β-乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究

1、安 徽 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué)畢 業(yè) 論 文（設(shè)計）論文題目 -乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究 姓 名 李 晉 津 學(xué) 號 08118027 院 系 茶與食品科技學(xué)院 專 業(yè) 食品質(zhì)量與安全 指導(dǎo)教師 薛 秀 恒 職 稱 講師 中國·合肥二一二年 六月安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文（設(shè)計）開題報告課題名稱中性蛋白酶水解-乳球蛋白條件的研究課題來源安徽省自然科學(xué)基金學(xué)生姓名李 晉 津?qū)I(yè)食品質(zhì)量與安全學(xué)號08118027指導(dǎo)教師姓名薛 秀 恒職稱講師研究內(nèi)容實驗擬以-乳球蛋白改性及降低-乳球蛋白含量為目標(biāo)，通過中性蛋白酶水解-乳球蛋白的水解條件的單因素實驗及正交實驗，確定出水解-乳球蛋白的最佳酶解

2、條件，并對其酶解產(chǎn)物進行電泳檢測，檢驗酶解程度。研究計劃第一階段（2011/11/022011/12/02）查相關(guān)資料；第二階段（2011/12/022012/01/20）準(zhǔn)備試驗材料做預(yù)備試驗；第三階段（2012/01/302012/03/07）做單因素和正交試驗并取得相關(guān)數(shù)據(jù)；第四階段（2012/04/102012/06/06） 整理分析數(shù)據(jù)并寫論文。特色與創(chuàng)新 運用SAS系統(tǒng)統(tǒng)計正交實驗結(jié)果得出最佳酶解條件，通過SDS-PAGE蛋白電泳證明，-乳球蛋白被酶解為小肽。指導(dǎo)教師意見教研室意見學(xué)院意見主要領(lǐng)導(dǎo)簽名：年 月 日目 錄摘要1一、引言11.1 -乳球蛋白的結(jié)構(gòu)與應(yīng)用11.2 -乳球蛋

3、白的致敏性及其水解改性2二、實驗材料與方法42.1 實驗材料42.2 試劑與儀器設(shè)備42.2.1 試劑42.2.2 主要儀器設(shè)備42.3 實驗方法42.3.1 測定指標(biāo)與方法42.4 試驗方案的設(shè)計62.4.1 溫度對-乳球蛋白水解影響的檢測方法62.4.2 時間對-乳球蛋白水解影響的檢測方法62.4.3 酶添加量對-乳球蛋白水解影響的檢測方法62.4.4 正交實驗72.4.5 電泳實驗7三、 結(jié)果與分析93.1 溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響結(jié)果93.2 時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響結(jié)果103.3 酶添加量對氨基酸態(tài)氮含量的影響結(jié)果103.4 正交實驗結(jié)果113.5 電泳檢測結(jié)果13四、討論14五

4、、結(jié)論15致謝17參考文獻18Abstract20-乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究作者：李晉津 指導(dǎo)老師：薛秀恒（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院 合肥230036）摘要：本實驗以-乳球蛋白為原料，通過單因素與正交實驗，以甲醛滴定法測定蛋白水解后氨基酸態(tài)氮含量，確定中性蛋白酶水解-乳球蛋白的最佳溫度、時間、酶添加量，以實現(xiàn)-乳球蛋白的改性及降解-乳球蛋白。結(jié)果表明，中性蛋白酶水解-乳球蛋白的最佳條件為50水浴溫度下，0.0079g中性蛋白酶水解40分鐘；SDS-PAGE蛋白電泳顯示，-乳球蛋白被酶解為小肽。關(guān)鍵詞：中性蛋白酶；-乳球蛋白；酶解；小肽一、引言1.1 -乳球蛋白的結(jié)構(gòu)與應(yīng)用-乳球蛋白

5、（-lactoglobulin，-Lg）是由乳腺上皮細(xì)胞合成的特有蛋白，普遍存在于馴鹿、豬、馬、羊、貓和狗等多種哺乳動物的乳汁中，但是在單峰駝和人乳中不存在或含量甚微1。牛奶中的-Lg分子質(zhì)量在18 kD左右，等電點為5.3，共由162個氨基酸殘基組成，含有5個半胱氨酸殘基。-Lg由非共價鍵連接的2個單位亞基組成，每個單體含有2個二硫鍵（Cys66-Cys160和 Cys106-Cysl19）和一個自由巰基 （Cysl21）。-Lg在牛奶中主要以二聚體的形式存在，二聚體像一個拉長的橢圓體，長約6.95nm，寬約3.6nm2。-Lg具有緊密的三級結(jié)構(gòu)，單體近似球形，它的三維結(jié)構(gòu)在pH中性時，由8

6、條反平行鏈組成-桶狀結(jié)構(gòu)，有1個+1拓?fù)?，此結(jié)構(gòu)外部有1個含有3個轉(zhuǎn)角的a-螺旋和9條鏈（A、B、C、D、E、F、G、H、I）1。A-D鏈形成一個面，E-H 鏈形成另外一個面。A鏈與其它3條鏈（B、H、I）氫鍵結(jié)合，A鏈和H鏈之間的結(jié)合形成-桶狀結(jié)構(gòu)的閉合，外面有a-螺旋保護-桶狀結(jié)構(gòu)3。EF鏈形成的結(jié)構(gòu)作為結(jié)合位點的“大門”，當(dāng)pH較低時，“大門”關(guān)閉，結(jié)合位點受抑制；當(dāng)pH 較高時，“大門”開放，配體可以與結(jié)合位點結(jié)合。如圖1-1。 圖1-1 -乳球蛋白的三維結(jié)構(gòu)示意圖研究表明，-乳球蛋白中心形成一個疏水性結(jié)構(gòu)，-乳球蛋白具有很強的結(jié)合脂溶性維生素及脂肪酸的能力，可以作為像VA、VE等脂溶

7、性營養(yǎng)物質(zhì)的添加載體，這可用于生產(chǎn)無脂或低脂且富含脂溶性維生素的營養(yǎng)食品。目前，-乳球蛋白的應(yīng)用主要是在食品工業(yè)上，由于其具有多種生物學(xué)活性，同時經(jīng)蛋白酶水解后仍可得到多種生物活性肽，因此被應(yīng)用于食品加工中。-Lg的熱變性與牛奶加工密切相關(guān)，可以利用在不同加熱條件下，-Lg含量的變化規(guī)律區(qū)分不同加工類型的牛奶。國際乳業(yè)聯(lián)合會（IDF）規(guī)定巴氏殺菌乳和高溫巴氏殺菌乳中可溶性-Lg的質(zhì)量濃度應(yīng)分別大于2600mg/L和2000mg/L，UHT乳中可溶性-Lg濃度應(yīng)高于50mg/L4。因此，-Lg可以作為牛奶熱加工程度的評價指標(biāo)。在生奶樣中添加-乳球蛋白，不僅可以增加乳清蛋白的濃度，而且還能推遲UH

8、T乳（瞬時超高溫滅菌乳）的凝集時間。-Lg具有很強的脂肪酸結(jié)合力，一般作為功能性配料使用。由于-乳球蛋白對脂溶性維生素（如VA，VE等）有一定的吸附作用，可作為維生素的載體應(yīng)用在食品加工中。目前，一些生產(chǎn)商已采用熱誘導(dǎo)-乳球蛋白膠來模仿和替代脫脂食品中的動物脂肪5，從而作為脂肪的替代品應(yīng)用在低脂食品的加工生產(chǎn)中。此外，-Lg固有的生物活性，如抗氧化性，可以應(yīng)用于化妝品生產(chǎn)。1.2 -乳球蛋白的致敏性及其水解改性隨著對-乳球蛋白的深入研究，發(fā)現(xiàn)它是嬰兒牛乳過敏癥的主要致敏原。據(jù)報道有0.57.5的嬰兒會發(fā)生對牛乳的過敏反應(yīng)，如濕疹、腹瀉等6。這是由于新生兒的胃腸道通透性較強，可直接吸收-乳球蛋白

9、，從而引起嬰兒的過敏反應(yīng)7。因此消除牛奶中主要致敏原-乳球蛋白的致敏性仍是國際乳制品加工技術(shù)研究的熱點之一。消除-乳球蛋白致敏性的主要措施是將-乳球蛋白過敏原進行降解。目前，對-乳球蛋白過敏原進行降解的方法有加熱、加壓、酶解、化學(xué)改性與發(fā)酵改性等，但對目的蛋白的直接酶解方法以其安全性高、工藝操作簡便且便于控制等優(yōu)點成為大多數(shù)研究者是首選的方法8-10。 蛋白酶是以蛋白質(zhì)一級序列結(jié)構(gòu)中的某一肽鍵為切割位點的，具有專一性與靶向性，每一種蛋白酶在蛋白表面都以不同的肽鍵作為靶點，如果靶點存在于-Lg過敏原表位上，在蛋白酶對蛋白質(zhì)進行水解的過程中，可以靶向地切割過敏原表位的肽鍵，產(chǎn)生氨基酸，消除致敏性1

10、1。Linda利用胰蛋白酶或用胰蛋白酶和胃蛋白酶共同作用水解-乳球蛋白，發(fā)現(xiàn)水解后的-乳球蛋白的過敏性降低，但不會完全消除12。Bernard用胰蛋白酶水解酪蛋白，發(fā)現(xiàn)其可以水解肽鏈第152位，53139位片段，用纖溶酶可以水解酪蛋白的第106209位片段這些多肽片段中包含有過敏性表位，經(jīng)水解后可以使酪蛋白的過敏性降低13。也有研究者對幾種酶的-Lg酶解性能進行了篩選，結(jié)果表明菠蘿蛋白酶與中性蛋白酶降低了-Lg大部分的致敏性，胰凝乳蛋白酶對致敏性的消除效果較好14-15。前期的研究，大多數(shù)是以堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等進行酶解，胃蛋白酶是外肽酶，優(yōu)先選擇苯丙氨

11、酸或酪氨酸殘基的C末端降解，特異性水解疏水鏈端N。外肽酶不能水解分子內(nèi)肽鍵，分子內(nèi)大量的肽鍵得以保存，從而不能有效提高水解度。 中性蛋白酶是內(nèi)肽酶，催化蛋白水解時基團專一性較差，主要催化由疏水性氨基酸的羧基形成的酰胺鍵，水解蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鍵，生成相對分子量較小的多肽。但目前對中性蛋白酶的酶解作用研究甚少，其最佳酶解條件不甚明確，因此，本實驗以牛乳中主要致敏原-乳球蛋白為研究對象，通過中性蛋白酶水解作用的因素研究，確定中性蛋白酶水解-乳球蛋白的最佳酶解條件，增強中性蛋白酶在-乳球蛋白過敏原表位上的識別靶向性，提高中性蛋白酶對-乳球蛋白的脫敏效果，降低-乳球蛋白的致敏性，這對提升乳制品的食用價

12、值具有重要意義，為-Lg 在乳品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。 二、實驗材料與方法2.1 實驗材料-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 sigma公司生產(chǎn)中性蛋白酶（6000活力單位/克） 北京索萊寶科技有限公司2.2 試劑與儀器設(shè)備2.2.1 試劑NaOH 分析純鄰苯二甲酸氫鉀 分析純95%乙醇 分析純酚酞 分析純甲醛溶液 分析純丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺 Beijing solarbio science& technology公司生產(chǎn)尿素（電泳級） biosharp公司生產(chǎn)Tris Base和SDS Amresco公司生產(chǎn)2.2.2 主要儀器設(shè)備核酸蛋白檢測儀 Bibby Scientific LtdP

13、HS-3D型酸度計 金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司SL202N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司EL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠2.3 實驗方法2.3.1 測定指標(biāo)與方法實驗以游離氮含量為指標(biāo)，用甲醛滴定法測定中性蛋白酶水解-乳球蛋白后的氨基酸態(tài)氮含量，以分析水解效果。具體方法為：吸取酶解液20mL加入燒杯中，加60mL純水?dāng)噭?。酸度計測pH，以0.05mol/L NaOH滴定至酸度計指示計為8.2，記下消耗的NaOH溶液的體積。然后向其中加入10.0mL甲醛溶液，滴定至溶液pH為9.2，

14、記下消耗的NaOH體積。同時以80mL純水做空白實驗。記下消耗的NaOH體積V2。氨基酸態(tài)氮含量%= (公式2-1) 式中：V1實驗組在甲醛滴定終點（pH9.2）所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積； V2空白組在甲醛滴定終點（pH9.2）所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積； cNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L； m測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g； 0.014N2的毫摩爾質(zhì)量，g/mmoL。實驗所需溶液配制： (1) -乳球蛋白溶液的配制：稱取50mg的-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，加純水溶解后，定容至50mL容量瓶中，搖勻，制成1mg/mL的稀釋液置4冰箱中備用。 (2) 0.05mol/L NaOH溶液

15、配制：準(zhǔn)確稱取1.0g NaOH，用去CO2蒸餾水定容至500mL容量瓶中。蓋緊膠塞，搖勻，置于廣口瓶中備用。 (3) 0.05mol/L NaOH溶液的標(biāo)定：稱取0.36g鄰苯二甲酸氫鉀（105下烘干）于三角瓶中，倒入50mL去CO2水混勻。向其中加入2滴酚酞試劑。用上述所配的0.05mol/L NaOH溶液滴定至瓶內(nèi)液體為粉紅色，30s不褪色。記下消耗的NaOH溶液的體積V1。平行四組，結(jié)果如表2-1。做空白實驗，記下消耗NaOH溶液體積V2。 計算公式：c(NaOH)= m×100/(V1-V2)×M M=204.22 (公式2-2）表2-1 鄰苯二甲酸氫鉀質(zhì)量m與消

16、耗的NaOH體積V1稱取鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量m(g)實驗組消耗NaOH體積V1(mL)0.360035.500.360335.400.360635.430.360835.45空白組消耗NaOH體積V2=0.020mL將表2-1數(shù)據(jù)帶入公式求得c(NaOH)，取平均值，c(NaOH)=0.04982mol/L，說明上面所配0.05mol/L NaOH溶液符合要求。2.4 試驗方案的設(shè)計 首先，選定酶解反應(yīng)的單因素條件，即溫度、時間、酶添加量，根據(jù)查閱資料在中性蛋白酶最適反應(yīng)溫度上下選定5個水平條件，如表2-2。表2-2 酶解條件單因素實驗水平因素序號溫度()時間(min)酶添加量(g)13030

17、0.002240600.004345900.0064501200.0085551500.0102.4.1 溫度對-乳球蛋白水解影響的檢測方法分別稱取0.006g中性蛋白酶加入2mL配制的-乳球蛋白樣液于5個試管中，標(biāo)號1、2、3、4、5，調(diào)節(jié)水浴溫度30、40、45、50、55，水浴30min，然后沸水浴10min。冷卻后將其定容至100mL，搖勻靜置。吸取20mL于燒杯中，加入60mL純水?dāng)噭?。后按甲醛滴定法操作，記下pH9.2時消耗的NaOH的體積V1 。2.4.2 時間對-乳球蛋白水解影響的檢測方法分別稱取0.006g中性蛋白酶加入2mL配制的-乳球蛋白樣液于5個試管中，分

18、別標(biāo)號1、2、3、4、5，調(diào)節(jié)水浴溫度為45，分別水浴30min、60min、90min、120min、150min，然后沸水浴10min。冷卻后將其定容至100mL，搖勻靜置。吸取20mL于燒杯中，加入60mL純水。后按甲醛滴定法操作，記下pH9.2時消耗的NaOH的體積V1 。2.4.3 酶添加量對-乳球蛋白水解影響的檢測方法分別稱取0.002g、0.004g、0.006g、0.008g、0.010g中性蛋白酶，加入2mL配制的-乳球蛋白樣液于5個試管中，分別標(biāo)號1、2、3、4、5，45條件下水浴30min，然后沸水浴10min。冷卻后將其定容至100mL，搖勻靜置。吸取20

19、mL于燒杯中，加入60mL純水。后按甲醛滴定法操作，記下pH9.2時消耗的NaOH的體積V1。2.4.4 正交實驗在上述單因素水平實驗基礎(chǔ)上，取水解溫度、時間、酶添加量為考察因素，各取三個水平，用L9(33)正交表進行實驗，以氨基酸游離態(tài)氮為指標(biāo)，選出最佳方案。因素水平見表2-3。表2-3 酶解條件正交實驗因素水平序號溫度() 時間(min) 酶添加量(g)140 20 0.004245 30 0.006350 40 0.0082.4.5 電泳實驗聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）是分離蛋白質(zhì)的常用生化方法，樣品的蛋白質(zhì)分子熱變性解聚后與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)

20、合物，復(fù)合物在電泳中的遷移率取決于蛋白質(zhì)的分子大小，使用均勻濃度的SDS-PAGE來分析分子量在15200kDa的蛋白質(zhì)時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)成線性關(guān)系。本實驗采用Tricine-SDS-PAGE方法進行電泳實驗。首先配制儲存液及緩沖液：(1) 3C丙烯酰胺儲存液：將48g丙烯酰胺和1.5g甲叉雙丙烯酰胺溶于重蒸水中至100mL。(2) 5C丙烯酰胺儲存液：用重蒸水溶解47g丙烯酰胺和2.5g甲叉雙丙烯酰胺成100mL溶液。(3) 6C丙烯酰胺儲存液：用重蒸水溶解46.5g丙烯酰胺和3.0g甲又雙丙烯酰胺成100mL溶液。(4) 正極緩沖液(10×)：121.14g Tris溶

21、于400ml重蒸水，用1.0molL HC1調(diào)至pH8.9，定容至500ml。(5) 負(fù)極緩沖液(10×)：將60.55g Tris，89.58g Tficine及5g SDS溶于400ml重蒸水中，加水至終體積為500ml。(6) 凝膠緩沖液的配制：將181.5g Tris，1.5g SDS溶于400ml重蒸水中，用1mol/L HCl滴定至pH8.45，再加水稀釋至500mL。尿素（U）能增強分離效果，致密膠可配成6C+U、5C+U、5C，但經(jīng)研究5C+U制成的聚丙烯酰胺凝膠對特小分子量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分離效果最好16，故本實驗采用5C+U的丙烯酰胺溶液制膠。見表2-4。表2-4 5

22、C+U丙烯酰胺溶液配制組分濃縮膠夾層膠致密膠(5C+U)凝膠緩沖液(3X)0.6mL0.5mL1mL3C凝膠儲存液0.125mL0.5mL/5C凝膠儲存液/1mL尿素/1.08g加水至1.8mL1.5mL3mL操作步驟如下： (1) 灌膠：凝膠制作采用三層不連續(xù)膠的結(jié)構(gòu)，由致密膠、夾層膠、濃縮膠構(gòu)成。每層膠分別加入10L的過硫酸銨和2L的TEMED加速凝膠凝固，然后灌膠，先灌下層的致密膠，再覆以中間的夾層膠，然后鋪濃縮膠。靜置以形成不連續(xù)的梯度凝膠。 (2) 點樣：取10L的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，煮沸5min使蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合變性，小心點入凝膠的點樣孔中。 (3) 電泳：內(nèi)槽加入負(fù)極電泳緩沖液，外槽

23、加入正極電泳緩沖液，形成Trcine-SDS-PAGE電泳系統(tǒng)，以恒定電壓電泳2h（濃縮膠、夾層膠恒定電壓30V，致密膠恒定電壓100V）。(4) 考馬斯亮藍(lán)染色：戴上手套將膠移入一個盛有約20mL考馬斯亮藍(lán)染液的容器內(nèi)，在搖床上緩慢震蕩10-20min。(5) 脫色：棄去染液，將凝膠在水中漂洗數(shù)次。加入約50mL的考馬斯亮藍(lán)脫色液，脫色1h。為了脫色完全，需數(shù)次更換脫色液并震蕩過夜。3、 結(jié)果與分析3.1 溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響結(jié)果圖3-1 溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響由圖3-1可知在研究溫度因素時，在3045范圍內(nèi)，氨基酸態(tài)氮含量隨溫度的升高而增加，在45時水解效果最佳，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)

24、到了31.5%。之后隨著溫度上升，氨基酸態(tài)氮含量反而下降。由此我們可以得出，中性蛋白酶只有在一定的溫度范圍內(nèi)才能保持對乳清蛋白較高的水解活性，溫度過高過低都會對其水解能力產(chǎn)生重要影響，故我們選擇45為最佳酶解溫度。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)開始溫度較低時，酶的活性及水解效果隨溫度的升高而增加，-乳球蛋白的水解效果也不斷增大。當(dāng)溫度持續(xù)升高到超過酶的耐受溫度一定值時，水解的增大已不能補償酶失活對水解造成的負(fù)影響，此時乳清蛋白的水解度下降17-18。因此研究單因素溫度時，我們選擇45為最佳酶解溫度。3.2 時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響結(jié)果圖3-2 反應(yīng)時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響由圖3-2可以看出酶解

25、時間30分鐘時，水解后氨基酸態(tài)氮含量最高，達(dá)到了31.5%，之后隨著反應(yīng)時間的延長，水解后的氨基酸態(tài)氮含量逐漸下降且趨于平穩(wěn)，氨基酸態(tài)氮含量變化不大。分析原因可能是由于酶解時間延長，使得酶活性降低或失活。故實驗結(jié)果顯示水解30分鐘酶解效果最好。而有研究以木瓜蛋白酶組合、中性蛋白酶組合進行-乳球蛋白的酶解試驗，結(jié)果顯示在120min之內(nèi)，水解效果變化不大。因此，本試驗選擇最短的30分鐘作為-乳球蛋白的降解時間19。3.3 酶添加量對氨基酸態(tài)氮含量的影響結(jié)果圖3-3 酶添加量對氨基酸態(tài)氮含量的影響由圖3-3可看出，在酶添加量0.0020.006時，隨著酶量的增加，水解后氨基酸態(tài)氮含量不斷增加，水解

26、效果增強。當(dāng)中性蛋白酶添加0.006g時酶解效果最好，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到了37.62%。此后，繼續(xù)增加酶量，氨基酸態(tài)氮含量下降，酶解效果變差。說明在酶添加量大于0.006g時，-乳球蛋白始終處于過飽和，水解過程中，酶濃度的增大并未明顯增大水解反應(yīng)速度，繼續(xù)增加酶量，游離氨基酸態(tài)氮含量變化不大，逐漸趨于平穩(wěn)。3.4 正交實驗結(jié)果表3-1 酶解條件的正交實驗結(jié)果實驗號溫度()時間(min)酶添加量(g)氨基酸態(tài)氮含量%140200.00435.00240300.00614.00340400.00831.85445200.00634.13545300.00828.88645400.00439.387

27、50200.00841.65850300.00427.13950400.00646.38運用SAS系統(tǒng)分析表3-1數(shù)據(jù)，得到酶解條件最優(yōu)組合10個如下表3-2：表3-2 SAS系統(tǒng)統(tǒng)計結(jié)果 序號X1X2X3Y150400.00790.530636913249.8400.00790.5279286862349.6400.00790.5251532058449.4400.00790.5223104718549.2400.00790.519400484265039.60.00790.516540913749400.00790.516423243850400.00760.515121612949.83

28、9.60.00790.51391428621049.8400.00790.5133787482注：X1、X2、X3分別代表溫度、時間、酶添加量，Y代表氨基酸態(tài)氮含量運行SAS系統(tǒng)分析如圖3-4-1、3-4-2：Y：游離氮 X1：溫度 X2：時間圖3-4-1 溫度與時間的交互作用影響 由圖3-4-1可看出，時間為主導(dǎo)因素。就溫度這一因素看來，氨基酸態(tài)氮含量隨著溫度的升高而增大，在50時達(dá)到最高。就時間因素來看，氨基酸態(tài)氮含量最低點大概在30分鐘左右，當(dāng)反應(yīng)時間小于30分鐘時，氨基酸態(tài)氮含量隨時間的延長而降低。當(dāng)反應(yīng)時間大于30分鐘時，氨基酸態(tài)氮含量隨反應(yīng)時間的延長而增大，在40分鐘時含量達(dá)到最大

29、。Y：游離氮 X1：溫度 X3:酶添加量圖3-4-2 SAS系統(tǒng)運行結(jié)果圖由圖3-4-2可以看出在分析溫度與酶添加量交互作用時，溫度起主導(dǎo)作用，氨基酸態(tài)氮含量隨溫度變化趨勢較大，且隨著溫度的升高而增加，在50時含量最高，達(dá)到50%以上。就酶添加量而言，氨基酸態(tài)氮含量隨酶添加量增減變化不大，相對較低點在酶添加量0.006g左右，添加0.0079g酶時氨基酸態(tài)氮含量最大，故最佳酶添加量為0.0079g。以上兩個圖分析得知在溫度與時間的交互作用中，總體上氨基酸態(tài)氮含量隨溫度升高而增大，50時含量最大，相較而言時間起主導(dǎo)作用，反應(yīng)時間小于30分鐘時氨基酸態(tài)氮含量隨時間延長而降低，大于30分鐘時情況則相

30、反，故選擇氨基酸態(tài)氮含量達(dá)最高值：即反應(yīng)時間40分鐘為最佳酶解時間。溫度與酶添加量相互作用分析時，溫度為主導(dǎo)作用，氨基酸態(tài)氮含量隨溫度升高而增大，50時最大。氨基酸態(tài)氮含量隨酶添加量增減變化不大，添加0.0079g酶時氨基酸態(tài)氮含量最大高。而時間與酶添加量之間無相互作用，說明這兩個條件的交互作用對酶解反應(yīng)無影響。故通過SAS系統(tǒng)分析，得出中性蛋白酶水解-乳球蛋白的最佳酶解條件為50條件下，0.0079g中性蛋白酶水解40min。3.5 電泳檢測結(jié)果 圖3-5 中性蛋白酶酶解-乳球蛋白電泳圖Marker:超低分子量蛋白 L:中性蛋白酶解產(chǎn)物 本文采用“5C+U”丙烯酰胺溶液配成的聚丙烯酰胺凝膠，

31、使丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)度為5.05，分離超低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Marker，可見清晰的5條帶，其分子量依次為為圖3-5中所標(biāo)3.3kD-20.1kD。圖3-5中根據(jù)-乳球蛋白的電泳染色帶的遷移率與超低分子量蛋白Marker遷移率的對比，可以得出-乳球蛋白分子量范圍在14.4-20.1kD之間。L為中性蛋白酶解產(chǎn)物電泳條帶，圖中顯示中性蛋白酶分子量在35-40kD之間，由此得出上面一條帶為中性蛋白酶電泳條帶，下面一條帶說明中性蛋白酶水解-乳球蛋白內(nèi)部的肽鍵，生成約為10kD的小肽，條帶較清晰。四、討論蛋白酶是以蛋白質(zhì)一級序列結(jié)構(gòu)中的某一肽鍵為切割位點的酶，每一種蛋白酶都有各自不同的專一性

32、。在蛋白酶的作用下，將不易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸。關(guān)于-乳球蛋白的酶解，重點主要是降低蛋白的過敏性和改善其營養(yǎng)和功能特性。-乳球蛋白是一種抗酶解性較強的蛋白質(zhì)，一般蛋白酶對其的水解度都在20%左右。Lametti等運用胰蛋白酶或胰凝乳酶分別在55、60、65，中性pH條件下，對牛乳-乳球蛋白進行水解，該研究從-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)變化機理上闡明了水解物的低過敏性是因為-乳球蛋白經(jīng)過酶水解，其中的大多數(shù)引起抗原性因子的消失，從而降低了其免疫反應(yīng)性20。因此，選擇合理的酶、有效控制酶解條件及酶解過程仍是酶法改性的關(guān)鍵。堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等

33、目前都能夠達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)，但是堿性蛋白酶是眾多常見蛋白酶中水解-乳球蛋白效果最好的，單酶水解度可以達(dá)到30%左右。堿性蛋白酶是微生物酶，來源廣泛、活力比較高，它是肽鏈內(nèi)切酶，主要催化由疏水性氨基酸的羧基形成的酰胺鍵，水解蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鍵，能從肽鏈的內(nèi)部將肽鏈切斷，生成中等分子量的肽，再進而對這些肽進行水解生成更小的分子。木瓜蛋白酶對-乳球蛋白的水解最迅速。在加入木瓜蛋白酶后，所有亞基均被迅速降解為小分子肽，這可能是因為木瓜蛋白酶是巰基蛋白酶，而巰基蛋白酶具有較寬的底物特異性，因此幾乎對所有亞基都有作用。胃蛋白酶是外肽酶，優(yōu)先選擇苯丙氨酸或酪氨酸殘基的C末端降解，特異性水解疏水鏈端N。外肽酶

34、不能水解分子內(nèi)肽鍵，分子內(nèi)大量的肽鍵得以保存，從而不能有效提高水解度。本實驗主要研究中性蛋白酶單酶水解-乳球蛋白的條件。單因素實驗中，研究溫度這一因素時，可看出，溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響圖為拋物線式，酶解效果在45時最好，溫度或低或高都會降低酶解效果；反應(yīng)時間為影響因素時，酶解時間30分鐘后，水解后氨基酸態(tài)氮含量最高，達(dá)到了31.5%，之后隨著反應(yīng)時間的延長，水解后的氨基酸態(tài)氮含量逐漸下降且趨于平穩(wěn)，氨基酸態(tài)氮含量變化不大。分析原因可能是由于酶解時間延長，使得酶活性降低或失活。故實驗結(jié)果顯示水解30分鐘酶解效果最好；再看酶添加量這一影響因素，在添加0.006g中性蛋白酶時，酶解效果最好，氨基

35、酸態(tài)氮含量達(dá)到了37.62%。正交實驗結(jié)果顯示溫度與時間之間，溫度與酶添加量之間有相互作用，對酶解效果有影響，而時間與酶添加量之間無相互作用，說明這兩個條件的交互作用對酶解反應(yīng)無影響。通過SAS系統(tǒng)分析，得出中性蛋白酶水解-乳球蛋白的最佳酶解條件為50條件下，0.0079g中性蛋白酶水解40min。高學(xué)飛（2006）研究表明，中性蛋白酶水解乳清蛋白的最佳條件參數(shù)為溫度為50，初始pH值為7.5，加酶量8000u/g蛋白，乳清蛋白濃度為6%。這與本實驗結(jié)果基本一致17-18。本實驗研究的是中性蛋白酶對-乳球蛋白的水解作用，中性蛋白酶是內(nèi)肽酶，催化蛋白水解時基團專一性較差，主要催化由疏水性氨基酸的

36、羧基形成的酰胺鍵，水解蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鍵，生成相對分子量較小的多肽，從而降低-乳球蛋白的致敏性，但這給電泳檢測帶來困難。Tricine-SDS-PAGE中Tricine以陽離子形式存在可以作為拖尾離子，使小分子多肽能夠在濃縮膠中形成盡可能窄的帶可以提高分子質(zhì)量小于20kD蛋白質(zhì)的分辨率，但對于小于10kD的分辨率不佳。為解決此問題，通常會向分離膠溶液中加入甘油或尿素增加丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)度，以增加小分子多肽電泳分離效果。本實驗采用的是添加尿素的方法，尿素可以有效地減少多肽與SDS的結(jié)合量，使得電泳譜帶隨著尿素和SDS的濃度改變，而且尿素的溶解性較好，化學(xué)性質(zhì)受實驗溫度變化的影響較

37、小，有效地避免了由于電泳時間過長而使-乳球蛋白酶解液譜帶彌散現(xiàn)象的發(fā)生。分子質(zhì)量小于10kD的肽類都能可以得到較好的效果。五、結(jié)論通過SAS系統(tǒng)分析正交實驗結(jié)果，中性蛋白酶水解-乳球蛋白過程中，在50溫度條件下，添加0.0079g中性蛋白酶水解40min，酶解效果最好，酶解后可溶性氨基酸態(tài)氮含量得到顯著提高，達(dá)到40%以上。建立了適合于分析-乳球蛋白酶解液的Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳。本文采用“5C+U”丙烯酰胺溶液配成的聚丙烯酰胺凝膠。電泳結(jié)果表明-乳球蛋白分子量在14.4-20.1kD之間，符合其分子量18kD。L為中性蛋白酶酶解產(chǎn)物電泳條帶，中性蛋白酶分子量在35-40kD

38、之間，電泳后-乳球蛋白酶解為約10kD左右的小肽。致謝時光匆匆如流水，轉(zhuǎn)眼便是大學(xué)畢業(yè)時節(jié)，春夢秋云，聚散真容易。離校日期日趨臨近，畢業(yè)論文的完成也隨之進入了尾聲。從開始進入課題到論文的順利完成，一直都離不開老師、同學(xué)、朋友給我熱心的幫助，在這里請你們接受我最真誠的謝意！ 本學(xué)位論文是在我的指導(dǎo)老師薛秀恒老師的細(xì)心指導(dǎo)和耐心幫助下完成的，薛老師是一個知識淵博、和藹可親的人，從課題的選擇到論文的最終完成，薛老師始終都給予了我極大的信心與幫助，細(xì)心解答我的疑問。在此，我衷心的感謝薛老師對我的指導(dǎo)與幫助。其次，我要謝謝我的學(xué)長孫茂忠和徐洪軍。在實驗過程中，他們認(rèn)真的幫助我解決困難，操作中出現(xiàn)問題時積

39、極的協(xié)助我克服，并在論文寫作中給與我寶貴意見；王歡等學(xué)姐教我溶劑的準(zhǔn)確標(biāo)定，及SAS系統(tǒng)分析，讓我了解了更多專業(yè)知識，學(xué)習(xí)了更多操作方法。我只能說，謝謝，謝謝你們的熱情與幫助，我會更加努力。四年的大學(xué)生活真的即將結(jié)束了，安徽，這片寧靜的熱土，在我心里將永遠(yuǎn)保留著一份特殊的感情，親愛的老師、同學(xué)們，我只想說一句：謝謝你們！參考文獻：1 Kontopidis G, Holt C, Sawyer L. Invited review: Beta-lactoglobulin: Bindingproperties, structure, and functionJ. Dairy Sci, 2004, 87

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