藻的水體，通常在海岸邊退潮后留下的小水洼中或者在養(yǎng)殖場(chǎng)、鹽場(chǎng)等地方的小水坑中，生長(zhǎng)有適合靜水培養(yǎng)的單胞藻類(lèi)，而且比較純。在實(shí)驗(yàn)場(chǎng)、育苗場(chǎng)的一些水池、水桶中都有可能出現(xiàn)比較純的藻類(lèi)。采樣時(shí)要同時(shí)測(cè)定水樣的溫度和鹽度，供分離、培養(yǎng)時(shí)參考。水樣采回后，進(jìn)行現(xiàn)微鏡檢查，如果需要分離的藻類(lèi)比較多，可以立即進(jìn)行分離。如果在水樣中有需要的藻類(lèi)，但是數(shù)量不多，就要進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，待其繁殖起來(lái)后再分離。預(yù)培養(yǎng)可以用500ml的三角燒瓶，加入150ml的培養(yǎng)液，然后把經(jīng)350目篩絹過(guò)濾的水樣150ml接種進(jìn)去，在一定的溫度和光照下靜止培養(yǎng)，每天搖動(dòng)12次。用作預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液，可選擇各類(lèi)藻

21、類(lèi)通用的培養(yǎng)液配方或者同時(shí)采用幾種不同藻類(lèi)的培養(yǎng)液同時(shí)分別培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液的濃度應(yīng)小些，一般只用原配方的1/2或1/4。如果要分離的藻類(lèi)的最適生長(zhǎng)條件是已知的，那就在其最適的光照和溫度下培養(yǎng)。如果不知其最適生長(zhǎng)條件，那就在人為設(shè)定的條件下培養(yǎng)，以便適應(yīng)應(yīng)用時(shí)的特定環(huán)境。第二節(jié) 分離方法一、 微吸管分離法用直徑0.5厘米、長(zhǎng)35厘米的普通玻璃管，在中央部分加熱，拉長(zhǎng)610厘米，使玻璃管的直徑縮小至0.060.1厘米，把它折斷后即成二個(gè)吸管。把一團(tuán)棉絮塞進(jìn)吸管的寬大一端，然后放入高壓滅菌器中消毒。消毒后，再在酒精燈上加熱吸管的細(xì)端，用鑷子拉成極細(xì)的微管，直徑縮小至0.080.16毫米即可。微吸

22、管在入水的瞬間，因毛細(xì)管的作用會(huì)吸入微量的水。將藻液水樣放在凹玻片上，在顯微鏡下用微吸管仔細(xì)地吸出單個(gè)藻體，滴在載玻片上，在顯微鏡下確認(rèn)是所要分離的單個(gè)藻體后，移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。二、 平板分離法按所要分離的藻類(lèi)的特性，選用合適的培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中加入11.5%的瓊脂，加熱將瓊脂溶化。加熱后要加淡水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分。然后，按照微生物學(xué)中固體培養(yǎng)基的制作方法倒平板、滅菌。在無(wú)菌操作箱中，用接種針蘸取少量藻液，在固體培養(yǎng)基上劃蛇形線，藻細(xì)胞就會(huì)散布在瓊脂培養(yǎng)基的表面。另一種使藻細(xì)胞散布在培養(yǎng)基表面的方法是用醫(yī)用口腔噴霧器，將經(jīng)稀釋的藻液噴在培養(yǎng)基的表面。將接種好的培養(yǎng)皿放在有適合的光照和溫度

23、的地方培養(yǎng)。一般經(jīng)過(guò)十來(lái)天的培養(yǎng)就會(huì)在培養(yǎng)基上長(zhǎng)出相互間隔的藻落。通過(guò)顯微鏡檢查，找出所要的純的藻落，再用已消毒的接種針從培養(yǎng)基上挑取藻體，移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。三、 水滴分離法 先將欲分離的藻液稀釋?zhuān)梦⑽軐⑸倭吭逡何觯卧谳d玻片上，每張載玻片上可以滴數(shù)滴。水滴大小以在低倍顯微鏡下一個(gè)視野能包括整個(gè)水滴為準(zhǔn)。在顯微鏡下逐個(gè)觀察水樣，挑選水滴中只有所要分離的單個(gè)藻體，而沒(méi)有其他任何雜藻或小動(dòng)物的，移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。四、 稀釋分離法用已消毒的試管5支，在第一支試管中加蒸餾水10毫升，第二和第五支試管都加5毫升，用高壓蒸汽消毒，待冷卻后，在第一支試管中滴入混合藻液1滴，充分震蕩，使

24、其均勻稀釋。再用經(jīng)消毒的吸管從第一支吸管中吸取5毫升到第二支吸管中，充分震蕩后再取5毫升到第三支試管中，如此直至第五個(gè)試管。再取5個(gè)已裝有消毒的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，加熱使培養(yǎng)基熔化，待冷卻而尚未凝固時(shí)，分別滴入5個(gè)試管中的藻液各1滴，用力震蕩，使藻液充分混入培養(yǎng)基中。等冷凝后將培養(yǎng)皿放在適合的條件下，直到培養(yǎng)基中出現(xiàn)藻落。在稀釋適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)皿內(nèi)，藻落和細(xì)菌群落會(huì)充分分離。再在無(wú)菌條件下將選取單個(gè)藻落接種到固體培養(yǎng)基的表面，再培養(yǎng)。重復(fù)數(shù)次，直至得到純的藻落。第三章 藻種的保存技術(shù)保存藻種時(shí)可以根據(jù)保種目的和保種條件的不同分別采取不同的保種方法。第一節(jié) 固體培養(yǎng)基保存法此法通常把藻種接種在固體培養(yǎng)基上

25、，在弱光低溫條件下保存，接種一次可以保存半年到一年。保種用的固體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)濃度應(yīng)比正常的液體培養(yǎng)液的高，一般增加一倍。瓊脂量為11.5%。保種用的培養(yǎng)容器可用三角燒瓶、試管和克氏扁瓶。固體培養(yǎng)基分裝滅菌后，冷卻待用。將無(wú)污染的藻種用噴霧法或劃線法接種到固體培養(yǎng)基上，在弱光條件下，讓細(xì)胞在培養(yǎng)基上慢慢地生長(zhǎng)繁殖，可保存半年到一年?？蛇M(jìn)行低溫保存的藻種，最好在低溫環(huán)境中保存。接種后，首先放在光線充足的地方（防止直射光照射），使藻類(lèi)細(xì)胞較快速地繁殖起來(lái)，直到培養(yǎng)基上出現(xiàn)顏色，即可放入冰箱或冷庫(kù)中，一般在5左右的低溫下保存。當(dāng)然，不同的藻種保存的溫度也不盡相同。每天應(yīng)給藻種幾個(gè)小時(shí)的弱光照。此法保存

26、的時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)2至3年。如新月菱形藻可保存34個(gè)月，三角褐指藻可保存25個(gè)月，角毛藻和骨條藻可保存9個(gè)月。第二節(jié) 循環(huán)移養(yǎng)保存法此法采用的容器一般為三角燒瓶（300毫升、500毫升、1000毫升等）和細(xì)口瓶（10000毫升、20000毫升等），將容器、工具消毒后，加入正常濃度的培養(yǎng)液，接種后瓶口用消毒的濾紙包扎，放在適宜的溫度和光照條件下培養(yǎng)。白天搖動(dòng)瓶子數(shù)次。一般510天即可移樣一次。此法簡(jiǎn)單、容易掌握，而且保存的藻種活力強(qiáng)、純度高、數(shù)量大。第四章 單胞藻的豐富培養(yǎng)技術(shù)第一節(jié) 容器、工具的消毒為防止單胞藻在培養(yǎng)過(guò)程中被污染，培養(yǎng)用的容器和工具都必須經(jīng)過(guò)消毒。消毒和滅菌的定義是有區(qū)別的。滅菌是指

27、殺死一切微生物，包括營(yíng)養(yǎng)體和芽孢；消毒則只殺死營(yíng)養(yǎng)體，不殺死芽孢。保種需達(dá)到滅菌的程度，而生產(chǎn)性培養(yǎng)只需消毒就可以了。常用的消毒方法有高溫消毒法和化學(xué)藥品消毒法。一、 高溫消毒法高溫消毒法是利用高溫殺死微生物的方法。不耐高溫的容器如塑料和橡膠制品等不能利用高溫法消毒。1、直接灼燒滅菌 接種環(huán)、鑷子等金屬小工具，試管口、瓶口等可以直接在酒精燈火焰上灼燒滅菌。載玻片、小刀等則最好先蘸酒精，然后在酒精燈火焰上點(diǎn)燃，等器具上的酒精燒完，也就完成了滅菌操作。2、煮沸消毒 把容器、工具放入鍋中，加水煮沸消毒，一般煮沸510分鐘。大型錐形瓶消毒，可在瓶口上放一普通的玻璃漏斗，再在漏斗上放一稱(chēng)量瓶蓋，在錐形瓶

28、內(nèi)加少量淡水，置電爐上加熱煮沸510分鐘，可使整個(gè)瓶壁消毒。消毒完畢即用消毒的紙或消毒的紗布包扎瓶口。此法適合消毒小型的容器工具。如果在水中加1%的碳酸鈉效果更好。3、烘箱干燥消毒 將玻璃容器、金屬工具用清水洗干凈后，放入烘箱。關(guān)閉烘箱門(mén)，打開(kāi)箱頂上的通氣孔，接通電源加熱。當(dāng)溫度上升到120時(shí)，關(guān)閉通氣孔，停止加熱。如果進(jìn)行純培養(yǎng)，容器必須滅菌，當(dāng)溫度上升到105時(shí)，關(guān)閉通氣孔，繼續(xù)加熱至160，保持溫度，恒溫2小時(shí)，然后停止加熱。必須要等到溫度下降到60以下，才能打開(kāi)烘箱門(mén)。4、高溫蒸汽滅菌 AAAAAAA二、 化學(xué)藥品消毒法在生產(chǎn)性大量培養(yǎng)中，大型容器、工具、水泥池等常用化學(xué)藥劑消毒。1、

29、酒精 能使蛋白質(zhì)凝固而起殺菌作用。濃度為70%時(shí)，酒精的殺菌能力最強(qiáng)。酒精消毒常用于中小形容器和工具，方法是用紗布蘸酒精在容器、工具的表面涂抹，幾分鐘后用消毒水沖洗。2、高錳酸鉀 高錳酸鉀又稱(chēng)灰錳氧，紫色針狀結(jié)晶，易溶于水，是一種強(qiáng)氧化劑，能使蛋白質(zhì)變性，殺菌能力很強(qiáng)。高錳酸鉀溶液要現(xiàn)用現(xiàn)配。消毒時(shí)將容器、工具等浸泡在新配的300ppm濃度的高錳酸鉀溶液中5分鐘，然后取出用消毒水沖洗23次。如果是對(duì)玻璃鋼水槽、水泥池等消毒，可以用0.05%濃度的高錳酸鉀溶液撥在池壁上，撥灑幾遍后刷洗池底，10分鐘后再用消毒水沖洗干凈。3、石炭酸 石炭酸主要破壞細(xì)胞膜，并使蛋白質(zhì)變性。消毒按3%5%的比例配成消

30、毒液，把要消毒的容器和工具放在其中浸泡半小時(shí)，再用消毒水沖洗23次。4、鹽酸 取工業(yè)鹽酸1份，加淡水9份，配成10%的鹽酸溶液。容器、工具放入鹽酸溶液中浸泡5分鐘，取出用消毒水沖洗2次。5、漂白粉或漂白液 工業(yè)上用的漂白粉一般含有效氯30%35%，消毒時(shí)配成含有效氯為0.01%0.03%的溶液，把容器、工具在溶液中浸泡半小時(shí)再用消毒水沖洗34次即可。第二節(jié) 培養(yǎng)用海水的消毒消毒海水時(shí)可根據(jù)培養(yǎng)的目的和方式選用以下方法之一。1、加熱消毒法 經(jīng)沉淀、過(guò)濾的海水，一般加溫至90左右維持5分鐘或達(dá)到沸騰即可。由于海水中的一些對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的有機(jī)物在高溫時(shí)易遭破壞，所以加溫時(shí)間不宜太長(zhǎng)。2、過(guò)濾除

31、菌法 把經(jīng)沉淀的海水先經(jīng)砂濾，把大型生物和非生物雜質(zhì)去除，再用陶瓷過(guò)濾罐過(guò)濾，除去微小生物。3、次氯酸鈉消毒法 按每立方米海水20毫克有效氯的量加入次氯酸鈉溶液，充氣10分鐘后停氣，經(jīng)67小時(shí)消毒后，按每立方米水體25克的量加入硫代硫酸鈉，強(qiáng)充氣46小時(shí)，用硫酸-碘化鉀-淀粉溶液測(cè)試，若無(wú)余氯即可使用。4、紫外線消毒 有成型的紫外線消毒器可供選用。但此法不易殺滅較大的浮游動(dòng)物。最好和過(guò)濾法結(jié)合使用。第三節(jié) 接種接種就是把作為藻種的藻液接入新配好的培養(yǎng)液中，進(jìn)行豐富培養(yǎng)。接種的過(guò)程雖然簡(jiǎn)單，但要注意藻種的質(zhì)量、藻種的密度、接入藻液的數(shù)量以及接種的時(shí)間等問(wèn)題。1、藻種的質(zhì)量 藻種的質(zhì)量對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的

32、影響很大，一般要求藻種無(wú)污染、生長(zhǎng)旺盛、藻液的顏色正常、藻液中無(wú)沉淀、細(xì)胞無(wú)附壁。2、藻種的密度和接種數(shù)量 藻種藻液的密度應(yīng)達(dá)到或接近可以收獲的密度。接種后藻細(xì)胞在新培養(yǎng)液中應(yīng)該達(dá)到較大的密度，這樣有利于細(xì)胞在培養(yǎng)液中形成優(yōu)勢(shì)群體，不易出現(xiàn)污染，縮短培養(yǎng)周期。一般來(lái)說(shuō)小型培養(yǎng)時(shí)藻種液和新培養(yǎng)液的比例為1:21:3，而中繼培養(yǎng)和大量培養(yǎng)時(shí)，其比例可以提高到1:101:20。3、接種的時(shí)間最好在上午的810時(shí)，這個(gè)時(shí)間是藻類(lèi)細(xì)胞代謝最旺盛的時(shí)候。而傍晚到夜間，多種藻類(lèi)有細(xì)胞下沉現(xiàn)象，不宜接種。第四節(jié) 培養(yǎng)一、培養(yǎng)方式 單胞藻的培養(yǎng)方式有多種多樣，可以根據(jù)不同的培養(yǎng)目的和不同的培養(yǎng)條件來(lái)選擇不同的方

33、法。只要是能夠充分滿(mǎn)足單胞藻的生長(zhǎng)條件，在培養(yǎng)期間沒(méi)有污染，便于操作，能達(dá)到培養(yǎng)目的的方法就是可取的方法。常用的培養(yǎng)方法從不同的角度可以大概地進(jìn)行以下分類(lèi)。1、純培養(yǎng)和單種培養(yǎng) 純培養(yǎng)即無(wú)菌培養(yǎng)，是沒(méi)有任何其他一切生物的單種培養(yǎng)。單種培養(yǎng)是不排除細(xì)菌存在條件下的單一藻種的培養(yǎng)。2、充氣培養(yǎng)和不充氣培養(yǎng) 充氣培養(yǎng)一般是在高密度培養(yǎng)時(shí)采用，用充氣的方式補(bǔ)充培養(yǎng)液中的二氧化碳。3、開(kāi)放式培養(yǎng)和封閉式培養(yǎng) 開(kāi)放式培養(yǎng)的容器是敞開(kāi)的，由于有充足的光照和空氣流通，一般來(lái)說(shuō)藻類(lèi)的生長(zhǎng)比較快，但是容易被污染。封閉式培養(yǎng)是將藻類(lèi)培養(yǎng)在封閉的玻璃瓶、透明圓柱形容器、透明塑料薄膜袋等容器中，容器除了充氣管、加液管和

34、藻液抽出管外，不與外界接觸。封閉式培養(yǎng)由于污染少，培養(yǎng)的成功率很高。 4、一次性培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng) 一次性培養(yǎng)是指培養(yǎng)液中的藻類(lèi)長(zhǎng)起來(lái)后一次性采收。如果當(dāng)藻類(lèi)達(dá)到一定的密度時(shí)只采收了一部分藻液，又加入新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，成為半連續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)一般為室內(nèi)的封閉培養(yǎng)，有人工光源，充氣，培養(yǎng)的藻類(lèi)在優(yōu)化的條件下快速生長(zhǎng)繁殖，培養(yǎng)液從一端連續(xù)流入，一定密度的藻液則從另一端連續(xù)流出。連續(xù)培養(yǎng)的流量是可以人為控制的。 5、小型培養(yǎng)和大面積培養(yǎng) 小型培養(yǎng)的目的是為生產(chǎn)性培養(yǎng)提供藻種。一般培養(yǎng)容器為10003000毫升的三角燒瓶，一消毒的白紙或紗布包扎瓶口，一般是不充氣的封閉式一次性培養(yǎng)。比小型培養(yǎng)的規(guī)模大一些

35、的是中繼培養(yǎng)，目的是培養(yǎng)大量的高純度藻種，為生產(chǎn)性培養(yǎng)提供大量的藻種，培養(yǎng)容器的體積在幾升到幾百升之間，一般是封閉式半連續(xù)培養(yǎng)。在大型的玻璃鋼水槽、水泥池中的培養(yǎng)則是生產(chǎn)性的大面積培養(yǎng)，容易污染，往往是充氣的開(kāi)放式一次性培養(yǎng)。二、日常管理培養(yǎng)單胞藻的日常管理包括以下幾個(gè)內(nèi)容。1、攪拌和充氣 通過(guò)攪拌和充氣使空氣中的二氧化碳溶解到培養(yǎng)液中，促進(jìn)藻類(lèi)細(xì)胞的光合作用，另外可以幫助沉底的細(xì)胞上浮獲得光照。在培養(yǎng)中可以根據(jù)具體情況分別采用搖動(dòng)、攪拌或充氣的方法。2、調(diào)節(jié)光照 光強(qiáng)和光周期對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響非常大，培養(yǎng)時(shí)必須根據(jù)培養(yǎng)種類(lèi)對(duì)光照的要求采取擋光、遮光或增加人工光照等措施使培養(yǎng)物得到適合的光照。3

36、、每一種藻類(lèi)都有最適的溫度范圍，為了保證培養(yǎng)藻的快速生長(zhǎng)，必須為其提供適宜的溫度。如是室外的大面積培養(yǎng)，當(dāng)季節(jié)變化，氣溫不適合原來(lái)培養(yǎng)的藻類(lèi)時(shí)，必須更換其他適當(dāng)?shù)姆N類(lèi)。4、注意pH值的變化 隨著藻類(lèi)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的不平衡吸收，培養(yǎng)液的pH值會(huì)發(fā)生變化，有時(shí)這種變化會(huì)在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生。當(dāng)培養(yǎng)液的pH值超出藻類(lèi)的最適范圍時(shí)，就會(huì)抑制藻類(lèi)的生長(zhǎng)。因此，在日常管理中要格外關(guān)注培養(yǎng)液pH值的變化。可以用1當(dāng)量濃度的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值。5、防止污染 在開(kāi)放式培養(yǎng)中，要注意防止污染。三、生長(zhǎng)情況的觀察和檢查在日常培養(yǎng)工作中，必須每天定時(shí)全面地檢查藻類(lèi)的生長(zhǎng)情況。藻類(lèi)生長(zhǎng)的好壞，可以通過(guò)以

37、下觀察得知。1、顏色 顏色的觀察很重要，綠藻類(lèi)生長(zhǎng)繁殖良好時(shí)，隨著密度的增加，培養(yǎng)液由嫩綠到深綠色。三角褐指藻、新月菱形藻正常生長(zhǎng)時(shí)藻液呈褐色，藻體懸浮于水中形成云霧狀水團(tuán)，隨著密度的增加，由淺褐色到深褐色。金藻生長(zhǎng)良好時(shí)呈金褐色。接種后，隨著藻類(lèi)的細(xì)胞濃度逐漸增加，正常情況顏色由淺變深。若顏色由深變淺則可能是由于環(huán)境因子不適宜引起的；若出現(xiàn)其他顏色，如藍(lán)色、黃色、乳白色等，說(shuō)明被污染了。2、運(yùn)動(dòng)和沉淀 具有運(yùn)動(dòng)能力的藻類(lèi)在水中有一定的分布特點(diǎn)。硅藻類(lèi)生長(zhǎng)良好時(shí)會(huì)在水中形成云霧狀水團(tuán)；金藻雖然有鞭毛，但運(yùn)動(dòng)緩慢，一般不會(huì)迅速上浮，而是形成趨光帶，細(xì)胞群成線狀上浮。當(dāng)環(huán)境不適時(shí)，藻類(lèi)會(huì)下沉形成沉

38、淀，當(dāng)環(huán)境變好時(shí)則上浮。如果在環(huán)境條件正常時(shí)藻液大量沉底，出現(xiàn)沉淀，而且經(jīng)過(guò)攪拌后又很快下沉，則是不正?，F(xiàn)象。沉淀藻體的顏色如果保持原色，說(shuō)明還沒(méi)有死亡，有可能恢復(fù)正常生長(zhǎng)。如果藻體變成灰白色，則藻類(lèi)已死亡。造成藻類(lèi)沉淀的原因是多方面的，但主要的原因是環(huán)境不良或營(yíng)養(yǎng)不足使藻類(lèi)的生長(zhǎng)受到抑制。3、附壁 生長(zhǎng)良好的單胞藻不附壁，若附壁則說(shuō)明環(huán)境不適，生長(zhǎng)不良。4、水面出現(xiàn)菌膜說(shuō)明有細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)。第五章 單胞藻的培養(yǎng)液每一種單胞藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求都有其獨(dú)特性，因而需要有特定的培養(yǎng)液配方來(lái)滿(mǎn)足特定藻類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)需求。另外，即使是同一種藻，采取不同的培養(yǎng)方式時(shí)其營(yíng)養(yǎng)鹽的配方也可能是不一樣的。第一節(jié) 培養(yǎng)液配方

39、一般來(lái)說(shuō)，在配制營(yíng)養(yǎng)鹽的海水中已經(jīng)有藻類(lèi)所需的各種營(yíng)養(yǎng)成分。在配制培養(yǎng)液時(shí)只需添加某些在培養(yǎng)中容易缺乏的營(yíng)養(yǎng)元素即可。國(guó)內(nèi)外使用的單胞藻培養(yǎng)液的配方數(shù)量眾多，這里僅介紹一些在生產(chǎn)性培養(yǎng)中常用的配方。一、 海洋單胞藻培養(yǎng)液配方 1、一般用培養(yǎng)液配方NaNO3 0.03克CO(NH2)2 0.03克KH2PO4 0.005克FeC6H5O7(1%溶液) 0.2毫升維生素B1 200微克維生素B12 200毫微克人尿 1.5毫升海水 1000毫升培養(yǎng)綠藻、金藻、硅藻使用，培養(yǎng)硅藻時(shí)添加0.02克/升硅酸鈉。2、綠藻培養(yǎng)液配方2.1 海洋3號(hào)扁藻培養(yǎng)液NaNO3 0.1克K2HPO4 0.01克Fe(SO4)3 (1%溶液) 10滴2Na3C6H5O7.11H2O 0.02克海水 1000毫升 2.2 亞心形扁藻培養(yǎng)液 NaNO3 0.05克KH2P