分子克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作手冊2005

1、分子克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作手冊2005生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院課程簡介分子克隆技術(shù)是指DNA的無性繁殖技術(shù)。分子克隆技術(shù)課程主要是針對生物技術(shù)專業(yè)、生物科學(xué)專業(yè)、生命科學(xué)與技術(shù)基地班本科生及生物學(xué)類專業(yè)研究生而開設(shè)的實(shí)驗(yàn)課。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆和分子雜交兩大部分：分子克隆技術(shù)：DNA重組技術(shù)是分子生物學(xué)的核心內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)利用質(zhì)粒載體克隆外源DNA片段，通過這個實(shí)驗(yàn)大家可以掌握質(zhì)粒載體的抽提、外源DNA的準(zhǔn)備、酶切、連接及感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以及陽性克隆子的鑒定和驗(yàn)證等。分子雜交技術(shù)：實(shí)驗(yàn)室常用的分子雜交技術(shù)主要有Southern blotting，N

2、orthern blotting，Western blotting及Dot blotting等。Southern blotting是通過用一種或多種限制性內(nèi)切酶消化基因組或其它來源的DNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離酶切所得的片段，隨后DNA在原位發(fā)生變性并從凝膠轉(zhuǎn)移到一固相支持物上（硝酸纖維素膜或尼龍膜）。DNA轉(zhuǎn)移至固相支持物的過程中各DNA的相對位置保持不變，用一定方法(如放射性同位素)標(biāo)記的DNA探針與固著在膜上的DNA 雜交，經(jīng)X-光片自顯影顯現(xiàn)出與探針DNA互補(bǔ)的DNA電泳條帶的位置，然后進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)要求掌握植物總DNA的抽提、質(zhì)量檢測、限制性內(nèi)切酶操作、DNA的瓊脂糖凝膠電

3、泳、轉(zhuǎn)膜、探針的制備、同位素操作等方面的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在轉(zhuǎn)錄水平上研究和了解基因的表達(dá)與調(diào)控是分子生物學(xué)和基因操作的重要內(nèi)容。為讓學(xué)生初步了解有關(guān)RNA的操作過程注意事項(xiàng)，我們還列出Northern blotting的操作步驟以供選擇。目 錄系列一 分子克隆技術(shù)4實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒的制備4實(shí)驗(yàn)二 DNA的瓊脂糖凝膠電泳5實(shí)驗(yàn)三 外源DNA片段在質(zhì)粒載體中的克隆7實(shí)驗(yàn)四 感受態(tài)細(xì)胞的制備9CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)步驟9電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟10實(shí)驗(yàn)五 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定11熱激法轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟：11質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞操作步驟12實(shí)驗(yàn)六 PCR技術(shù)12系列二 South

4、ern雜交技術(shù)14實(shí)驗(yàn)一 植物總DNA的快速少量抽提（CTAB法）14實(shí)驗(yàn)二 總DNA質(zhì)量檢測及酶切15實(shí)驗(yàn)三 電泳、轉(zhuǎn)膜16實(shí)驗(yàn)四 Southern Blotting18系列三 Northern Blotting24實(shí)驗(yàn)一 RNA Extraction (mini prep)24實(shí)驗(yàn)二 RT-PCR (Reverse transcription PCR)26實(shí)驗(yàn)三 RNA的電泳，轉(zhuǎn)膜和雜交28附錄 試劑配方29一 細(xì)菌培養(yǎng)試劑30二 質(zhì)粒抽提試劑30三 DNA操作試劑31四 RNA操作試劑34Stock Solution:34Work Solution35系列一 分子克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒的制

5、備質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過程。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諌A裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。實(shí)驗(yàn)材料：含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液。 實(shí)驗(yàn)原理：在pH 12.0 12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分

6、染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。實(shí)驗(yàn)步驟：1. 取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LA培養(yǎng)基上37過夜培養(yǎng)；2. 用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，37搖床250 r/min過夜培養(yǎng)；3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈；4. 加入300 ml溶液 I振蕩打勻，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：

7、應(yīng)徹底打勻沉淀或碎塊）； 5. 加入300 ml溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘；6. 加入300 ml溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀；7. 12000 g離心10分鐘；8. 吸取800 ml上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘；9. 12000 g 常溫離心15分鐘；10. 倒盡上清，加75乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘后倒去上清）；11. 室溫放置或超凈臺上風(fēng)干DNA；12. 加40 ml滅菌超純水或TE溶解；13. 質(zhì)粒、BAC的質(zhì)量檢測，于-20保存。附注：質(zhì)粒檢測電泳

8、檢測：質(zhì)粒電泳一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型吸光值檢測：采用分光光度計(jì)檢測260nm、280nm波長吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.71.9之間，說明質(zhì)粒質(zhì)量較好，1.8為最佳，低于1.8說明有蛋白質(zhì)污染，大于1.8說明有RNA污染。實(shí)驗(yàn)二 DNA的瓊脂糖凝膠電泳帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運(yùn)動稱為電泳。電泳的種類多，應(yīng)用非常廣泛，它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆窄傊悄z電泳的原理，學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的操作。實(shí)驗(yàn)材料：質(zhì)粒DNA、BAC、植物

9、總DNA或它們的酶切產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)原理：在pH值為8.08.3時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時向正極移動。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。實(shí)驗(yàn)步驟：1 用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺上；2 調(diào)整好梳子的高度；3 稱取0.24 g瓊脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至45-50ºC時倒入制膠板中；4

10、凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶；5 將電泳樣品與溴酚藍(lán)混合后將樣品依次點(diǎn)入加樣孔中；pUC18 5µl + ddH2O 3µl + 溴酚藍(lán)2µl 共10µl于0.5ml tube中混合后點(diǎn)樣；6 將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動；7 電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5 µg/ml的溴化乙錠（EB）溶液中染色1015 min，清水漂洗后置于紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果，并照相記錄。附注：1影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：1) DNA分子大小遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數(shù)目）。分子大小相等，

11、電荷基本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）2) 瓊脂糖濃度：logU=logU0 Krt 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，t為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgarose：0.5%： 1-30 kb；0.7%： 0.8-12 kb1.2%： 0.4-7 kb；1.5%： 0.2-3 kb.3) DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。4) 所加電壓：低電壓時，線狀DNA

12、片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm5) 堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 6) 嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)7) 電泳緩沖液 （0.5×TBE）的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。2溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時應(yīng)戴手套，盡量減少臺面污染。3電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenol blue,

13、 Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。實(shí)驗(yàn)三 外源DNA片段在質(zhì)粒載體中的克隆DNA重組技術(shù)包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內(nèi)容。DNA片段的克隆技術(shù)是分子操作的核心部分。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)DNA的酶切、純化及外源片段與載體的連接，將BAC克隆所攜帶的外源DNA酶切片段亞克隆到pUC18載體上。實(shí)驗(yàn)材料：外源片段來自一個含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段；克隆載體為PUC18。實(shí)驗(yàn)原理：限制性內(nèi)切酶可識別特定位點(diǎn)并切割DNA產(chǎn)生

14、粘性末端或平端的外源片段，經(jīng)DNA的純化處理后用于連接反應(yīng)；選擇克隆載體pUC18多克隆位點(diǎn)上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實(shí)現(xiàn)外源片段的克隆。實(shí)驗(yàn)步驟：1 載體pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：（50 ml反應(yīng)體系，用1.5ml tube，冰上操作）：DNA30 mlR.E1 ml10×buffer5 mlddH2O14 ml37反應(yīng)1hr，分別取8 ml 外源片段酶切產(chǎn)物和5 ml PUC18酶切產(chǎn)物于1.0%凝膠檢測酶切是否完全；按25步純化、回收DNA2 加入ddH2O 150 ml （擴(kuò)大體積），加入等

15、體積氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻，12000g離心10 min；3 吸取上清，加1/10體積3M NaAc和兩倍體積無水乙醇，-20放置15分鐘以上；4 12000g 4冷凍離心15分鐘；5 倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后外源DNA溶于10 ml ddH2O（0.5ml tube中），PUC18溶于20 ml ddH2O（1.5ml tube中）；6 按以下反應(yīng)去除載體PUC18的5磷酸基團(tuán)，50反應(yīng)30 min 以上DNA20 mlCIAP（TaKaRa）0.5 ml10 ´ buffer4.0 mlddH2O15.5 ml7 70水浴10 min, 使CIAP失活；8

16、 按25步純化載體，溶于10 ml ddH2O；9 連接反應(yīng)（15 ml體系）：DNA10 mlpUC182.5 ml5 ´ buffer1.5 mlT4 ligase (3U/ml)1 ml 16水浴過夜10 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞11 轉(zhuǎn)化子的鑒定附注：1. 根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮屯庠雌蔚牟煌蛇x用不同的載體，采用不同粘性末端的雙酶切可實(shí)現(xiàn)外源片段的定向克隆。2. 克隆中用到的幾種工具酶：（1）限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的一個活性單位（1U）：指在50 ml反應(yīng)體系中，37下，經(jīng)過1小時的反應(yīng)將1mg DNA完全切割所需要的酶量。限制性內(nèi)切酶的star活性：限制酶在某些條件下使用時對DN

17、A切割的位點(diǎn)特異性可能降低，即可以切割與原來識別的特定DNA序列不同的堿基序列，這種現(xiàn)象叫限制酶的star活性。它的出現(xiàn)與限制酶、底物DNA以及反應(yīng)條件有關(guān)。（2）堿性磷酸酶細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）和牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）都能催化水解DNA、RNA、dNTP和NTP上的5磷酸殘基。比較而言，CIAP更常用，因其可在70 10內(nèi)加熱滅活或通過苯酚抽提而變性失活，同時CIAP的活性比BAP的高1020倍。它主要用于：（1）克隆時去除載體的5-P，以防載體自連；（2）在用 Kinase進(jìn)行5末端標(biāo)記前，去除DNA的5-P。（3）連接酶體外催化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種酶：大腸桿菌連接酶和T4噬

18、菌體連接酶，但幾乎在所有的克隆中T4噬菌體連接酶都是首選的酶，因其能在正常的反應(yīng)條件下能有效的將平端連接起來。3. 氯仿對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時需戴手套、安全鏡并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。苯酚是強(qiáng)腐蝕劑，能引起嚴(yán)重?zé)齻?。操作時應(yīng)戴手套、安全鏡、穿防護(hù)服，并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)四 感受態(tài)細(xì)胞的制備體外連接的DNA重組分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能大量增殖。為了提高受體菌攝取外源DNA的能力，提高轉(zhuǎn)化效率以獲得更多的轉(zhuǎn)化子，人們摸索出了不同的方法處理細(xì)菌，使其處于感受態(tài)。目前主要采用電轉(zhuǎn)化法和CaCl2法將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中，并需要相應(yīng)地制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)

19、細(xì)胞和CaCl2感受態(tài)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)感受態(tài)細(xì)胞的制備過程實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌菌株DH5a或DH10B實(shí)驗(yàn)原理：電轉(zhuǎn)化法是利用瞬間高壓在細(xì)胞上打孔，因而需用冰冷的超純水多次洗滌處于對數(shù)生長前期的細(xì)胞，以使細(xì)胞懸浮液中應(yīng)含有盡量少的導(dǎo)電離子。轉(zhuǎn)化效率為1091010 轉(zhuǎn)化子/µg DNA；對于熱激法，是利用冰冷的CaCl2處理對數(shù)生長期的細(xì)胞，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)”，易于攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化效率為106 107轉(zhuǎn)化子/µg DNA。CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)步驟1 前夜接種受體菌（DH5a或DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37搖床培養(yǎng)過夜（約16小時）；2

20、 取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中，在37搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時（250-300rpm）；3 將0.1M CaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作4 吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；5 4下3000 g冷凍離心5分鐘；6 棄去上清，加入100ml預(yù)冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；7 4下3000 g冷凍離心5分鐘；8 棄去上清，加入100ml預(yù)冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸?。? 細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保

21、護(hù)劑（15% - 20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫?0）。電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟1. 前夜接種受體菌（DH5a或DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37搖床培養(yǎng)過夜；2. 取2ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200ml LB培養(yǎng)基中，在37搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD6000.6（約2.5-3小時）；3. 將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺和冰上操作4. 吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；5. 4下3000g冷凍離心5分鐘；6. 棄去上清，加入1500ml冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??；7. 4下3000g冷凍離心5

22、分鐘8. 棄去上清，加入750ml冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??；9. 4下3000g冷凍離心5分鐘10. 加入20ml冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??；11. 立即使用或迅速置于-70ºC超低溫保存。附注：影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實(shí)際操作過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)：1) 細(xì)菌的生長狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細(xì)胞（一般通過檢測OD600來控制。DH5a菌株OD600為0.5時細(xì)胞密度是5×107/ml）；2) 所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；3) 經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞，在低溫條件下

23、，一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加，24小時達(dá)到最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的）；4) 化合物及無機(jī)離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；5) 所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；6) 質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA；7) 一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比；實(shí)驗(yàn)五 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

24、到感受態(tài)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作。可以采用多種方法篩選和鑒定目的克隆。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諢峒しɑ螂娹D(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子的鑒定方法。實(shí)驗(yàn)材料：外源片段與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)原理：（1）熱激法：大腸桿菌在0 CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。（2）電轉(zhuǎn)化法：外加于細(xì)胞膜上的電場造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定

25、，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，也有利于孔DNA等大分子進(jìn)入。同時DNA在電場中形成的極性對于它運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞也是非常重要的。熱激法轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟：1 制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250ml LA培養(yǎng)基中250 ml Amp（100mg/ml），250 ml X-gal (20mg/ml)，25 ml IPTG (200mg/ml)，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；2 取出3管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；3 每100 ml感受態(tài)細(xì)胞加入約20ng質(zhì)粒DNA，3管分別加連接產(chǎn)物、標(biāo)準(zhǔn)超螺旋質(zhì)粒DNA（陽性對照）及不加入任何DNA（陰性對照），用移液器輕輕吸打均勻，在冰上放置30分鐘；4

26、熱擊：將離心管放置42水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動離心管；5 冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置12分鐘；6 復(fù)蘇：每管加400 ml SOC培養(yǎng)基，在37搖床溫和搖動溫育45分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇；7 布皿：取適當(dāng)體積均勻涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；8 培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37培養(yǎng)1216小時 即可觀察到藍(lán)白相間的菌落（其中白色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍(lán)色菌落是載體自連的轉(zhuǎn)化子）質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞操作步驟1 制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250ml LA培養(yǎng)基中250 ml Amp（100mg/ml），250 ml X-gal (20mg/ml)

27、，25 ml IPTG (200mg/ml)，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；2 取出制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；3 每管感受態(tài)細(xì)胞加入1ml連接產(chǎn)物，用移液器輕輕吸打均勻，置冰上；4 電轉(zhuǎn)化儀選擇1800V作為輸出電壓；5 將要轉(zhuǎn)化的混合物加入預(yù)冷的1 mm的電轉(zhuǎn)化杯中，立即按下按紐電擊；6 立即加1ml SOC培養(yǎng)基到轉(zhuǎn)化杯中重懸細(xì)胞；7 將細(xì)胞轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)管中37ºC培養(yǎng)1小時；8 吸取合適體積的菌液涂布已倒好的選擇培養(yǎng)基平板；9 37ºC培養(yǎng)過夜，觀察結(jié)果。附注：1 利用氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子時，用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪平板的密度要低（90mm平板上不得超過105個菌落），同

28、時37培養(yǎng)不應(yīng)超過20小時，具氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體可將b內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍的抗生素，從而導(dǎo)致對氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)。2 鑒定轉(zhuǎn)化子中是否含有外源DNA片段常用的方法有：1) a互補(bǔ)；2) 雜交篩選；3) 插入失活（一些老質(zhì)粒如pBR322等）;4) 小量提取質(zhì)粒酶切檢測、PCR檢測實(shí)驗(yàn)六 PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中的常用技術(shù)之一。PCR具有反應(yīng)快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誔CR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過程實(shí)驗(yàn)材料：轉(zhuǎn)

29、基因水稻葉片總DNA，外源基因的特異引物實(shí)驗(yàn)原理：PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為變性、退火、延伸三步，經(jīng)過一定的循環(huán)，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)步驟：1. 調(diào)整模板濃度至10 ng/ml；2. 按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，加一滴礦物油，離心5秒Template DNA2 ml （20 ng）10´ buffer2.0 mlMgCl2（25mM）1.5 mlPrimer F (10µM)0.2 mlPrimer R (10µM)0.2 m

30、ldNTPs（2mM）2.0 mlTaq（5U/ml）0.2 mlAdd ddH2O to 20 ml3PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：95 3' 1 cycle94 1' 55 1' 72 1'30" 35 cycles72 8' 1 cycle4 forever4檢測：加2 ml溴酚藍(lán)，混勻，短暫離心，取15 ml反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳；5在1%的瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳；EB染色，紫外觀察。附注：1 引物設(shè)計(jì)應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；2 PCR反應(yīng)的各種成份不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；3 根據(jù)引物的

31、Tm值和擴(kuò)增片段長度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；4 注意分析電泳檢測PCR產(chǎn)物時出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。系列二 Southern雜交技術(shù)Southern雜交，通過用限制性內(nèi)切酶消化基因組或其它來源的DNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離酶切所得的片段，隨后DNA在原位發(fā)生變性并從凝膠轉(zhuǎn)移到一固相支持物上（一般是硝酸纖維素膜或尼龍膜）。DNA轉(zhuǎn)移至固相支持物的過程中各DNA的相對位置保持不變，用一定方法（如放射性同位素）標(biāo)記的DNA探針與固著在膜上的DNA 雜交，經(jīng)X-光片自顯影顯現(xiàn)出與探針DNA互補(bǔ)的DNA電泳條帶的位置。實(shí)驗(yàn)一 植物總DNA的快

32、速少量抽提（CTAB法）DNA分子是分子生物學(xué)研究的基本材料，依不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目刹扇〔煌某樘岱椒ǐ@取數(shù)量和質(zhì)量不等的DNA。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?了解植物DNA抽提的主要方法，掌握CTAB法快速抽提水稻DNA。實(shí)驗(yàn)材料及試劑：水稻葉片，1.5×CTAB，氯仿/異戊醇(24:1)，95%乙醇或無水乙醇等實(shí)驗(yàn)原理：植物DNA的抽提常采用兩種方法：（1）SDS法： 離子去污劑，過程長，純度高；（2）CTAB法：該方法簡便、快速，DNA產(chǎn)量高(純度稍次，適用于一般分子生物學(xué)操作)。 CTAB是一種非離子去污劑，植物材料在CTAB的處理下，結(jié)合65°C水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA被釋放

33、出來。CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（>0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復(fù)合物再用7075%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。再經(jīng)過氯仿/異戊醇(24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來純化DNA，最后經(jīng)異丙醇或乙醇等DNA沉淀劑將DNA沉淀分離出來。實(shí)驗(yàn)步驟：1. 采集適量幼嫩葉片，用液N2研成粉末，0.4 g裝入1.5ml離心管中（-20預(yù)冷）。2. 預(yù)熱1.5×CTAB到95，加1ml到裝有葉片粉末的離心管中

34、，混勻（防止凍融）。3. 立即置于65水浴30min，每5分鐘，上下顛倒1次。4. 12000g離心5分鐘。5. 吸取上清液約600µl，加入等體積（600µl）氯仿/異戊醇(24:1)，上下顛倒數(shù)次，至下層液相呈深綠色為止。6. 12000g離心5分鐘。7. 取450µl上清于一新1.5ml離心管，加入1ml 95%乙醇和45µl 10M NH4AC），混勻，室溫放置10min。8. 12000 g離心10min，去上清，用75% EtOH浸洗沉淀，自然干燥約30 min。9. 加入50µl 1/10 TE或無菌水（含20µg/RN

35、ase），置于4過夜，待DNA溶解后，檢測DNA濃度及質(zhì)量。注意事項(xiàng)：1盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質(zhì)多，必須用10 mM的-ME處理2研缽預(yù)凍，粉末至加CTAB前不要融化324:1的氯仿/異戊醇抽提時動作應(yīng)輕柔，轉(zhuǎn)移用的槍頭最好是剪寬了的4所用試劑必需滅菌，手套思考：（1）DNA降解的可能原因（2）提高DNA產(chǎn)量的措施實(shí)驗(yàn)二 總DNA質(zhì)量檢測及酶切實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私庹莆諜z測DNA 質(zhì)量的方法以及DNA定量的方法；了解影響DNA在瓊脂糖凝膠中泳動速率的因素；訓(xùn)練DNA的瓊脂糖凝膠電泳操作及DNA的限制性內(nèi)切酶操作。實(shí)驗(yàn)原理：參見系列一中實(shí)驗(yàn)二；限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)：見“基因操作原理”。實(shí)驗(yàn)材料及

36、試劑：水稻總DNA或BAC克隆DNA，瓊脂糖，限制性內(nèi)切酶DraI，EcoRI，EcoRV，HindIII實(shí)驗(yàn)步驟：1取10µl DNA于0.8% 凝膠檢測；2將DNA調(diào)節(jié)濃度至300-400 ng/µl ；2仔細(xì)閱讀將所用的任何一種酶產(chǎn)品說明書，熟悉反應(yīng)條件及酶切的貯存濃度（10U-50U/µl）廠家配套試劑；3計(jì)算據(jù)反應(yīng)條件所需要的各種試劑準(zhǔn)確用量：（0.5 ml tube中）DNA(3-5µg)10µl10´ buffer reaction1.5µlEnzyme (15 U/µl)0.8µl（冰上）

37、ddH2O 2.7µl混勻，短暫離心；437溫浴1-2 hrs (純DNA)或10 hrs（粗制DNA）；5加入上樣緩沖液終止酶切反應(yīng)，也可65加熱10 min使酶變性失活；6電泳檢測酶切效率：每個樣品取1/10量用瓊脂糖電泳檢測，制膠及點(diǎn)樣方法同上。結(jié)果分析若水稻DNA呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片，則酶切效果好，否則需重做； DNA被切爛：DNA降解，重新提DNA；DNA切不動：雜質(zhì)多（多糖，蛋白質(zhì)，酚類，有機(jī)溶劑等），重新純化；若是BAC克隆DNA，酶切后應(yīng)出現(xiàn)多條很清晰的不同大小DNA帶。思考：什么是酶星活性？如何避免？影響酶切效率的因素？EB指示劑原理？實(shí)驗(yàn)三 電泳、轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜是把D

38、NA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物（一般是尼龍膜）上固定，是進(jìn)行各種后續(xù)研究（如RFLP分析，陽性克隆的篩選驗(yàn)證等所有涉及分子雜交的研究）的前提。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誗outhern blotting的原理及操作步驟實(shí)驗(yàn)原理：1. 轉(zhuǎn)膜的方式：向上的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移向下的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移同時向兩張膜轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移真空轉(zhuǎn)移2. 固相支持物的種類及選擇：硝酸纖維素膜：非共價結(jié)合，易脆，易丟失DNA，< 500 bp的DNA無效，轉(zhuǎn)膜前的工作（從提高轉(zhuǎn)膜效率，利于轉(zhuǎn)膜后使用等）尼龍膜（帶正電荷的）高強(qiáng)度，不易破損，具有較大的DNA結(jié)合容量，它能夠吸附變性DNA，核酸以共價結(jié)合方式不可逆的結(jié)合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均

39、有同樣吸附DNA功能，無論用哪邊均可以經(jīng)久耐用，可反復(fù)利用10次以上（10-20次），經(jīng)毛細(xì)管（毛細(xì)吸附）作用，把DNA從凝膠上轉(zhuǎn)到膜上。DNA轉(zhuǎn)到膜上是復(fù)制膠上的帶型，在80-100真空干燥2-4 hrs，即可固定DNA。 3. 轉(zhuǎn)移緩沖液（transfer buffer）的選擇：帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強(qiáng)度（SSC），但不能充分發(fā)揮膜潛能；0.4N NaOH，共價結(jié)合DNA是最大優(yōu)點(diǎn)。硝酸纖維膜：高鹽離子強(qiáng)度促進(jìn)DNA與膜結(jié)合（20×SSC），低鹽離子強(qiáng)度導(dǎo)致小片段DNA在轉(zhuǎn)移過程中丟失，pH>9，DNA不能與膜結(jié)合。4轉(zhuǎn)膜時間（duration of transfe

40、r）約12 hrs取決于毛細(xì)管系統(tǒng)，DNA大小，膠厚度(<5 mm)及濃度(<1%)。DNA分子量大小決定時間長短，部分去嘌呤減小DNA，堿轉(zhuǎn)移2hrs大部分結(jié)合到膜。DNA轉(zhuǎn)移的效率較難判斷，只有在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，通過EB染膠，及分子雜交才可以鑒別效率高低，但已無補(bǔ)救措施，因此，每一步應(yīng)嚴(yán)格操作。實(shí)驗(yàn)材料及試劑：酶消化好的DNA樣品，尼龍膜，0.2N HCl，0.4N NaOH等 實(shí)驗(yàn)步驟：1 0.8%瓊脂糖電泳制膠：注意瓊脂糖的質(zhì)量，膠的濃度，厚度（<5mm）及均一性。一般大電泳槽配制250ml 0.8%瓊脂糖凝膠，采用42孔梳子（經(jīng)濟(jì)，高效）制樣，點(diǎn)樣：DNA樣品中指示劑量

41、稍多電泳：一般1-1.5V/cm的電壓， 使DNA遷移到適當(dāng)距離，一般指示劑約移動10-11cm (大電泳槽：40V×12-15hrs，小電泳槽30V×4-5 hrs)2轉(zhuǎn)膜前的準(zhǔn)備：依膠大小每塊凝膠準(zhǔn)備兩張比膠稍大的濾紙（11×12.5 cm），兩張用作鹽橋的濾紙，一張與膠同樣大小的尼龍膜（10×10.5cm），兩個玻璃盤、兩塊有機(jī)玻璃板、一根玻璃棒，比尼龍膜稍大的一疊吸水紙等。3一玻璃盤中加入足量的0.4N NaOH，放上洗凈的玻璃板，按圖示搭制鹽橋(操作示范)。4凝膠的預(yù)處理:a) 從電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當(dāng)大小，切去右上

42、角（最后一個樣品的最前端）作為電泳方向記號b) 把凝膠翻面，放入加有足量的0.2N HCl玻璃盤中，輕輕搖動10min，使指示劑變黃色為止（脫嘌呤）c) 倒去HCl溶液，加蒸餾水漂洗凝膠d) 倒去蒸餾水，加0.4N NaOH中和e) 同時在鹽橋?yàn)V紙上灑些0.4 NaOH，立即將膠放在鹽橋上（忌氣泡）5膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（吸水紙與鹽橋相接）6在膠面上倒足夠量0.4N NaOH，小心放置膜（預(yù)濕0.4N NaOH）使膜覆蓋整塊膠（要求一次成功，不能移動）7膜上放2張濾紙，濾紙大小為15×12cm8放不少于5cm厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約500g的重物，轉(zhuǎn)膜12 h

43、rs左右 9轉(zhuǎn)膜完畢，用2×SSC漂洗膜兩次，各五分鐘。用EB染膠以檢測轉(zhuǎn)移效果。10用兩張濾紙包住膜，置于80-100的真空干燥箱中，干燥2-4 hrs。思考：（1）為什么轉(zhuǎn)膜前要對凝膠預(yù)處理？如何處理？（2）怎樣提高轉(zhuǎn)移效率實(shí)驗(yàn)四 Southern Blotting對于大的基因組，DNA酶切圖譜憑肉眼是分辨不開的（EB染色），因?yàn)榇笮〔坏鹊姆肿映尸F(xiàn)彌散分布，只有借助靈敏的放射性同位素（或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)），將靶DNA在凝膠上（膜上）的帶型通過特定的探針與之雜交，轉(zhuǎn)換成X光片上直觀的帶型，才能進(jìn)行相關(guān)分析。另外如果需要鑒定或?qū)ふ遗c已知DNA同源的DNA片段如：染色體步查、基因組文庫

44、的評價和利用、陽性克隆的分析鑒定、轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)分析等也都需進(jìn)行DNA的分子雜交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆胀凰氐牟僮骷胺雷o(hù)方法；掌握預(yù)雜交、探針的標(biāo)記及分子雜交技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理：依據(jù)堿基配對原則，用放射性同位素標(biāo)記的DNA探針，與固著在膜上的靶DNA雜交，經(jīng)放射自顯影，確定靶DNA的位置。1預(yù)雜交：膜上有許多沒有結(jié)合DNA分子的地方，若不在雜交前用一些封閉劑結(jié)合位點(diǎn)，加入探針后，探針DNA分子將會結(jié)合在這些位點(diǎn)上，導(dǎo)致雜交背景深，預(yù)雜交的目的是用非特異性DNA分子（鮭精DNA）及其它高分子化合物（封閉劑）將待雜交膜中的非特異性位點(diǎn)封閉，從而減少雜交背景。2探針的標(biāo)記：體外標(biāo)記DNA或RNA的方法有多種，

45、如：末端標(biāo)記，隨機(jī)引物標(biāo)記，缺刻平移（nick translation），體外轉(zhuǎn)錄（in vitro transcription）及各類PCR等。這些方法有的是在特定位置標(biāo)記核酸（5或3末端），有的標(biāo)記核酸分子內(nèi)部的多個位點(diǎn)。有的產(chǎn)物是標(biāo)記單鏈，有的產(chǎn)物是標(biāo)記雙鏈。有的方法產(chǎn)生一定長度的標(biāo)記產(chǎn)物，有的得到的是長短不一的標(biāo)記產(chǎn)物。隨機(jī)引物標(biāo)記：在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸通過與單鏈的模板配對可以啟動DNA的合成。如果寡核苷酸序列是不同的（heterogeneous），引物中包含所有可能的隨機(jī)序列（如6堿基引物則有46=4096種），可以與任意模板序列相配對在許多位置形成雜交鏈，四種核苷酸底物

46、中有一種是用同位素標(biāo)記的，因而可產(chǎn)生均勻一致高比活放射性探針。同位素標(biāo)記的探針DNA 的平均長度與引物的濃度成反比， The klenow fragment去除了EColi DNA polymerase I 的5 3的外切酶活性，具有5 3的聚合酶活性及3 5 外切酶活性； Primer：可通過用DNase I消化牛胸腺DNA，DNA合成儀合成或直接從公司購買。同位素標(biāo)記的探針DNA的平均長度與引物的濃度成反比 =k/(lnPc)1/2， Pc是引物的濃度，一般可產(chǎn)生約400-600 bp的標(biāo)記產(chǎn)物。模板DNA：線狀雙連DNA。環(huán)狀DNA用限制性內(nèi)切酶切成線狀，再標(biāo)記。用純化的DNA片段作模板

47、標(biāo)記的探針與用完整的質(zhì)粒作模板比較，可減少背景。dNTPs： 其中一種用放射性同位素標(biāo)記3雜交：將標(biāo)記好的探針，加到雜交液中，在一定（溫度下）條件下，使探針與膜上的DNA雜交。4洗膜：用不同組成及離子強(qiáng)度的（嚴(yán)謹(jǐn)度）溶液，洗去膜上的封閉劑及非特異性雜交的探針實(shí)驗(yàn)材料及試劑：已轉(zhuǎn)移上DNA的尼龍膜，32P標(biāo)記的dCTP，隨機(jī)引物，20×SSC，10%SDS，X-光片，顯影液及定影液等實(shí)驗(yàn)步驟：1. 預(yù)雜交：將尼龍膜在2×SSC中浸濕，放入雜交袋或雜交管中，加入適量雜交液（雜交液浸沒膜），趕氣泡，封口，放入65的雜交箱或恒溫?fù)u床中，預(yù)雜交3個小時以上，一般6-12hrs。2.

48、標(biāo)記探針：反應(yīng)體系：1-2blots(19.5×9.5cm2)DNA100ngDNTP2.0µlRandom primer5.0µlKlenow (1u/µl)1µla- dCTP* 1.0µladd ddH2O to 17.0µl按先將水和DNA 按反應(yīng)體系所需的量取至一1.5毫升離心管中，混勻，短暫離心至管底，放至100干浴中變性10 min，變性探針迅速置于冰浴上5 min，按反應(yīng)體系將反應(yīng)混合液（dNTP，Random primer，Klenow ）加入變性DNA中，在同位素操作臺上，加入32P標(biāo)記的dNTP（a-3

49、2P dCTP*，放射性比活>3000Ci/mmol），30溫育3小時以上。3. 雜交將標(biāo)記好的探針，補(bǔ)加300µl雜交液，100變性（or 0.4N NaOH變性），加入雜交袋（盒）中（忌直接加于膜上）。雜交前作標(biāo)記效率測定，>25%以上可以往下做雜交， 過夜雜交。雜交效率受雜交速率及雜交穩(wěn)定性影響。4. 洗膜：從低嚴(yán)謹(jǐn)度到高嚴(yán)謹(jǐn)度冼膜液（具體情況而定）：1×SSC/0.1%SDS洗膜兩次（冷5min，熱65，15min）®檢測信號強(qiáng)度 ®0.5×SSC/0.1%SDS 熱冼 65, 15min ®依情況可有改動0.2&

50、#215;SSC/0.1%SDS or 0.1×SSC/0.1%SDS。5. 包膜：膜從洗膜液中撈出，在濾紙上晾干，膜表面無可見水膜為止（注意：不能太干，以防探針難以洗脫影響再次使用），用保鮮膜包膜，壓X-光片，置于-20或-70 37天（依據(jù)信號強(qiáng)弱掌握曝光時間）6. 沖洗X-光片在暗室紅燈下取出X-光片，置入顯影液中至雜交帶顯現(xiàn)出來（顯影時間依據(jù)信號強(qiáng)弱及曝光時間長短可由幾秒鐘到2分鐘），轉(zhuǎn)入清水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮（約10分鐘）。自來水沖洗干凈后，晾干，讀片。7. 膜上探針洗脫再次使用膜前，必須洗去上次探針！(1)0.1%SDS，0.1×SSC 10mi

51、n(2)0.1NaOH，0.2%SDS 2-3min(3)0.2M Tris.HCL， 0.2%SDS，0.1×SSC 20min只洗去探針，而不影響膜上的靶DNA（因?yàn)镈NA與膜是共價鍵結(jié)合，而DNA與探針的結(jié)合是氫鍵結(jié)合）。附注：1. 雜交效率的影響因素a) 雜交溫度：雙鏈DNA分子，T=Tm-2025可達(dá)最大雜交率，DNA-RNA雜交分子則低于Tm 值10-15。b) 離子強(qiáng)度(1.5M/L NaCl雜交率最高)c) 雙鏈長度(形成雜交物長度) ：雜交率與雙鏈長度成正比d) 探針的復(fù)雜程度 (重復(fù)性探針可以增加雜交率)e) pH5.0-9.0基本無影響。2. 影響雜交穩(wěn)定性（影

52、響解鏈溫度的）因素a) 離子強(qiáng)度 在0.01-0.4M NaCl之間, 每­10×單價陽離子，Tm­16.6b) 堿基組成 AT<CG（在NaCl溶液中）；c) 去穩(wěn)定劑（destabilizer） DNA-DNA雜交分子，每1%formamide,Tm¯0.6；6M urea可降低Tm30d) 堿基錯配：每 1%的錯配可使Tm降低1e) 雙鏈長度（探針雜交物） >500bp基本無影響3整個實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)：1) 保證轉(zhuǎn)膜質(zhì)量；2) 操作規(guī)范；3) 提高雜交靈敏度（信號強(qiáng)度）；a) 探針量及標(biāo)記量（探針變性）；b) 比活（性）度 >

53、;=108dpm/u(<108弱)；c) 靶DNA量（絕對量，酶切轉(zhuǎn)膜決定；相對量，靶DNA相對于探針過量時，完全配對雜交，探針過剩時，完全配對和非嚴(yán)格的完全配對均有發(fā)生）；d) 有惰性聚合物增加靈敏度；10%(w/v)500,000(mw)dextran sulfate或8%(w/v)PEG6000。對于單鏈探針，可以增加10-fold雜交信號，dsDNA成100-fold地增加雜交信號4) 提高特異性：a) 高鹽溶液促進(jìn)探針與靶序列的堿基配對20×SSC 3M NaCl/0.3M Na3Cib) 雜交后洗膜溫度T®Tmc) 雜交后洗膜液濃度組成，高嚴(yán)謹(jǐn)度洗膜液使不

54、完全配對的雜交失去穩(wěn)定，致使探針脫落d) 雜交時間8hrs 以后，DNA探針逐漸退火，少量自由與靶DNA雜交.e) 探針長度（>1000bp）過長，高嚴(yán)謹(jǐn)度下難洗脫非完全配對雜交探針。4放射性同位素：1) 放射性同位素發(fā)出的射線主要有：a粒子：外照射，一般能量的粒子穿透能力較弱，射程短，危害性小，稍加防護(hù)即可（如手套）；內(nèi)照射，電離密度大，危害大。b粒子：穿透能力比粒子強(qiáng)，外照射危害比粒子大，可引起皮膚的放射損傷。g射線：穿透能力很強(qiáng)，外照射時危害性很大，應(yīng)采取切實(shí)有效的防護(hù)措施。2) 放射性活度及單位：放射性活度A是指一定量的放射性核素在時間間隔dt內(nèi)發(fā)生自發(fā)核衰變數(shù)dN與此時間間隔的

55、比值。即A=dN/dt放射性活度的單位是Becquerel(貝克勒而)，簡稱Bq。1Bq=1個衰變/秒；1居里=3.7×1010Bq其不表示放射出射線的多少（如60Co一個原子衰變防出1個b粒子和一個g光子，而一個32P原子只衰變出一個b粒子），也不表示射線能量的大小。3) 輻射防護(hù)的目的:防止發(fā)生對健康有害的確定性效應(yīng)(接受放射性治療的患者除外), 并將隨機(jī)性損害效應(yīng)的發(fā)生降低到被認(rèn)為可以接受的水平，從而保障放射工作人員、公眾及其后代的健康與安全，提高放射防護(hù)措施的效益，促進(jìn)放射工作的發(fā)展。4) 放射防護(hù)的原則：a) 輻射實(shí)踐的正當(dāng)化：生產(chǎn)必須，醫(yī)療必須，科研教學(xué)必須b) 輻射防護(hù)

56、的最優(yōu)化：即綜合考慮社會、經(jīng)濟(jì)等諸因素之后，使個人劑量的大小、受照人數(shù)的多少和不確定發(fā)生的照射事件的發(fā)生概率可合理達(dá)到的低水平。c) 個人劑量限制：為了保證每個人不致受到不合理的危害，必須制定一個個人劑量限制值，放射工作人員的劑量限制：全身均勻照射的年當(dāng)量劑量限值H全身=50mSV; 不均勻照射時，有效劑量E不應(yīng)超過H全身。5) 外照射的防護(hù)措施：a) 距離防護(hù)：人體受到照射的劑量率隨著離開電離輻射源的距離的增大而減少。劑量率與距離的平方成反比。b) 時間防護(hù)：在劑量率不變時，劑量與時間成正比，即操作時間越短，人員所受到的照射劑量越小。（ 要求放射性作業(yè)應(yīng)操作熟練、操作步驟應(yīng)盡量簡單易行，盡量減少在輻射場所逗留的時間。）c) 屏蔽防護(hù)：利用射線通過物質(zhì)時，與物質(zhì)相互作用使其能量被物質(zhì)吸收而逐漸減弱的原理，可以設(shè)置一定的屏障物來進(jìn)行防護(hù)。常用的材料有水、磚、大理石、混凝土、重金屬鉛等。d) 利用衰變：可利用放射性物質(zhì)存在自發(fā)衰變，其活性隨之減少的原理進(jìn)行外照射防護(hù)。如：半衰期小于15天的放射性廢物，允許放置10個半衰期后作一般廢物處理。6) 內(nèi)照射的防護(hù)措施防止放射性物質(zhì)