白藜蘆醇對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞L

1、白藜蘆醇對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞L作者：易方方，唐其柱，馮斯婷，王騰【關(guān)鍵詞】白藜蘆醇；全細(xì)胞膜片鉗；鈣電流Effects of resveratrol on Ltype calcium current in isolated ventricular myocytes of guinea pig【 Abstract 】 AIM: To investigate the effects of resveratrol on theLtype calcium current (ICaL) inisolated ventricularmyocytes ofguineapig. METHODS: Single v

2、entricular cell was obtained from healthy guineapig heart usingenzymatic dissociationmethods. The wholecellpatch clampwas used to record the ICaL following the administration of resveratrolat 1, 50, 100mol/L. RESULTS: Resveratrol reduced the ICaL in aconcentrationdependentmanner, butit had no effect

3、on IV shape of ICaL. Resveratrolmarkedlyshiftedthesteadystateactivationcurveof ICaLto the right,and V1/2 valueincreased from (- ±)mVin control to ( - ±)mV in the presence of resveratrol（n=7, P= ）, the value from (±) to( ±) (n=7 ，P=). Inactivation curve of ICaL was not affectedsig

4、nificantly. The time constantof reactivationof ICaLwas reducedfrom ( ±) ms to( ±) ms (n=6，P=) by resveratrol.CONCLUSION:Resveratrolinhibited the Ltype calcium channel, mainly acting on the activity andrecovery processes.【Keywords】 resveratrol； wholecell patch clamp； calcium current【摘要】 目的：

5、研究白藜蘆醇對(duì)正常豚鼠心室肌細(xì)胞L 型鈣電流（ ICaL）的影響 .方法：采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù) , 記錄不同濃度白藜蘆醇作用前后對(duì) ICaL的影響 .結(jié)果：白藜蘆醇呈濃度依賴性阻斷 ICaL, 但對(duì)激活電位、峰電位、反轉(zhuǎn)電位均沒有影響； 白藜蘆醇使 ICaL 穩(wěn)態(tài)激活曲線右移， V1/2 由對(duì)照的（- ±）mV變?yōu)椋?- ±） mV （n=7，P=）， 由（±）變?yōu)椋?#177;）（ n=7，P=）；對(duì)失活曲線無影響，不改變 ICaL 失活特性； 白藜蘆醇使 ICaL 失活后再恢復(fù)時(shí)間常數(shù) 縮短，從（±） ms 變?yōu)椋?#177;） ms（n=6， P=

6、）. 結(jié)論：白藜蘆醇對(duì) ICaL 有阻斷作用 , 主要作用于鈣通道激活和恢復(fù)過程 .【關(guān)鍵詞】白藜蘆醇；全細(xì)胞膜片鉗；鈣電流0 引言白藜蘆醇化學(xué)名為3,5,4 三羥基反二苯代乙烯 (3,5,4 trihydroxyransstilbene) ，是一種主要存在于葡萄皮、花生中的多酚類植物抗毒素 . 現(xiàn)認(rèn)為它是適量飲用葡萄酒有利于心血管健康的主要作用因子 1. 大量研究 2-3 發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用； 對(duì)血管有廣泛的舒張效應(yīng) 4;能抗動(dòng)脈粥樣硬化，防治冠心病 5. 但其對(duì)心肌細(xì)胞離子通道的作用少見報(bào)道，我們采用膜片鉗技術(shù)研究白藜蘆醇對(duì)心室肌細(xì)胞 ICaL 的影響 .1 材料和

7、方法材料健康成年豚鼠 31 只（武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心） ，體質(zhì)量 250350 g，雌雄不拘； I 型膠原酶，蛋白酶 E,HEPES（Gibco 公司）； CSOH, CSCl, Na2ATP（ Sigma公司）；白藜蘆醇（西安賽得高科生物股份有限公司） ；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純 . 無鈣臺(tái)氏液 (mmol/L) ：NaCl 135，KCl ，MgCl2 1，NaH2PO4，Glucose 20，HEPES 10， pH (NaOH 調(diào)節(jié) );KB 液(mmol/L) ： glumatic acid 50 ， KOH 85， KCl 30，MgSO4 3，Taurine 20 ， Glucose

8、 10 ， HEPES 10，EGTA， pH (KOH調(diào)節(jié) ) ；電極外液組成 (mmol/L) ：NaCl 37，Choline Chloride 100，CaCl2 ，MgCl2 ，HEPES 10，Glucose 10， CSCl ，pH (CSOH調(diào)節(jié) ) ；電極內(nèi)液組成 (mmol/L): CSCl 120，CaCl2 ， MgCl2 5 ， Na2ATP 5，EGTA 11， HEPES 10，Glucose 11 ，pH (CSOH 調(diào)節(jié)). 白藜蘆醇在 DMSO中配成 mmol/L 母液，每次實(shí)驗(yàn)時(shí) , 母液溶于電極外液中配成實(shí)驗(yàn)所需終濃度進(jìn)行灌流 ,DMSO終濃度低于 1

9、mL/L.方法心室肌細(xì)胞的分離將豚鼠腹腔注射肝素 500 U/kg ，頭部擊昏 , 迅速開胸取出心臟置于 1000 mL/L O2 飽和的 4生理鹽水中沖洗，剪開心包，連接于 Langendorff 心臟灌流裝置上逆行灌流，灌流壓維持在 70 mm H2O，用無鈣臺(tái)氏液灌流 3 5 min ，沖出心臟內(nèi)殘留血液，心臟完全停跳后，改用含 mg/L 型膠原酶， mg/L 蛋白酶 E 的低鈣液（ Ca2+ 80 mmol/L）灌流 35 min, 至心臟膨大松弛流出液成絲后取下， 除去心房，在含 BSA1 g/L 的 KB液中剪碎心室肌， 37溫孵，稀釋，倒出上清液 , 此為第一份細(xì)胞貯存液 . 剩

10、余的沉淀部分繼續(xù)用 KB 液溫孵，稀釋，倒出上清依次可以得到多份細(xì)胞存儲(chǔ)液 . 灌流液始終給予 1000 mL/L O2 飽和 , 循環(huán)水浴使灌流液保溫在 37左右 .全細(xì)胞記錄技術(shù)吸數(shù)滴細(xì)胞保存液加于mL 灌流槽，置于倒置顯微鏡（ Olympus IX70）載物臺(tái)上，待細(xì)胞靜置貼壁，細(xì)胞外液灌流清洗細(xì)胞，電極選用硬質(zhì)玻璃 ( 上海神經(jīng)生理所提供 ), 經(jīng)微電極拉制 (Narishige PB7) 二次拉制而成 , 電極充以內(nèi)液后阻抗 5 M . 選取橫紋清晰，表面無顆粒，無收縮的細(xì)胞，采用微電極操縱儀 (Narishige MD320) 移動(dòng)電極，當(dāng)電極尖端與細(xì)胞表面形成高阻抗封接后（ 2

11、G ）, 補(bǔ)償電極與細(xì)胞膜之間的電容 , 進(jìn)一步給負(fù)壓吸破細(xì)胞膜 , 經(jīng)電容電流和電極串聯(lián)補(bǔ)償即可行全細(xì)胞記錄 . 所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行 . 試驗(yàn)分組共分為 4 個(gè)濃度組 , 分別為對(duì)照組（ n=8）,1 mol/L （n=9） ,50 mol/L （n=7） ,100 mol/L （ n=7），記錄藥物灌流前后 ICaL ，50 mol/L組還需記錄通道激活，失活和失活后恢復(fù)電流.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)分析采用 pulse 軟件對(duì)全細(xì)胞記錄進(jìn)行圖形與數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，數(shù)據(jù)以 x±s表示，origin 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理， 并進(jìn)行曲線擬合 . 不同濃度藥物作用前后間比較采用 OnewayA

12、NOVA檢驗(yàn)及 LSDt，50 mol/L 白藜蘆醇作用后通道動(dòng)力學(xué)改變采用 t 檢驗(yàn)， P<為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 .2 結(jié)果對(duì) ICaL 濃度依賴性阻斷作用采用保持電位-40 mV,指令電壓 -40 60 mV,鉗制時(shí)間 200 ms，階躍 10 mV的刺激程序引出 ICaL，并且記錄 30 min 內(nèi)“ rundown” 現(xiàn)象（ n=7），得出在 12 min 內(nèi)衰減明顯，所有的電流記錄均在電流穩(wěn)定后進(jìn)行 . 灌流給藥 5 min 后藥效穩(wěn)定 . 結(jié)果顯示白藜蘆醇（ 1100 mol/L ）對(duì) ICaL 呈濃度依賴性阻斷作用， 0,1,50,100 mol/L 作用時(shí) ICaL 峰值分別為

13、（±），（±），（±） , （± ）nA (F=,P=; 多重比較后，任兩組間 P=，圖 1）. 白藜蘆醇作用后洗脫， ICaL 大部分恢復(fù)（圖 2） .a ：給藥前 ;b：1 mol/L 白藜蘆醇 ; c ：50 mol/L 白藜蘆醇 ;d：100 mol/L 白藜蘆醇 .圖 1 不同濃度白藜蘆醇對(duì) ICaL 的影響（略）a：給藥前 ;b：50 mol/L 白藜蘆醇 ;c ：洗脫后 .圖 2 白藜蘆醇作用及洗脫后對(duì) ICaL 的影響（略）對(duì)電流電壓曲線的影響從保持電位 -40 V 逐步去極化至 +60 V, 階躍為10 V, 持續(xù)時(shí)間 200 ms.

14、50 mol/L 藜蘆醇作用后，對(duì)鈣電流的最大激活電位和反轉(zhuǎn)電位均無影響，但使最大峰值電流降低（±）（ n=5，P，圖 3）.圖 350 mol/L 白藜蘆醇對(duì) ICaL 的 IV 曲線的影響（略）對(duì)穩(wěn)態(tài)激活動(dòng)力學(xué)曲線的影響根據(jù)上述脈沖刺激得到的電流值, 按Boltzmann 方程進(jìn)行擬合 :G/Gmax=1/1+exp(V V1/2/ ) . (G 為電導(dǎo) ,V1/2 為曲線中點(diǎn)的電壓 , 為曲線的斜率 ). 給予 50 mol/L 白藜蘆醇前后， V1/2/ 分別為（ - ±），（±） V（n=7， P=）, 分別為±，±（ n=7， P=

15、）. 白藜蘆醇能使激活曲線明顯右移（圖4）.圖 4 白藜蘆醇對(duì) ICaL 激活曲線的影響（略）對(duì)穩(wěn)態(tài)失活動(dòng)力學(xué)曲線的影響采用雙脈沖刺激法，保持電位為-60 V, 開始逐步去極化至 +30 V, 階躍 10 V, 持續(xù) 1 ；在每次條件脈沖后都緊跟一個(gè)固定的去極化至 10 V, 持續(xù) 300 的脈沖 , 然后回到 -60 . 將記錄到的 ICaL 值經(jīng) Boltzmann 方程擬合 I/Imax=1/ 1+exp(V-V1/2/ ) . 50 mol/L白藜蘆醇作用前后， V1/2/ 分別為（±），（±） V（n=8，P=）, 分別為±，±（ n=8，P=

16、）. 因而白藜蘆醇對(duì) ICaL 穩(wěn)態(tài)失活曲線無影響（圖 5）.圖 5 白藜蘆醇對(duì) ICaL 失活曲線的影響（略）對(duì)失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)曲線的作用采用雙脈沖刺激法 . 保持電位為 -60 ,給予去極化至 10 的刺激 , 持續(xù) 250 , 回到保持電位持續(xù) 50 后 , 再給予同樣刺激 , 前后兩個(gè)脈沖的間隔時(shí)間逐漸增加 , 每次增加 50 s, 共 9 次脈沖 . 加藥前得到的曲線可以用單指數(shù)方程擬合 . 給藥前后的時(shí)間常數(shù) （）為（±），（±） ms( n=6，P=，圖 6）.圖 6 白藜蘆醇對(duì) ICaL 失活后恢復(fù)曲線的影響（略）3 討論ICaL 在心肌細(xì)胞電活動(dòng)中起重要作

17、用 . 它是維持一個(gè)較長(zhǎng)平臺(tái)期的主要內(nèi)向電流，為其他離子流的活動(dòng)提供合適的電位條件 . 鈣通道阻滯劑不僅可以減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度， 減少鈣超載的發(fā)生， 減少降解酶類的激活釋放而引起的的心肌缺血再灌注損傷；還可以縮短 APD，減少興奮性折返引起的早后去極化，減少心律失常的發(fā)生 .白藜蘆醇的研究最早始于“法國(guó)悖論”現(xiàn)象，即法國(guó)人喝大量葡萄酒，血液中飽和脂肪酸幾乎是其他發(fā)達(dá)國(guó)家的四倍， 但是罹患心臟病的危險(xiǎn)確只是后者的三分之一 6. 研究表明這種現(xiàn)象與葡萄酒中的一種稱為白藜蘆醇的物質(zhì)有著密切關(guān)系，它可以減少心肌缺血再灌注損傷、 舒張血管、抗動(dòng)脈粥樣硬化等 . 白藜蘆醇作為鈣通道阻斷劑減少胞內(nèi)鈣超載的

18、特點(diǎn)進(jìn)一步揭示其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制 . Pakaki 等 7研究發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予大鼠不同劑量的白藜蘆醇進(jìn)行干預(yù)，可以不同程度的減少心肌缺血再灌注后室早室顫的發(fā)生率 . 本試驗(yàn)可以進(jìn)一步解釋此研究結(jié)果， 白藜蘆醇作為鈣通道阻斷劑可以減少興奮折返， 減少心律失常的發(fā)生 .本實(shí)驗(yàn)不足之處是僅就正常心室肌細(xì)胞的鈣通道進(jìn)行研究，對(duì)于病理狀態(tài)如缺血缺氧，以及其他通道如鈉，鉀，氯通道及其各種亞型，和細(xì)胞膜上的各種離子泵的作用還有待進(jìn)一步研究 .【參考文獻(xiàn)】1 Wu JM, WangZR, Hsieh TC, et al.Mechanism of cardioprotectionby resvertrol,a

19、 phenolicantioxidantpresentin red wine J. IntJ MolMed, 20XX, 8(1): 3-17.2 Hung LM, Chen JK, Huang SS, et effectof resvertrol,anaturalantioxidantderivedfrom grapesJ. Cardiovasc Res, 20XX, 47(3):549-555. 3 陳莉娜 , 臧偉進(jìn) , 唐玉海 . 白藜蘆醇心血管保護(hù)作用研究進(jìn)展 J. 生理科學(xué)進(jìn)展 ,20XX,34(3):272-274.4 ElMowafy AM. Resvertrol activates membranebround guanylyl cyclase in coronary arterial smooth muscle: A nov