微生物檢驗方法驗證方案(9)

1、. 海量資料 超值下載微生物限度檢驗方法驗證方案微生物限度檢查方法（平皿法）驗證方案微生物限度檢查方法驗證方案16微生物限度檢驗方法驗證方案1.適用范圍本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。2.目的通過驗證確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測定 。3.職責項目責任人：負責驗證方案的起草及具體實施。驗證管理員：負責驗證工作的組織、協(xié)調(diào)及管理。QA現(xiàn)場監(jiān)控員：負責驗證實施過程中的監(jiān)督檢查，取樣，確保結(jié)果的可靠性。QC負責人：負責驗證方案中檢驗方法的審核及按照規(guī)定的取樣計劃對標準檢驗操作程序的準確執(zhí)行，負責組織實施。QC檢驗員：負責驗證方案的起草與參與實施，并對所測數(shù)據(jù)準確性負責

2、。質(zhì)量部經(jīng)理：負責驗證方案及報告的審核和批準。4.內(nèi)容4.1.概述通過驗證以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定；確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查。根據(jù)樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方法進行試驗，根據(jù)驗證結(jié)果判斷是否符合驗證標準。若符合，按驗證的方法和條件進行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件，再進行驗證，直至驗證結(jié)果符合設(shè)立的驗證標準。4.2細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證當建立藥品的微生物限度檢查時，應(yīng)進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定。.驗證試驗可與供試品的細菌、

3、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進行。4.2.1.驗證用菌株及菌種要求大腸埃希菌【CMCC（B）44102】、金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】、黑曲霉【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。 大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌，前述菌株作為細菌計數(shù)驗證用菌株；黑曲霉為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌及酵母菌計數(shù)驗證用菌株。驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。4.2.2.驗證菌

4、菌液制備4.2.2.1.大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，3537培養(yǎng)1824小時。取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-610-7，制成每1ml含菌數(shù)50100cfu的菌懸液。4.2.2.2.白色念珠菌菌液制備：接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)2448小時；取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-610-7，制成每1ml含菌數(shù)50100cfu的菌懸液。4.2.2.3.接種黑曲霉

5、的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)57天，加入35ml 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無菌試管內(nèi)，取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-410-6，制成每1ml含孢子數(shù)50100cfu的孢子懸液。4.2.3. 供試液的制備4.2.3.1.無抑菌活性的供試品供試液的制備稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）。固體、半固體、粘稠性供試品供試品： 稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1：10）。4.2.3.2.具有

6、抑菌活性的供試品供試液的制備當供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：培養(yǎng)基稀釋法：取供試液2ml，每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿；或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿，傾注15ml的培養(yǎng)基，測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)，混勻，凝固，培養(yǎng)。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)。計算每1ml供試液的平均菌落數(shù)， 按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù)；控制菌檢查時可加大增菌液的用量。離心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀

7、釋液補至原量。薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。中和法：選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當?shù)膶Π被郊姿?，含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測定。4.2.4. 菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)。采用平皿法，取試驗用的1ml菌液（約50100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。4.2.5.試驗組4.2.5.1.平皿法：取試驗可能用的最低稀

8、釋級1ml供試液和50100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。4.2.5.2.培養(yǎng)基稀釋法（平皿法）：取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液分別注入N個平皿中，每個平皿再注入50100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。4.2.5.3薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。至少要一張膜。4.2.5.4.離心沉淀集菌法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，如供試液含許多藥渣，

9、先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心35分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數(shù)。4.2.6. 供試品對照組取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗組相同）。4.2.7.稀釋劑對照組若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時，應(yīng)增加稀釋劑對照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌，使最終濃度為每1ml 供試液含50100cfu，按試驗組的供試液制備方法和計數(shù)方法計數(shù)。4.2.8.回收率計算4.2.8.1.試驗組回收率計算試驗組的菌回收率試驗組的菌回收率供試品對照組平均菌落數(shù)

10、5;100%菌液組的平均菌落數(shù)4.2.8.2. 稀釋劑對照組回收率計算試驗組的菌回收率稀釋劑對照組平均菌落數(shù)×100%菌液組的平均菌落數(shù)計數(shù)方法驗證至少應(yīng)進行3次獨立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。4.2.8.結(jié)果判斷 在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）70%。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）70%。照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀

11、集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證，使試驗組菌回收率大于70%。4.3. 控制菌檢驗方法驗證當建立藥品的微生物限度檢查時，應(yīng)進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢驗方法應(yīng)進行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。4.3.1.驗證用菌株大腸埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】、乙型付傷寒沙門菌（Salmonella par

12、atyphi B）【CMCC(B) 50094】、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。4.3.2.菌液制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，3537培養(yǎng)1824小時；分別取培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-7，制成每1ml含菌數(shù)10100cfu的菌懸液。4.3.3.陰性菌對照組 設(shè)立陰性菌對照

13、組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。4.3.4.試驗組 4.3.4.1.常規(guī)法大腸埃希菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入大腸埃希菌10100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，3537培養(yǎng)1824小時，取此培養(yǎng)物按微生物限度檢查SOP大腸埃希菌項下規(guī)定檢查。大腸菌群 取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入含供試品1g或1ml

14、、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌10100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，3537培養(yǎng)1824小時，按微生物限度檢查SOP大腸菌群項下規(guī)定檢查。 沙門菌 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加入沙門菌 10100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，3537培養(yǎng)1824小時。按微生物限度檢查SOP沙門菌項下規(guī)定檢查。 銅綠假單胞菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加

15、入銅綠假單胞菌10100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10100cfu，3537培養(yǎng)1824小時。按微生物限度檢查SOP沙門菌項下規(guī)定檢查。 金黃色葡萄球菌 取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10100cfu，3537培養(yǎng)1824小時。按微生物限度檢查SOP金黃色葡萄球菌項下規(guī)定檢查。4.3.4.2. 培養(yǎng)基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用不強的樣品。4.3.

16、4.3. 薄膜過濾法 采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。4.3.4.4. 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心35分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養(yǎng)，本法適用于中度抑菌作用的樣品。4.3.4.5.中和法 在供試品溶液中加入相應(yīng)的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應(yīng)對微生物無毒性，與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應(yīng)對微生物亦無毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。4.3.5.結(jié)果判

17、斷至少應(yīng)進行3次獨立平行試驗。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，照該供試液制備方法和控制菌檢查法進行該供試品控制菌的檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。5.驗證的實施5.1細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證記錄及控制菌檢驗方法驗證記錄(見附件)。5.2.分析數(shù)據(jù)，綜合整個驗證過程，得出驗證結(jié)論。5.3.驗證過程中發(fā)生的異常情況，按照偏差處理程序進行處理。6.相關(guān)文件微生物限度檢查SOP 7.再驗證7.1.藥品的組分發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時。7.2.驗證時檢

18、驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時。微生物限度檢查方法（平皿法）驗證方案目 錄一、 驗證方案的制定二、 驗證方案的起草與審批三、微生物限度檢查方法（平皿法）驗證方案1驗證目的和原理2驗證方法步驟3試驗實施3.1試驗前的準備3.2驗證試驗操作3.3試驗結(jié)果4驗證結(jié)果評價分析5附件微生物限度檢查方法（平皿法）驗證文件一、 驗證方案的制定驗證項目名稱微生物限度檢查方法（平皿法）驗證編號VF-PR-17-A驗證小組組員成員職務(wù)姓名主要工作職責組長方案設(shè)計責任人副組長方案實施負責人組員操作人操作人操作人操作人驗證方案組織實施進度步驟實施日期二、 驗證方案的起草與審批1驗證方案的起草驗證項目名稱微生物限度檢

19、查方法（平皿法）驗證編號VF-PR-17-A起草部門起草人簽名日期生產(chǎn)部年 月 日質(zhì)控部年 月 日2驗證方案的審核與批準驗證方案審核人： 審核日期： 年 月 日驗證方案批準人： 批準日期： 年 月 日三、微生物限度檢查方法（平皿法）驗證方案1驗證目的和原理1.1 驗證目的 為確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌、酵母菌數(shù)的測定，特制定本方案。驗證過程應(yīng)嚴格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進行，若因特殊原因確需要變更時，應(yīng)報驗證委員會批準。1.2 原理通過比較試驗4組中試驗菌的恢復(fù)生長結(jié)果來評價整個檢驗方法的準確性、有效性和重現(xiàn)性。2驗證方法步驟2.1驗證前的準備 進行微生物限度檢查方法（平皿法）驗證前

20、，所有的平皿和稀釋劑都應(yīng)該嚴格按照相關(guān)的滅菌程序消毒，以確保其對試驗的結(jié)果沒有影響。試驗菌應(yīng)包括G-、G+、酵母菌和霉菌類微生物以基本覆蓋樣品中可能存在的微生物。2.2驗證試驗的操作計劃 用3個不同批號產(chǎn)品按照微生物限度檢測方法進行平行試驗，通過計算回收率來判斷微生物限度檢查方法是否對產(chǎn)品有影響。2.3試驗結(jié)果可接受標準 用標準菌株評價方法“尿素維生素E乳膏的微生物限度檢查”對檢品中微生物的抑制性，試驗結(jié)果應(yīng)顯示3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率應(yīng)不小于70%，試驗組的回收率也不低于70%。3試驗實施3.1試驗前的準備3.1.1主要儀器設(shè)備：高壓蒸汽滅菌器、恒溫烘干箱、凈化工作臺、生

21、物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱。3.1.2操作環(huán)境：操作間應(yīng)該安裝空氣除菌過濾層流裝置。環(huán)境潔凈度不應(yīng)低于10000級，局部潔凈度為100級（或防置同等級凈化工作臺）。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng)該保持對環(huán)境形成正壓，不低于4.9pa。3.1.3試驗樣品： 尿素維生素E乳膏：批號 批號 批號 3.1.4稀釋液和試劑： PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 無菌十四烷酸異丙酯 3.1.5器具 無菌培養(yǎng)皿：（直徑90mm） 無菌移液管（5ml）3.1.6驗證用微生物名稱及其編號實驗菌株的來源： 菌株名稱內(nèi)控編號大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉編號由菌名首字母傳代代數(shù)制備日期組

22、成3.1.7培養(yǎng)基名稱生產(chǎn)商培養(yǎng)基批號配制日期有效期營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基3.2驗證試驗操作3.2.1試驗菌的制備和稀釋將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種至10ml的無菌營養(yǎng)肉湯中在3035下培養(yǎng)1824小時，將白色念珠菌接種至良馬丁流體培養(yǎng)基中，2328下培養(yǎng)2448小時。將黑曲霉接種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，在2328下培養(yǎng)57天小時。將上述培養(yǎng)物用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌落數(shù)為50100cfu的菌懸液。3.2.2用不同類別的微生物考察供試液及檢驗程序的抑菌性，將試驗分為4組A樣品試驗組 準確取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的

23、適宜容器中，必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖510分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為1：10的供試液。用移液管準確吸取1.0ml供試液至平皿中；并在每個平皿中接種50100cfu試驗菌，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每個試驗菌平行接種2個平皿，按照 平皿法測定其菌數(shù)。B菌液組 在平皿中注入1ml的菌液立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，以測定所加的菌數(shù)。C供試品對照組 取規(guī)定量的供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品的本底菌數(shù)。D 稀釋劑對照組 取相應(yīng)稀釋液1ml加入試驗菌，使最終菌濃度為每ml供試液含50100cfu

24、試驗菌，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌落數(shù)。3.2.3培養(yǎng) 將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在3050下培養(yǎng)48小時將白色念珠菌、黑曲霉在2328下培養(yǎng)72小時，點計菌落數(shù)。并將結(jié)果記錄于附件1。3.3試驗結(jié)果3.3.1稀釋劑對照組菌的回收率接入菌種尿素維生素E乳膏批號菌落計數(shù)（cfu/皿）回收率稀釋劑對照組菌液組大腸埃希菌平均值金黃色葡萄球平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%。3.3.2試驗組的菌的回收率接入菌種尿素維生素E乳膏批號菌落計數(shù)（cfu/皿）回收率試驗

25、組供試品對照組大腸埃希菌平均值金黃色葡萄球平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（試驗組的平均菌落數(shù)供試品對照組的平均菌落數(shù)的值）÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%。4驗證結(jié)果評價分析 質(zhì)控部負責各項驗證、試驗結(jié)果記錄，驗證小組根據(jù)驗證、試驗結(jié)果進行評價（附件2），起草驗證報告（附件3），報驗證委員會。（附件4）驗證委員會負責對驗證結(jié)果進行綜合評審，做出驗證結(jié)論，發(fā)放驗證證書（附件5）。對驗證結(jié)果的評審應(yīng)包括：驗證試驗是否有遺漏？驗證實施過程中對驗證方案有無修改？修改原因、依據(jù)以及是否經(jīng)過批準？驗證記錄是否完整？驗證試驗結(jié)果是否符合標準要求？偏差及對

26、偏差的說明合理？是否需進一步補充試驗？5附件附件1產(chǎn)品試驗組的微生物生長檢查記錄：菌種名稱產(chǎn)品試驗組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉供試品對照組的微生物生長檢查記錄菌種名稱供試品對照組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉稀釋劑照組的微生物生長檢查記錄菌種名稱陽性對照計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌液組菌種名稱陽性對照計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉測試人/測試日期： 復(fù)核人/復(fù)核日期：附件2驗證結(jié)果評價表驗

27、證名稱微生物限度檢查方法（平皿法）驗證編號VF-PR-17-A驗證結(jié)果評價及建議確認驗證小組： 年 月 日附件3驗證報告年 月 日至 年 月 日，驗證小組根據(jù)批準的編號為“VF-PR-17-A”的微生物限度檢查方法（平皿法）驗證文件對微生物限度檢查法進行了相關(guān)的一系列驗證工作，達到了預(yù)期效果，滋將有關(guān)事項說明如下：驗證方案在實施過程中未做修改；驗證方案各項性能指標在驗證中未作變動，誤差在允許范圍內(nèi)；驗證過程中結(jié)果符合規(guī)定要求，記錄完整屬實；驗證結(jié)果符合設(shè)計要求和GMP原則要求，可以投入使用。以上情況，請驗證委員會審批！ 驗證小組 年 月 日附件4試驗報告審批表驗證名稱微生物限度檢查方法（平皿法

28、）驗證編號VF-PR-17-A驗證內(nèi)容審閱會簽質(zhì)量部審核人： 年 月 日驗證委員會意見： 批準人： 年 月 日附件5上海安都藥業(yè)有限公司驗 證 格 證 書 編號：VF2005017項目名稱：微生物限度檢查方法（平皿法）驗證根據(jù)我國藥品GMP規(guī)范要求，依據(jù)我廠驗證管理制度，經(jīng)對該項目進行驗證，結(jié)果符合要求。 特發(fā)此證。有效期：自 年 月 日至 年 月 日簽發(fā)人： 年 月 日微生物限度檢查方法驗證方案 編碼：表一、驗證方案的起草與批準1.驗證方案起草 起草人： 起草時期： 年 月 日2.驗證小組成員： 3.驗證方案審核部門審核人日 期生產(chǎn)部生產(chǎn)車間QCQA4.驗證方案批準 批準人： 批準日期：二、

29、驗證方案1.驗證目的和原理1.1驗證目的為確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌、酵母菌數(shù)的測定，特制定本方案。驗證過程應(yīng)嚴格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進行，若因特殊原因確需要變更時，應(yīng)報驗證委員會批準。1.2原理通過比較試驗4組中試驗菌的恢復(fù)生長結(jié)果來評價整個檢驗方法的準確性、有效性和重現(xiàn)性。2.驗證方法步驟2.1驗證前的準備：進行微生物限度檢查方法驗證前，所有的平皿和稀釋劑都應(yīng)該嚴格按照相關(guān)的滅菌程序消毒，以確保其對試驗的結(jié)果沒有影響。試驗菌應(yīng)包括G、G+、酵母菌和霉菌類微生物以基本覆蓋樣品中可能存在的微生物。2.2驗證試驗的操作計劃：用3個不同批號產(chǎn)品微生物限度檢測方法進行平行試驗，通過計算

30、回收率來判斷限度檢查方法是否對產(chǎn)品有影響。2.3試驗結(jié)果可接受標準：用標準菌株評價方法“ ”的微生物限度檢查對檢品中微生物的抑制性，試驗結(jié)果應(yīng)顯示3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率應(yīng)不小于70%，試驗組回收率也不低于70%。3.試驗實施3.1試驗前的準備3.1.1主要儀器設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌器、凈化工作臺。3.1.2操作環(huán)境：操作間應(yīng)該安裝空氣除菌過濾層裝置。環(huán)境潔凈度不應(yīng)低于10000級，局部潔凈度為100級（或放置同等級凈化工作臺）。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng)該保持對環(huán)境形成正壓，不低于4.9pa。3.1.3試驗樣品： 批號： 批號： 批號：

31、3.1.4培養(yǎng)基：培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基批號配制日期有效期至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3.1.5稀釋液：PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液以上經(jīng)115高壓蒸汽滅菌30min。3.1.6驗證用微生物名稱及其編號 實驗菌株的來源： 菌株名稱內(nèi)控編號大腸埃希菌CMCC(B) 44102Ec-金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26003Sa-枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63501Bs-白色念珠球菌CMCC(F) 98001Ca-黑曲霉CMCC(F) 98003An-編號由菌名首字母傳代代數(shù)制備日期組成。3.1.7器具：無菌薄膜過濾器：（孔徑0.45um直徑50mm）

32、、無菌移液管（5ml）4.驗證方法4.1菌液的制備將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種至10ml的無菌營養(yǎng)肉湯中在3035下培養(yǎng)1824小時，將白色念珠菌接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基中，在2328下培養(yǎng)2448小時。將黑曲霉接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基中，在2328下培養(yǎng)57天。將上述培養(yǎng)物用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌落數(shù)為50100cfu的菌懸液。4.2實驗方法供試液的制備：取樣品10g（ml）加入無菌PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖使分散均勻，或用勻漿儀混勻，制成1：10均勻的供試液。A樣品試驗組取1：10供試品（相當于1g或1ml供試品）1ml，及各5010

33、0cfu的試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基；白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。B菌液組取上述制備菌液各1ml注入平皿中，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌加入肉湯瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌、黑曲霉加入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。C供試品對照組取上述1：10供試液1ml注入平皿中，分別傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。D稀釋劑對照組取PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液各1ml及各50100cfu的試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基；白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。4.3培養(yǎng) 將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在3035下培養(yǎng)48小時，將白色念珠菌、黑曲霉在2328下培養(yǎng)72小時，點計菌落數(shù)。5.試驗結(jié)果5.1產(chǎn)品試驗組微生物生長檢查情況： 批號： 菌種名稱產(chǎn)品試驗組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉5.2供試品對照組微生物生長檢查情況： 批號： 菌種名稱供試品對照組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉5.3稀釋劑對照組微生物生長檢查情況： 批號： 菌種名稱稀釋劑對照組計