畢業(yè)論文少量豬細(xì)胞的快速性別鑒定

1、少量豬細(xì)胞的快速性別鑒定本科生畢業(yè)論文任務(wù)書論文題目少量豬細(xì)胞的快速性別鑒定學(xué)院名稱指導(dǎo)教師畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）的內(nèi)容摘要通過pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用pcr marker作分子量標(biāo) 準(zhǔn)，分別從雌性和雄性豬肌肉組織中擴(kuò)增出不同的條帶，從而達(dá)到性別鑒定的目 的通過pcr擴(kuò)增哺乳動(dòng)物雄性決定基因sry來鑒定胚胎的性別在畜牧業(yè)生產(chǎn)上已經(jīng) 得到廣泛應(yīng)用，應(yīng)用多重pcr同時(shí)擴(kuò)增雌雄特界基因，使雌雄樣品均有擴(kuò)增產(chǎn)物. 本實(shí)驗(yàn)針對豬細(xì)胞設(shè)計(jì)了兩對引物il31,2和gapdh-1,2。畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）基本要求及工作量要求1根據(jù)要求閱讀相關(guān)文獻(xiàn)10篇以上，翻譯外文文獻(xiàn)1篇以上，并對所查得的

2、資料進(jìn)行深入分析整理，推敲試驗(yàn)的可行性，設(shè)計(jì)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。2.具體實(shí)驗(yàn)過 程中，著重培養(yǎng)動(dòng)手操作以及獨(dú)立思考問題與解決問題的能力。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要完 成一篇研究性論文，要求數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，保持嚴(yán)格的客觀真實(shí)性，結(jié)果討論清晰 詳細(xì)。4.學(xué)會(huì)word文檔的編輯排版和幻燈片的制作。5.要求中文摘要不少于200 字，附有英文摘要，論文總字?jǐn)?shù)在30005000字。畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）的主要階段計(jì)劃（分前期、中期、后期）前期:2013.3.12013.3.291、廣泛查閱有關(guān)動(dòng)物性別鑒定的文獻(xiàn)。2、提出實(shí)驗(yàn)方案。3、做好材料、設(shè)備用具和方法的準(zhǔn)備工作。中期:2013.3.302013.4.301、對傳統(tǒng)基因組

3、dna提取進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。2、通過文獻(xiàn)查閱對pcr反應(yīng)的引物進(jìn)行有針對性的設(shè)計(jì)。3、熟悉pcr儀的使用和瓊脂糖凝膠電泳檢測的全部過程，并熟練操作。4、進(jìn)行豬細(xì)胞的快速性別鑒定。后期：2013.5.12013.5.91、進(jìn)一步整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖片。2、撰寫和修改畢業(yè)論文并定稿、答辯。任務(wù)下發(fā)日期2013.3.1完成日期2013.5.9系主任：主管教學(xué)院長審批（簽字）：少量豬細(xì)胞的快速性別鑒定摘要：本實(shí)驗(yàn)通過對雌雄成年豬肌肉組織所含因子的dna序列，設(shè)計(jì)了兩對特 異性pcr引物，通過pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用pcr marker作分子量標(biāo)準(zhǔn)，分別從雄性和雌性組織中擴(kuò)增出不同的條

4、帶，從而達(dá)到 性別鑒定的目的。具有較高的應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞：豬細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)；pcr法；性別鑒定pcr method of gender identification of cellsabstract： through the experiments of male and female mice hair (including hair follicle) contains the dna sequence of factor, the design of the two specific pcr primer, through the pcr amplification, amplifica

5、tion 1.5% agarose gel products in the electrophoresis, with pcr marker for molecular weight standard, separately from the male and female organization different channel expansion, so as to achieve the purpose of sex identification. it has higher application value.key words： mice, epithelial tissue；

6、pcr； gender identificationw s 1材料和方法-1-1.1 材料-1-1.2 方法-2-2試驗(yàn)結(jié)果-3-3討論3. 1鑒定過程的高效性-4-3. 2 pcr鑒定的準(zhǔn)確性-5-3.3注意事項(xiàng)-5-參考文獻(xiàn)6致謝-6-隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，我國畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)生了翻天覆地的變化，性別 鑒定技術(shù)在畜牧業(yè)中的作用也日益明顯。因?yàn)榧倚蟮暮芏嗌a(chǎn)性狀與性別 有關(guān)，如在乳制品生產(chǎn)中，需要較多的母畜；而在肉畜生產(chǎn)中，因雄性個(gè)體 的生長速度和產(chǎn)肉性能明顯高于雌性個(gè)體而優(yōu)先選擇雄性；并且在消滅不理 想的隱性性狀1烏達(dá)巴拉，賴雙英，石泉。家畜早期胚胎性別鑒定技術(shù)的應(yīng)用。畜 牧與飼料科學(xué)，20

7、05, (2)： 40 41,防止性連鎖疾病2禹學(xué)禮，粟穎華。pcr在動(dòng)物胚胎性別鑒定中的應(yīng)用。洛陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)。2002,22 ( 1 )： 27 28,加快遺傳進(jìn)展及 畜群的更新等方面也起重要作用。因此，如果能夠有效地控制家畜的性別， 就能更好地利用自然資源，從而服務(wù)于人類自身。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展 以及對畜禽生殖生理的深入研究，人們相繼研發(fā)出了在實(shí)踐中應(yīng)用的性別鑒定方法有: 細(xì)胞遺傳學(xué)法，h-y抗原法，x染色體相關(guān)酶法，y染色體特異dna探針特異雜交 法，pcr法3熊焰成，蘇雷.家畜早期胚胎性別鑒定的研究進(jìn)展j.上海畜牧?xí)t(yī)通訊，2006(6) : 22-23.等。其屮最為常

8、用的就是sry-pcr法，即通過擴(kuò) 增位于y染色體上的性別決定區(qū)(sex-de termi nation region)的基因片段來判 定月丞胎或者細(xì)胞的'性另 0 4 kunieda t, xian m, kob ayashi e, et al . sexing of mouse preimplantation embryos by detection of y chromosomespecific sequences using polymerase chain reactionj.biology of reproduction, 19 92, 46(4) : 692-697.,該

9、基因在不同物種之冋咼度 保守 9 早在 1 9 9 0 年 he 匕1? 5 her*r c mr reed k c micronanipulation of bovine embryos for sex determinationj theriogenology, 1991/35(1): 45-54.等就是用該方法對家畜胚胎的性別進(jìn)行了鑒定，準(zhǔn)確率較髙。而用該方 法鑒定性別具有相對簡單、快速、準(zhǔn)確率高，靈敬等優(yōu)點(diǎn)，可在實(shí)際應(yīng)用中 廣泛推廣。同時(shí)也為法醫(yī)鑒定、刑偵學(xué)斷案和遺傳學(xué)檢測分析提供更高效可 靠的技術(shù)手段張大偉，向子?xùn)|.耗牛胚胎性別鑒定pcr反應(yīng)體系的建立j.畜牧獸 醫(yī)學(xué)報(bào),2011,5

10、(3):28-31.1材料和方法1.1材料1.1.1動(dòng)物材料實(shí) 驗(yàn) 室 保 藏 的 新 鮮 豬 肉 組 織 1.1.2儀器和試劑臺式高速離心機(jī)，pcr儀，水浴鍋，電泳儀，渦旋振蕩器，凝膠成像儀統(tǒng)， 微波爐，移液管，吸頭，1.5ml離心管，250|il離心管，250ml錐形瓶，50ml 量筒,小燒杯，酒精燈，眼科剪，眼科銀，浮漂等。tkm緩沖液(10 mm tris-hcl ph7.6, 10mm kc1, 2mm edta, 4 mm mgch), 10% sds溶液，飽和nacl溶液，75%的乙醇，無水乙醇，70%乙醇， te 緩沖液(10 mm tris-hcl ph 8, 0.1 mm

11、edta)；瓊脂糖，tae電泳緩沖 液(40 mm tris-acetate, 1 mm edta), eb溶液(澳化乙錠)，滅菌雙蒸水，dntp, 上下游引物，loxpcr buffer(mg"fiee),taq酶，m-dl2000 markero1.2方法1.2.1試驗(yàn)方案將購得的新鮮豬的肌肉組織進(jìn)行基因組的快速提取，將所提的基因組作 為模板制備pcr反應(yīng)體系，反應(yīng)體系中的引物為預(yù)先設(shè)計(jì)好的兩對特異性 引物，然后在pcr儀中進(jìn)行dna的體外擴(kuò)增，取pcr產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳 檢測，對凝膠成像所得照片進(jìn)行分析。1.2.2基因組dna的快速提取(1) 分別取豬肌肉組織(約1 mg),置于

12、1.5 mlep管中并剪碎。(2) 加入100 gltkm緩沖液，用200 pl移液器將剪碎的組織充分分散后， 再加入400 |1l tkm 和37.5 pl 10% sds,旋渦混勻。(3) 在水浴鍋內(nèi)55°c孵育5 mine力u200(1l飽和nacl,旋渦混勻。(4) 12000 rpm,離心5 min。取上清(約500 gl )加入新 1.5 mlep管 中(預(yù)先加入900(1l100%乙醇)，顛覆數(shù)次。(5) 12000 rpm,離心5 min。棄上清，力h500 gl70%乙醇，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)后， 吸去乙醇，倒置于濾紙上，置3 min,干燥。(6) 加 30 pl te 緩沖液

13、，55°cfi 10 min，備用。1.2.4引物設(shè)計(jì)根據(jù)gapdh (甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因序列(genbank登錄號：af017079.1 ), 和sry基因序列(genbank登錄號：u49860.2),用 primer premier 5.0,分別設(shè)計(jì)引物 gapdh-1,2 和 sryi,2, 引物由由南京金思特公司合成，引物序列如下：sry 上游弓| 物 (sry-1 ): 5 * gctttcattgtgtggtctcgt 3'sry 下游弓 i 物(sry-2)： 5 * cttggcgactgtgtatgtgaag 3，gapdh 上游弓| 物 (ga

14、pdh-1)： 5 ' gatggcccctctgggaaactgtg3 * gapdh 下游弓i 物(gapdh-2 )： 5 ' ggacgcctgcttcaccaccttct3'1.2.5 pcr的性別鑒定1. pcr條件的優(yōu)化在50 pl反應(yīng)體系中：1 pldna模板，引物各1 pl, mgcl23 pl, dntp4 pl, loxpcr buffer（mg2+free）, taq酶0.25 pl,滅菌雙蒸水補(bǔ)加至50 pl。95°c 預(yù)變 性5 min； 95°c 變性35s,退火溫度設(shè)為8個(gè)梯度（50.0°c、51.4

15、6;c、53.4°c、54.4°c、 55.5°c、56.7°c、57.4°c、58. tc ） 1 min, 72°c 延伸40 s, 30個(gè)循環(huán)；72°c 延伸 5 mino2. pcr性別鑒定選取上步的優(yōu)化條件進(jìn)行多重pcr,在50pl反應(yīng)體系屮:1 |1l dna模板, 兩對引物各 1 pl, mgcl23（1l, dntp4|il, loxpcr buffer（mg2+free）, taq 酶 0.25（1l,滅菌雙蒸水補(bǔ)加至50（ilo 95°c預(yù)變性4.5 min； 95°c變性35s, 5

16、6°c 退火1 min, 72°c延伸40s, 30個(gè)循環(huán)；72°c延伸5 min。1.2.6電泳1. 制備1.5%瓊脂糖凝膠：稱取0.3 g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入20 ml的 lxtae電泳緩沖液，微波爐加熱煮沸至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.5%瓊脂 糖凝膠液。2. 將少量eb （約3 nl）加入冷卻到70°c左右的瓊脂糖凝膠液中，搖勻。3. 膠板制備（灌膠）:將洗凈的電泳槽載膠板放入制膠槽內(nèi)，使載膠板 與內(nèi)槽兩端邊緣對齊封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放 好點(diǎn)樣梳。將瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入載膠板上，使膠液緩慢展開，直到 整個(gè)塑

17、料板表面形成均勻膠層。室溫下，靜置直至凝膠完全凝【古i,垂直輕拔點(diǎn) 樣梳，將載膠板放入電泳槽中，lxtae電泳緩沖液沒過膠板lmm為止。3. 加樣：用10 pl微量移液管分別將樣品（pcr擴(kuò)增后產(chǎn)物）加入膠板的 樣品小槽內(nèi)，上樣量為5pl,每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣吸頭（注意： 加樣前耍先記下加樣的順序）o4. 電泳:加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓110 v,樣品由負(fù)極（黑 色）向正極（紅色）方向移動(dòng)。當(dāng)漠酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1 cm處時(shí)（約20 min）,停止電泳。5. 觀察照相：在紫外燈下觀察，dna存在則顯示岀紅色熒光條帶，采用凝 膠成像系統(tǒng)拍照保存。2試驗(yàn)結(jié)果pcr條件的

18、優(yōu)化及pcr性別鑒定的結(jié)果見圖1和圖2圖1： pcr退火溫度條件優(yōu)化結(jié)果圖2：多重pcr結(jié)果figi: pcr products amplified from gradientfig2: multiplex pcr amplificationannealing temperaturem： dl2000 dna maker；m： dl2000 dna maker;1-8： s小鼠dna樣品pcr擴(kuò)增il3基因結(jié)果為16：待測上皮組織pcr結(jié)果；544bp的片段（退火溫度分別為：50.0°c、51.4°c、7：已知？小鼠pcr結(jié)果；8：已知g小鼠pcr結(jié)果。53.4°

19、c、54.4°c、55.5°c、56.7°c、57.4°c、58.tc )（退火溫度均為55.5°c）o9-16： s小鼠dna樣品pcr擴(kuò)增sry基因結(jié)果為402bp 的片段（退火溫度分別:50.0°c、51.4°c、53.4°c、54.4°c、55.5°c、56.7°c、57.4°c、58.1 °c ）。 3討論3.1鑒定過程的高效性這項(xiàng)性別鑒定技術(shù)用于快速、準(zhǔn)確的鑒定小鼠的性別。對該pcr擴(kuò)增程序 的所有步驟進(jìn)行了優(yōu)化使性別鑒定的時(shí)間低于4h。與其他的性別鑒定

20、方法相 比，它節(jié)省了大約2h。得出結(jié)果需耍以下幾步：dna提取、pcr擴(kuò)增和凝膠電 泳。對組織dna的快速提取采用sds變性、高鹽的提取和乙醇沉淀法，可以在 lh之內(nèi)得到低成本高純度的dnao提取的dna量雖然很小，但用于pcr足夠。pcr反應(yīng)時(shí)，在找到兩對引物合適的退火條件下同吋進(jìn)行基因組dna的體外擴(kuò) 增縮短了單獨(dú)反應(yīng)時(shí)所用的時(shí)間3. 2 pcr鑒定的準(zhǔn)確性多重pcr同時(shí)擴(kuò)增雌雄特異基因，使雌雄樣品均有擴(kuò)增產(chǎn)物，不僅可以避 免假陰性結(jié)果，同時(shí)提高了鑒定的準(zhǔn)確率，而且可增加模板的使用率，使1個(gè) 或數(shù)個(gè)拷貝的dna獲得最大限度的應(yīng)用。由于pcr能使極少的目的基因大量 擴(kuò)增，所以在實(shí)驗(yàn)操作過程中

21、要避免交叉污染。多重pcr要求在同一反應(yīng)體系 中進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增，因而，引物間的配對、引物間的競爭性擴(kuò)增等 均影響多重pcr的擴(kuò)增效果，但如能調(diào)整反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)（包括退火溫度、退 火及延伸時(shí)間等）、pcr緩沖液成分、dntp的用量、引物的量及模板的量等， 選擇適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，可極大地提高多重pcr擴(kuò)增效果i®。3. 3注意事項(xiàng)（1）由于pcr反應(yīng)高靈敏性，使擴(kuò)增極易受到外源dna的污染，產(chǎn)生假陽 性。取樣用的剪刀和銀子必須做好實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理，取樣時(shí)應(yīng)與所取樣品一一對 應(yīng)不得交叉使用，防止樣品間的交叉污染。取過樣品后離心管上要用標(biāo)記筆做 好編號標(biāo)記，以便鑒定后可對應(yīng)區(qū)分

22、小鼠。（2）制膠前應(yīng)將電泳槽、載膠板、點(diǎn)樣梳子、凝膠槽清凈晾干；所加緩 沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致；加熱時(shí)，一定要煮沸，以保證瓊脂糖的完全溶解; 待溶液冷卻至不燙手時(shí)加eb；防止溫度過高eb分解和揮發(fā)。溶解的凝膠應(yīng)及 時(shí)倒入板中，避免倒入前凝i古i結(jié)塊；倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電 泳結(jié)果。（3）取放eb時(shí)應(yīng)該特別注意，有哪些位置是要戴手套，哪些是必須用手 接觸的，小心摘手套時(shí)不要接觸實(shí)驗(yàn)用具，以免交叉感染，對自己和他人的安 全造成隱患。（4）取放凝膠時(shí)，膠凝固后，拔梳子前先倒入些電泳緩沖液以方便取梳 子，拔梳子時(shí)，應(yīng)垂直輕拔，防止破壞上樣孔。（5）一般情況下，0.25 cm寬的梳子可加

23、0.1 pg的dna量，加樣量的多少 依據(jù)加樣孔的大小及dna中片段的數(shù)量和大小而定，過多的量會(huì)造成加樣孔 超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對于較大的dna此現(xiàn)象更明顯。（6）加樣時(shí)每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣吸頭，以防污染。加樣時(shí) 勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。如預(yù)計(jì)上樣孔過剩時(shí)，可避開第一個(gè)和最后一個(gè) 孔上樣，防止邊緣效應(yīng)。（7）電泳期間接通電源，紅色為止極，黑色為負(fù)極，切記dna樣品由負(fù) 極往正極泳動(dòng)（靠近加樣孔的一端為負(fù)）。電泳20-40 min即可；電泳槽蓋要安 全蓋好，以防止液體蒸發(fā)，乂可以降低電擊的可能性。參考文獻(xiàn)1 呂碧文，俞頌東，金水仙.牛早期胚胎性別鑒定的pcr方法研究j.武漢大學(xué)

24、學(xué)報(bào)， 1994,45(2):211 214.2 胡明信，吳學(xué)清，曾溢滔等.牛胚胎性別鑒定與取樣胚胎移植應(yīng)用技術(shù)的研究j 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1995,6:487495.3 趙建軍，趙興緒，張偉等.兔早期胚胎pcr性別鑒定體系的建立j.現(xiàn)代畜牧獸 醫(yī).2008,12:42 46.張大偉，向子?xùn)|.耗牛胚胎性別鑒定pcr反應(yīng)體系的建立jj.畜牧獸醫(yī)學(xué) 報(bào),2011,5(3):28 31.15徐艷春，馬立新，白素英等.應(yīng)用pcr方法通過毛發(fā)進(jìn)行哺乳動(dòng)物性別鑒定j.東北 林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,6:72-77.6 alanr t, karen s. molecular diagnostics in prei

25、mplantation genetic diagnocularj.j mol diagn , 2002,4(2): 167176.7 jean-francois lambert, brian o. benoit, geralda. colvin, et al. quick sex determinationof mouse fetusesj. journal of neuroscience methodsj.2000,95:127132.8 趙學(xué)明，朱士恩，侯云鵬等.雙重套pcr對不同取樣胚胎性別鑒定靈敏度測試j.中國 生物工程雜志,2005,25(3):1722 .9 呂碧文.家畜胚胎性別鑒

26、定的分子生物學(xué)方法及現(xiàn)狀j.浙江畜牧獸醫(yī)，1998,(3):15-16.10 黃銀花，胡曉湘，李寧等.影響多重pcr擴(kuò)增效果的因素j.遺 傳,2003,25(1):65-68.致謝這次畢業(yè)論文能夠得以順利完成，是所有曾經(jīng)指導(dǎo)過我的老師，幫助過 我的同學(xué)，一直支持著我的家人對我的教誨、幫助和鼓勵(lì)的結(jié)果。我要在這 里對他們表示最深的謝意！首先，要特別感謝我的指導(dǎo)老師一一潘求真老師。感謝潘求真老師在我 實(shí)驗(yàn)期間及畢業(yè)論文的撰寫過程中，給我提供了極大的幫助和指導(dǎo)。從開始 選題到中期修正，從實(shí)驗(yàn)儀器的使用到實(shí)驗(yàn)藥品的供給，直到最后論文的形 成，老師給我提供了許多寶貴建議和示范。其次，要感謝4053實(shí)驗(yàn)室的師哥師姐們在實(shí)驗(yàn)期間提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)器材 和使用指導(dǎo)，使實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌瓿?。還要感謝人學(xué)四年里我的任課教師，是 你們每一次課堂上和課后的指導(dǎo)，讓我學(xué)到了豐富的知識。得以有能力完成 這次實(shí)驗(yàn)。感謝我的父母親，你們是我力量的源泉和依靠，只要想到你們永遠(yuǎn)支持 我，永遠(yuǎn)是我最堅(jiān)強(qiáng)的后盾，不管面對什么樣的困難，我都會(huì)勇往直前。感謝我的朋友們，大學(xué)四年我們一起學(xué)習(xí)，共同成長。學(xué)會(huì)了書本上的 知識，也收獲了最珍貴的友誼。你們的鼓勵(lì)與幫助是我前進(jìn)路上最大的助力。 大學(xué)的結(jié)束不是我們友誼的結(jié)束，是新的開始