課題3酵母細(xì)胞的固定化

1、知識(shí)點(diǎn):1.酶和活細(xì)胞的固定方法(包括游離酶、微生物、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞）。2.輔酶和輔基的固定 。3.固定化酶的性質(zhì)4.固定化對(duì)酶反應(yīng)系統(tǒng)的影響5.固定化酶和固定化細(xì)胞的應(yīng)用1 酶和活細(xì)胞的固定方法1.1 固定化酶與固定化細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn) 1.1.1固定化酶: 固定化酶的研究已取得大量重要成果發(fā)揮著巨大作用，受到人們極大的關(guān)注。其重要原因是它和水溶性酶比較具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)；產(chǎn)物溶液中沒(méi)有酶的極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)；產(chǎn)物溶液中沒(méi)有酶的殘留，簡(jiǎn)化了提純工藝殘留，簡(jiǎn)化了提純工藝.(2)可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)反復(fù)使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)反復(fù)使用，

2、有利于工藝的連續(xù)化、管道化?；?3)酶反應(yīng)過(guò)程可以嚴(yán)格控制，有利于工藝自動(dòng)化和微電腦化。酶反應(yīng)過(guò)程可以嚴(yán)格控制，有利于工藝自動(dòng)化和微電腦化。(4)在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。(5)較能適應(yīng)于多酶反應(yīng)。較能適應(yīng)于多酶反應(yīng)。(6)酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低。本低。 固定化酶也存在一些缺點(diǎn)：(1)酶固定化時(shí)酶的活力有所損失。同時(shí)也增加了固定化的成本，使工廠(chǎng)開(kāi)始投資大。(2)比較適應(yīng)水溶性底物和小分子底物。(3)與完整細(xì)胞比較，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)，同時(shí)對(duì)胞內(nèi)酶需經(jīng)

3、分離后才能固定化。 1.1.2固定化細(xì)胞 固定化細(xì)胞是在固定化酶的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。它的優(yōu)點(diǎn)如下:(1)省去了酶的分離手續(xù)為多酶系統(tǒng)，無(wú)須輔因子再生。省去了酶的分離手續(xù)為多酶系統(tǒng)，無(wú)須輔因子再生。(2)細(xì)胞生長(zhǎng)快、而且多、反應(yīng)快。細(xì)胞生長(zhǎng)快、而且多、反應(yīng)快。(3)可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細(xì)胞，能一邊徘出發(fā)酵液，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物離去細(xì)胞，能一邊徘出發(fā)酵液，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗。抑制和消耗。(4)保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對(duì)保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對(duì)污

4、染因子的抵抗力增加。污染因子的抵抗力增加。固定化細(xì)胞同時(shí)也存在些缺點(diǎn)： (1)必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。 (2)必須防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)所需酶的分解，同時(shí)，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性止副產(chǎn)物的形成。 (3)細(xì)胞膜、壁會(huì)阻礙底物滲透和擴(kuò)散。 1.2酶的固定化方法酶的固定化方法有：吸附法；共價(jià)鍵結(jié)合法；交聯(lián)法；包埋法吸附法；共價(jià)鍵結(jié)合法；交聯(lián)法；包埋法.如下圖:1.2.1 吸附法吸附法分為物理吸附法和離子交換吸附法。(1) 物理吸附法: 通過(guò)氫鍵、疏水作用和通過(guò)氫鍵、疏水作用和電子親和力等物電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上從而制成固定化酶理作用，將酶固定于水不溶

5、載體上從而制成固定化酶。常用的載體有： 有機(jī)載體。纖維素、骨膠原、火棉膠及面筋、淀粉等。比如用纖維索作為吸附劑，用膨潤(rùn)的玻璃紙或膠棉膜吸附木瓜蛋白酶、堿性磷酸脂酶、6磷酸葡萄糖脫氫酶。吸附后在載體表面形成單分子層，吸附蛋白能力約70mg/cm2。無(wú)機(jī)載休。氧化鉛、皂土、白土、高嶺土、多孔玻璃、二氧化鈦等。比如用多孔硅為載體吸附米曲酶和枯草桿菌的r淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45進(jìn)行固定化，用高濃度的底物進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)半衰期分別為14、35、60d。無(wú)機(jī)載體的吸附容量較低、而且酶容易脫落。(2)離子交換吸附法: 這是將酶與含有離予交換基的水不溶載將酶與含有離予交換基的水不溶載體相結(jié)合而達(dá)到固定化的

6、一種方法。體相結(jié)合而達(dá)到固定化的一種方法。酶吸附較牢，在工業(yè)上頗具廣泛的用途。常用的載體有陰離子交換劑，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纖維素、混合胺類(lèi)（ECTEDLA）纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)纖維素、DEAE葡聚糖凝膠、Amberlite IRA93、410、900等。陽(yáng)離子交換劑基，如羧甲基(CM)纖維素、纖維素檸檬酸鹽、Amberlite CG50、IRC50、IR200、Dowex50等。DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：將DEAE-SephadexA25充分溶脹用05mol/LNa0H和水洗滌后，加入pH7.07.5的米曲霉3042粗酶液(水解乙酰DL-Ala活力為2

7、5umol/m1h)充分混合(1g濕重載體加60ml酶液)后，于低溫下攪拌過(guò)夜后，吸去上清液，再用蒸餾水和0.15mol/L醋酸鈉水溶液洗滌固定化酶，置4備用。固定化酶活力回收50-60，水解乙酰DLA1a活力為600-800umol/gh濕固定化酶。氨基?；敢部晒潭ㄓ贒EAE纖維素。 此外，DEAE纖維素吸附的淀粉酶、蔗糖酶已作為商品固定化酶。 通過(guò)酶蛋白化學(xué)修飾來(lái)增加蛋白質(zhì)分子上電荷能通過(guò)酶蛋白化學(xué)修飾來(lái)增加蛋白質(zhì)分子上電荷能有效的克服吸附法制備的固定化酶在使用過(guò)程的解吸有效的克服吸附法制備的固定化酶在使用過(guò)程的解吸。用水溶性乙烯順丁烯二酸酐共聚物共價(jià)修飾的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用

8、DEAE纖維素和DEAEScphadex載體有效的固定。這種固定幾乎是不可逆的吸附。此外酶的吸附與解吸還與介質(zhì)中離子強(qiáng)度、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度及酶和載體的特性相關(guān)。pH的變化影響到載體和酶的電荷，從而影響載體對(duì)酶的吸附。在等電點(diǎn)兩側(cè)(1-2pH單位)吸附將明顯減少，但也有個(gè)別例外。鹽對(duì)吸附的影響較為復(fù)雜在一些特殊事例中、鹽可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的吸附。這就是所謂的鹽析吸附。對(duì)蛋對(duì)蛋白質(zhì)吸附來(lái)說(shuō)，隨溫度的升高吸附下降。白質(zhì)吸附來(lái)說(shuō)，隨溫度的升高吸附下降。載體的表面積、多孔性及其頂處理都影響對(duì)酶的吸附。 吸附法制備固定化酶操作簡(jiǎn)單，可充分選擇不同電荷、不同形狀的載體，吸附過(guò)程可以同時(shí)純化酶，固定化酶在使

9、用過(guò)程失活后可重新活化，同時(shí)，載體可以回收再利用。但由于有些機(jī)理不十分明了，在給酶量、吸附程度與固定化酶活力回收的關(guān)系不可預(yù)見(jiàn)性大，同時(shí)由于吸附法制備的固定化酶易脫落，影響產(chǎn)物純度和酶的操作為穩(wěn)定性。1.2.2 包埋法包埋法是將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進(jìn)包埋法是將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進(jìn)劑劑(包括交聯(lián)劑包括交聯(lián)劑)的作用進(jìn)行聚合，酶被包埋在聚合物中以達(dá)的作用進(jìn)行聚合，酶被包埋在聚合物中以達(dá)到固定化到固定化。包埋法操作簡(jiǎn)單，由于酶分子只被包埋，未受到化學(xué)反應(yīng)，可以制得較高活力的固定化酶對(duì)大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細(xì)胞都是適用的。但是，只有小分子底物和產(chǎn)物

10、可以通過(guò)凝膠網(wǎng)絡(luò)，而對(duì)大分子底物不適宜。同時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)對(duì)物質(zhì)擴(kuò)散的阻力導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為的變化、活力降低。包埋法常用凝膠包埋法和微囊化法。(1)凝膠包埋法 凝膠包埋法是將酶分子包埋在凝膠格子中凝膠包埋法是將酶分子包埋在凝膠格子中。聚丙烯酰胺凝膠包埋法聚丙烯酰胺凝膠包埋法。一般的制備過(guò)程如下：將1ml溶于適當(dāng)緩沖液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(單體)和40mgN，N甲叉雙丙烯酰胺(交聯(lián)劑)的3ml溶液中，再加0.5ml 15的二甲氨基丙腈(加速劑)，同時(shí)，加入1過(guò)硫酸鉀(引發(fā)劑)，混合，于25T：保溫10min，便得含酶凝膠。將凝膠粉碎，制得不規(guī)則的顆粒于低溫儲(chǔ)存或冷凍干燥。為制得珠狀

11、固定化酶，可以在聚合反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，立即轉(zhuǎn)入到疏水相(一種乳化劑，與水相有相同密度)的有機(jī)溶液中，使分散成含酶的珠狀凝膠。 聚丙烯酰胺包埋法的缺點(diǎn)是酶容易漏失，以低分子量聚丙烯酰胺包埋法的缺點(diǎn)是酶容易漏失，以低分子量蛋白質(zhì)為甚，如果調(diào)整交聯(lián)劑濃度與交聯(lián)程度可以得到克蛋白質(zhì)為甚，如果調(diào)整交聯(lián)劑濃度與交聯(lián)程度可以得到克服。服。輻射包埋法輻射包埋法。酶溶于純單體水溶液、單體加合物水溶液或純聚合物溶液中在常溫或低溫下，用x射線(xiàn)、Y射線(xiàn)或電子束輻照?？傻玫桨衩傅挠H水凝膠。如用X射線(xiàn)引發(fā)聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。1973年HMaeda等用聚乙烯水溶液輻照包埋了多種酶。運(yùn)用弱水性或稍微疏水性的玻璃化載

12、體，用低溫過(guò)冷態(tài)的輻照聚和，可用于般生物物質(zhì)的固定化。這些生物物質(zhì)主要分布在載體表面層區(qū)域，固定化產(chǎn)物表面具有生物活性，曾稱(chēng)這種方法為粘附法。這種方法可粘附酶、葉綠素、病毒等，長(zhǎng)期使用后仍有較高的活性?？梢允褂貌ＡЩ瘑误w，玻璃化單體和非玻璃化單體混合物、單體和天然聚合物的混合物為載體。其他凝膠包埋法。其他凝膠包埋法。 a.淀粉凝膠包埋法淀粉凝膠包埋法。將氨基甲酸乙酯的泡沫墊浸入溫?zé)岬牡矸廴芤汉鸵阴Ｄ憠A脂酶的混合物中，再經(jīng)冷卻、干燥，便制得固定化乙酰膽堿脂酶。，為增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度和重新水合可加入定量的甘油。膠原有纖維性，易成膜，能在生理pH下自發(fā)的聚焦成束，膠束末端可以通過(guò)多種次級(jí)鍵與酶分子相互作用

13、，通過(guò)酶和膠原分子形成網(wǎng)架而將酶固定化。其制備方法極為簡(jiǎn)單：將酶加到膠原懸浮液中、鋪膜、干燥即得固定化酶?；蛘呓?jīng)過(guò)透析的酶和膠原混合，插入電極，酶膠原復(fù)合物便在電極上沉淀。 c.卡拉膠包埋法卡拉膠包埋法：卡拉膠(KCarrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一種多糖，可以用來(lái)包埋酶。具體方法：將100gx酶在3750溶于水中，又將1.7g卡拉膠在40一60溶于34ml生理鹽水中，二者混合后冷全10，所成凝膠浸在0.3mol/L KCl 溶液中硬化，作成適當(dāng)大小的顆粒,即為固定化酶。 d.天然血纖維包埋法天然血纖維包埋法：血纖維不會(huì)引起抗體形成，且無(wú)毒。在檸檬酸緩沖

14、液中使酶和血纖蛋白原及凝血酶混合、便制得血纖蛋白包埋的固定化酶。酶分子的氨基和血纖蛋白的谷氨酰胺殘基之間發(fā)生交聯(lián)而將酶固定化。e.大豆蛋白包埋法大豆蛋白包埋法。含葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌菌株與大豆蛋白溶液混合，在60用碳酸鎂處理使其凝結(jié)，過(guò)濾制球，干燥后用戊二醛和六甲叉二胺處理，硬化從而制得固定化葡萄糖異構(gòu)酶。 (2)微囊化法微囊化法 此法是將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi)。它使酶存在于類(lèi)似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外環(huán)境直接接觸從而增加了酶的穩(wěn)定性同時(shí)，小分子底物能通過(guò)膜與酶作用，產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)散而輸出。微囊一般直徑約1100um，膜厚約100nm，膜上孔徑約3.6nm，表面積與體

15、積之比極大，物質(zhì)能很快達(dá)到平衡，能有效的包埋許多種酶。同時(shí)、可用不同類(lèi)型、不同濃度的酶、細(xì)胞提取物或細(xì)胞，不同組成和含量的膜包裹組建成人工細(xì)胞. 因此，此法在醫(yī)療上極為有用。例如固定化天門(mén)冬酰胺酶(治療白血病)就是用這種方法制成的微膠囊。微膠囊的制備方法有4種。界面沉淀法界面沉淀法。是利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度極低而形成膜，從而將酶包埋的方法。如，含有高濃度血紅蛋白的酶溶液在與水不互溶、沸點(diǎn)比水低的有機(jī)相中乳化，加入油溶性表面活性劑，形成油包水的微滴，再將溶于有機(jī)溶劑的高聚物在攪拌下加入乳化液中，然后加入一種不溶解高聚物的有機(jī)溶劑使高聚物在油一水界面上沉淀形成膜，最后移于水相，

16、從而制成固定化酶。作為高聚物有硝酸纖維素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。如“人造細(xì)胞”制備：25ml 10%血紅蛋白水溶液(內(nèi)含適當(dāng)酶、界面聚合法界面聚合法。界面聚合法是將疏水性和親水性單體在界面進(jìn)行聚合，形成半透膜,使酶包埋于半透膜微囊中。此法曾用來(lái)制備Asn酶、脲酶等。制備方法一般是：將酶水溶液與親水單體(如乙二醇)用一種水不溶混的有機(jī)溶劑制成乳化液，再將溶于同一有機(jī)溶劑疏水單體(如多異氰酸)溶液在攪拌下加入到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有機(jī)溶劑之間的界面發(fā)生聚合化 這樣水相中酶便包埋在聚合體(聚脲)膜內(nèi)。例如用含酶的10血紅蛋白水溶液與己甲叉二胺的水溶液混合，立即在1Span85的氯

17、仿-環(huán)已烷中分散乳化,加人癸二酰氯(有機(jī)相)后，便在油-水界面發(fā)生聚合反應(yīng)，棄除上清液，加入Tween-20去乳化,洗除有機(jī)溶劑，除去未聚合單體后，轉(zhuǎn)入水相，制得固定化酶。液體干燥法液體干燥法。此法曾用乙基纖維素和聚苯乙烯包埋過(guò)氧化氫酶、脂肪酶等。它是將一種聚合物溶于一種沸點(diǎn)比水低，且與水不混溶的溶劑中加入酶液后，加入油溶性表面活性劑為乳化劑使之乳化。再把它分散于含有保護(hù)性膠質(zhì)如明膠、聚丙烯醇和表面活性劑的水溶液中，第二次乳化.在不斷攪拌下，低溫真空除去有機(jī)溶劑，便得含酶微囊。常用聚合體有乙基纖維素、聚苯乙烯、氯橡皮等，有機(jī)溶劑有苯、環(huán)己烷和氯仿。紅血球包埋法紅血球包埋法。在高滲溶液中紅細(xì)胞膨

18、脹伸展后，細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白漏出，同時(shí)胞外蛋白也能擴(kuò)散進(jìn)紅血球再放進(jìn)等滲溶液中，紅血球膜又回復(fù)至正常狀態(tài)和透性，進(jìn)入的酶不會(huì)漏出來(lái).脂質(zhì)休包埋法。脂質(zhì)休包埋法。上述微囊法是一種半透性膜將酶包埋，近年來(lái)采用雙層脂質(zhì)體形成極細(xì)球粒包埋酶。例如將卵磷脂、膽甾醇和二鯨臘磷酯按7：2：1溶于氯仿中再加入酶液，混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在氮?dú)庀?2轉(zhuǎn)動(dòng)乳化，然后在室溫下保持2h，再在氮?dú)鈿饬髦?用音波處理10s，在室溫下保持2h，過(guò)Sepharose 6B柱，收集脂質(zhì)體，離心分離脂質(zhì)體，所得球粒懸浮于緩沖液中，繼續(xù)音波處理，并過(guò)Sepharose 6B柱，可得含酶的微囊。這種微囊液膜當(dāng)?shù)孜锂a(chǎn)物穿過(guò)時(shí)、與膜的徑無(wú)關(guān)

19、但與產(chǎn)物或底物對(duì)膜成分的溶解度有關(guān)。1.2.3 共價(jià)鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法 共價(jià)鍵結(jié)合法是酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載休表面上的共價(jià)鍵結(jié)合法是酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載休表面上的功能基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵而固定的方法功能基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵而固定的方法。其優(yōu)點(diǎn)是：酶與載體結(jié)合牢固，酶不易脫落，但反應(yīng)條件較激烈，酶易失活，同時(shí)，制作手續(xù)亦較繁瑣。(1) 酶分子和載體連接的功能基團(tuán) 從理論上講，酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團(tuán)有以下幾種：酶蛋白N端的M氨基或賴(lài)氨酸殘基的-氨基。酶蛋白C-端的羧基以及Asp殘基的-羧基和Glu殘基-羧基。Cys殘基的巰基。Ser、Tyr、Thr殘基的羥基。Phe和Tyr殘基的苯環(huán)。His殘

20、基的咪唑基。Trp殘基的吲哚基。 在實(shí)際中偶聯(lián)最普遍的基團(tuán)是：氨基、羧基以及苯環(huán)。被偶聯(lián)的基團(tuán)還應(yīng)是酶活性的非必需基團(tuán)，否則將導(dǎo)致酶失去活性。(2)載體的選擇載體的選擇 載體直接關(guān)系到固定化酶的性質(zhì)和形成。對(duì)載體的一般要求是:一般親水載體在蛋白質(zhì)結(jié)合量和固定化酶活力及其穩(wěn)定一般親水載體在蛋白質(zhì)結(jié)合量和固定化酶活力及其穩(wěn)定 性上都優(yōu)于疏水載體。性上都優(yōu)于疏水載體。載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機(jī)械強(qiáng)度。載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機(jī)械強(qiáng)度。載體必須有在溫和條件與酶共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)。載體必須有在溫和條件與酶共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)。載休沒(méi)有或很少有非專(zhuān)一性吸附。載休沒(méi)有或很少有非專(zhuān)一性吸附。載體

21、來(lái)源容易便便并能反復(fù)使用。載體來(lái)源容易便便并能反復(fù)使用。 (3)偶聯(lián)反應(yīng) 酶和載體的連接反應(yīng)取決于載體上的功能基團(tuán)和酶分子上的非必需側(cè)鏈基團(tuán)，而且是在十分溫和的pH、中等離子強(qiáng)度和較低溫的緩沖液中進(jìn)行?，F(xiàn)已有許多種偶聯(lián)反應(yīng)都能制備固定化酶。這些方法在實(shí)際運(yùn)用中經(jīng)濟(jì)意義起著決定性作用，必須考慮到酶的偶聯(lián)效率固定化酶總活力，操作的簡(jiǎn)便性以及載體與試劑的成本等因素?，F(xiàn)介紹如下：重氮法 是將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸酸處理成重氮鹽衍生物，再在中性偏堿(pH89)條件下與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到固定化酶。 可能與酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在過(guò)量重氮鹽存在下還可與

22、酶蛋白的N端氨基或Lys的氨基形成雙偶氮化合物。常用載體及其反應(yīng)如下：a.多糖類(lèi)的芳香族氨基衍生物。我國(guó)獨(dú)創(chuàng)的使用對(duì)-硫酸脂乙砜基胺(ABSE)多糖(纖維素，葡聚糖，文聯(lián)瓊脂糖，交聯(lián)瓊脂及淀粉)屬于此類(lèi)載體。在堿性條件下用對(duì)硫酸脂乙砜基胺話(huà)化多糖，制得的醚鍵連接的乙砜基苯胺衍生物，經(jīng)重氮化后偶聯(lián)酶：b.氮基酸共聚體。如LLeu和對(duì)氨基DL苯丙氨酸共聚物：待1mol/L的LLeu和對(duì)氨基DLPhe的N羧基酐的苯溶液在少量水存在及室溫下進(jìn)行反應(yīng)制成。共聚物與亞硝酸作用轉(zhuǎn)變?yōu)橹氐}，可供酶固定用。用此法制備的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。c.聚丙烯酰胺衍生物。該類(lèi)衍生物的商品名稱(chēng)為bioGe

23、l或Enzacry。如EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，經(jīng)重氮化可固定酶。用此法制備的有氨基?；福矸勖傅裙潭ɑ?。d.苯乙酰樹(shù)脂。這是聚氨基苯乙烯(a)和一種異丁烯一間一氨基苯乙烯(b)的共聚物，通過(guò)重氮化后可固定酶如胃蛋白酶、核糖核酸酶等。e.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。 玻璃的化學(xué)改造物多孔玻璃在丙酮中與Y氨基丙基三氧乙烷硅回流加熱，生成烷基胺玻璃:烷基氨玻璃用對(duì)硝基苯酚氯處理后，再還原，轉(zhuǎn)變?yōu)榉枷慊苌?此芳香基衍生物經(jīng)重氮化后與酶結(jié)合產(chǎn)生固定化酶。 芳香烴化反應(yīng) 具有鹵素取代的芳香環(huán)或含有鹵素取代的雜環(huán)的高聚物以及含有鹵乙?；母呔畚?，可以通過(guò)烷基化、芳香基化，

24、在堿性條件下，與酶分子上的氨基、酚基、巰基等反應(yīng)，如： a.將纖維素在二惡烷(Diaxanc)-溴乙酸中與嗅乙酰溴反應(yīng)，形成溴乙酰纖維素，可供胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化：常用載休有鹵乙酰、鹵異丁烯衍生物，如氯乙酰纖維素、溴乙酰纖維索、碘乙酰纖維素等。b.纖維素等載體在堿性條件下和均三氯三嗪等反應(yīng)，引入活潑的鹵素基后，能與酶的氨基、酚羥基、巰基反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶。 與纖維素共價(jià)結(jié)合的另一類(lèi)芳香烴化功能基是3-F-4，6-二硝基苯?？刂苝H7，使它勺酶分子的氨基反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶。c.四元縮合反應(yīng) 利用四元化合物(羧酸、胺、醛和異氰酸)發(fā)生縮合反應(yīng)，形成N取代的酰胺。在反應(yīng)中，羧酸(R

25、1)和胺化合物(R2)形成酰胺鍵，醛(R3)和異氰酸(R4)結(jié)合形成酰胺氮的側(cè)鏈： 當(dāng)選擇適當(dāng)條件，適當(dāng)?shù)妮d體及控制反應(yīng)液中的添加物，可以使連接鍵或通過(guò)酶的氨基或通過(guò)羧基，將酶固定并免除有害反應(yīng)。例如：在乙醛和小分子的3(二甲氨基)丙基異氰酸存在下，用0.5mol/L HCl維持pH6.5，攪拌反應(yīng)6h，用帶氨基的聚合物，可以與酶分子的羧基偶聯(lián)。而帶COOH的高聚物在醛和異氰酸存在下，可與酶分子的NH2偶聯(lián)。 d.巰基二硫基交換反應(yīng) 帶有SH或二硫基的載體，通過(guò)巰基二硫基的交換反應(yīng)，和酶分子上非必需巰基偶聯(lián)。若載體的功能基團(tuán)為SH時(shí)，可先用2，2二吡啶二硫化物處理，生成的二硫基中間產(chǎn)物在酸性條

26、件下能與酶分子的巰基發(fā)生交換反應(yīng)，從而產(chǎn)生固定化酶。此法通過(guò)小分子巰基化合物的運(yùn)轉(zhuǎn)，使載體可以再生：e.金屬偶聯(lián)法 利用某些過(guò)渡金屬鹽溶液將載體(纖維素、尼龍、硼硅玻璃、濾紙及酵母細(xì)胞等)浸泡24h，洗除末反應(yīng)的金屬鹽后，制得的活化載體放入酶溶液中，即可將酶固定化。如： f.縮合反應(yīng) 一些帶羧基或氨基的載體用羰二亞胺活化后，與酶分子的氨基或羧基直接偶聯(lián)，形成肽鍵，產(chǎn)生固定化酶。般在弱酸條件下(pH4.755)將酶、羰二亞胺、載體同時(shí)混合，羰二亞胺與載體的羧基反應(yīng)生成活潑的O乙酰異脲衍生物，與酶分子的氨基縮合成肽鍵或者重排為酰基脲。 例如以丙烯酰胺和丙烯酸共聚物為載體用縮合法制備固定化胰蛋白酶。

27、0.95g丙烯酸用3mol/L NaOH調(diào)pH6.5，加入1.95g丙烯酰胺和0.1g N，N甲叉雙丙烯酰胺，再加入0.1mol/L pH6.5磷酸緩沖液，使體積為10m1，加入25mg過(guò)硫酸銨和22ulN，N，N，N，N四甲基乙二胺，抽真空除氣泡，4聚合30min，壓擠成粒，攪拌下水洗丙酮干燥備用。 70g干膠在20m10.5mol/L HCl中攪拌30min，用水和 O.1mol/L pH 6.5磷酸緩沖液洗滌后轉(zhuǎn)至小燒杯，加入3.5ml 0.1mol/L pH65磷酸緩沖液的8.75mg膠原蛋白酶后，攪拌5min，接著加1環(huán)己基3(2嗎啉乙基)羰二亞胺甲基對(duì)甲苯磺酸，連續(xù)攪拌18h，洗滌

28、后即為固定化酶。g.疊氮反應(yīng) 帶有羧基或羥基、羧甲基等的載體，首先在酸性條件下用甲醇處理使之酯化，再用水合肼處理形成酰肼，最后在HNO3作用下轉(zhuǎn)變成疊氮衍生物。此衍生物在低溫下可與酶蛋白的羥基、酚基或巰基等反應(yīng)，但產(chǎn)物可用中性羥胺水解掉，使之僅與一NH2反應(yīng)。 此法常用載體有羧甲基纖維素、CMSephadex、聚天冬氨酸、BioGel.CM100、乙烯順丁烯二酸酐共聚物、Amberlite IRC50等。疊氮法用途較廣，舉例如下： 以CM一纖維素(CMC)疊氮衍生物為載體固定化胰蛋白酶。首先，載體的酯化與肼解：CMC依次用水、乙醇和乙醚洗滌，干燥后，懸于無(wú)水甲醇，在冰浴冷卻下通入HCl氣體，使

29、之飽和。室溫下過(guò)夜，并重復(fù)此過(guò)程(甲酯化)。然后用甲醇、乙醚充分洗滌，并空氣干燥。將產(chǎn)物懸于甲醇中，加入80水合肼，回流1h。放置過(guò)夜，過(guò)濾，再用甲醇洗滌，干燥。其次為偶聯(lián)：1g CMC酰肼和150m1 2HCl在冰浴中混合，攪拌下滴加9ml %3 NaNa2，冰水浴中攪拌20min。離心棄去上清液。沉淀用150m1二氧氯環(huán)洗滌再用150m1冷的蒸餾水洗滌二次，并且懸于預(yù)冷的10ml 0.05mol/L pH87磷酸緩沖液的胰蛋白酶溶液中，5攪拌反應(yīng)23h，用HCl凋PH4，冷0.001mol/L HCl洗三次，冷水洗一次，凍干，即為固定化酶。j.異硫氰酸反應(yīng) 含有芳香氨基的載體，在堿性PH條

30、件下，與光氣或硫芥子氣反應(yīng)生成異硫氰酸或異琉氰酸衍生物，可在溫和條件下與酶分子的氨基連接，產(chǎn)生固定化酶。 用含有?；B氮的載體在加熱下與HClI反應(yīng)，亦得到異硫氰酸衍生物亦可用于固定化酶。k.溴化氰亞胺碳酸基反應(yīng) 含有羥基的載體(如纖維素、葡聚糖、瓊脂等)在堿性條件下，載體的羥基與CNBr反應(yīng)，生成活潑的亞胺碳酸基，在弱堿條件下，可與酶分子的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生固定化酶。例如：用CNBr活化的瓊脂糖固定化胰蛋白酶。將Sepharose 4B用蒸餾水洗凈，含0.1g干物質(zhì)的濕膠加5ml水和4ml現(xiàn)配溴化氰水溶液(25mg/m1)，攪拌下用2mol/LNaOH調(diào)pHll.0，2325反應(yīng)6min，抽干立

31、即用300ml 0.1mol/L NaHCO3洗凈, (58min內(nèi)完成)?；罨妮d體用0.025mol/L pH10.2（含0.02mol/L CaCl2）硼酸緩沖液液快速淋洗后，用5m1緩沖液轉(zhuǎn)入燒杯內(nèi)加16mg結(jié)晶胰蛋白酶，攪拌4h，用0.1mol/L pH8.5硼酸緩沖液(內(nèi)含1mol/L NaCl)洗滌后，復(fù)用pH4.1的醋酸緩沖液洗滌，便制成了固定化胰蛋白酶。 酰氯化反應(yīng) 含羧基載體如羧基樹(shù)脂(Amberlite IRC50等)，可用氯化亞砜處理，生成酰氯衍生物，與酶分子的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生固定化酶。 m酸酐反應(yīng) 乙烯或苯乙烯、甲代乙烯基與順丁烯二酸酐的共聚物，在己二胺作用下，酸酐與酶

32、蛋白的氨基起偶聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶。活化酯法 含羧基的共聚物載體在二環(huán)己基碳二亞胺(DDC)存在下用N羥基琥珀酰亞胺活化，產(chǎn)生活化酯，再在溫和條件下連接酶。n.含醛基高聚物 多糖類(lèi)如淀粉、葡聚糖、纖維素等用高碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖環(huán)，形成含醛基(每葡萄糖產(chǎn)生兩個(gè)醛基)高聚物，可與酶蛋白氨基反應(yīng)，產(chǎn)生固定化酶。例如：用甘蔗渣纖維素衍生物固定化木瓜蛋白酶。載體制備：60g甘蔗渣纖維素浸于500ml 0.6NaOH溶液中85處理30min，水洗至中性，抽干。懸浮于NaI04溶液中，空溫下攪拌12h，用水反復(fù)沖洗、抽干。置于IL脲溶液中，攪拌。產(chǎn)物用水反復(fù)洗滌，抽干后，置于12甲醛溶液中攪拌處理

33、12h，用水洗滌，除去過(guò)量甲醛，反應(yīng)過(guò)程如下：加酶固定:上述載體1g加入1mg/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.2 0.1mol/L磷酸緩沖液配制)攪拌下48固定18h后，用PH7.2 0.1mol/L磷酸緩沖液(合0.4mol/LNaCl)洗去多余酶液，抽干，即為固定化酶。1.2.4 交聯(lián)法 這是利用雙功能或多功能試劑在酶分子間或酶與載體間，或酶與惰性蛋白間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以制備固定化酶的力法。最常用的交聯(lián)試劑是戊二醛，其他如苯基二異硫氰、雙重氮聯(lián)苯胺-2，2二磺酸、1，5二氟2，4二硝苯、己二酰二胺甲脂等。用戊二醛交聯(lián)制備固定化酶的反應(yīng)如下： 交聯(lián)法有下列方法： (1) 交聯(lián)酶法 在一定條件下，

34、加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。這種反應(yīng)與酶和試劑濃度、溶液PH和離子強(qiáng)度、溫度、反應(yīng)時(shí)間均有一定的關(guān)系。如木瓜蛋白酶在0.2酶蛋白濃度、2.3戊二醛、pH5.27.2、0下交聯(lián)24h，可形成固定化酶。其中，F(xiàn)H的影響L分明顯，隨pH升高，閉定化速度增加5pH低于4不能形成固定化酶。其中，pH的影響十分顯著，隨pH升高，固定化速度增加；pH低于4不能形成固定化酶。有人認(rèn)為pH應(yīng)控制在酶的等電點(diǎn)附近有利于固定化。在交聯(lián)時(shí)，加入一定量中性鹽如Na2SO4、（NH4)2SO4等和丙酮等有機(jī)溶劑有助于形成固定化酶。溫度也有一定影響如木瓜蛋白酶和戊二醛在pH6.0、0長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)，只

35、得可溶性固定化酶，若在室溫下0一5h，即可形成不溶性固定化酶。這種情況對(duì)不同酶可能有不同結(jié)果。 這種方法也用于制備交聯(lián)的結(jié)晶酶。交聯(lián)結(jié)晶酶仍具有一定酶活力。 例如：將500mg酶溶于5m1 0.2mol/L pH6醋酸緩沖液中，在攪拌下滴加2m1 2.5戊二醛，在室溫下放置1030min，會(huì)有沉淀析出，13h內(nèi)反應(yīng)結(jié)柬。形成的凝膠切碎后水洗，除多余戊二醛，即為固定化酶。(2)酶與輔助蛋白交聯(lián)法 用雙功能或多功能試劑使惰性蛋白與酶共交聯(lián)從而制備固定化酶由于酶在交聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中因化學(xué)修飾而引起失活，或因可得到的酶量有限時(shí)，因此，通常以一些輔助蛋白，如牛血清白蛋白、明膠、膠原、抗體等，與酶一起進(jìn)行交聯(lián)

36、。 例如：10mg脲酶與2.5ml含6白蛋自、0.2戊二醛的0.02mol/L pH8磷酸緩沖液混合，冷到30后，冉升溫至4 下,放置4h將形成的泡沫聚合物徹底洗除后，凍干，即為固定化脲酶。(3)載體交聯(lián)法 是用多或雙功能試劑的一部分功能基團(tuán)與載體交聯(lián)，另一部分功能基團(tuán)與酶蛋白交聯(lián)而制備固定化酶的方法。例如：尼龍固定化木瓜蛋白酶的制備：尼龍布用含18.6CaC12和18.6水的甲醇溶液處理10min，洗凈吸干，于3.65mol/LHCl中45水浴中水解45min，水洗至中性，吸干，用5戊二醛溶液(0.2mol/L pH8.5硼酸緩沖液配制)，于20攪拌交聯(lián)20min，用PH7.8 0.1mol

37、/L磷酸緩沖液洗去多余戊二醛。2g處理載體(尼龍)加入4ml酶溶液(1mg/ml）于45下固定3h后，用0.1mol/L pH7.5磷酸緩沖液(內(nèi)含0.5mol/LNaCl)洗滌，除去多余酶液，抽干，即為固定化木瓜蛋白酶。 單用戊二醛等試劑文聯(lián)制備的固定化酶活力較低，常將此法與吸附法、包埋法結(jié)合使用，可以達(dá)到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。 殼聚糖微球固定化木瓜蛋白酶制備。殼聚糖微球制備：4g殼聚糖洛于100m12醋酸溶液，在攪拌下緩慢滴人燒杯中的透平油(酸性膠與透平油的比例為1：3)中，技4：35：1比例加入25戊二醛溶液，再用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH910，置水浴(60一7

38、0)中3h，冷卻后，棄去上層油液，依次用石油醚、丙酮、無(wú)水乙醇、水洗滌真空干燥備用。 酶的固定化：0.5g載休于0.1mol/L pH7.2磷酸緩沖液浸泡24h，抽干，加入1.6mg/ml的木瓜蛋白酶溶液0.6mL，48下吸附12h，滴入0.6戊二醛溶液3m1于48交聯(lián)3h后棄去上層溶液，用0.1mol/L pH72磷酸緩沖液(含NaCl 0.5mol/L)洗多次，吸干水分，即得固定化酶。活力回收約60，在填充休反應(yīng)器內(nèi)連續(xù)水解酪蛋白(05)時(shí)半衰期為16d.另一種方法是酶交聯(lián)后再用凝膠包埋。 1mg/m1(601U/m1)脲酶的0.02mol/LpH68磷酸緩沖液與等體積2.5戊二醛的上述緩

39、沖液混合，4反應(yīng)10h加G1y至0.1mol/L，終止交聯(lián)，得交聯(lián)酶。 lml60丙烯酰胺和16N，N甲叉雙丙烯酰胺與5mL上述交聯(lián)酶液混合，37保溫(為溶液A)。另取96mg瓊脂糖在6mL水中煮沸5min，在攪拌下冷卻至40(溶液B)。在溶液B中加入0.5mlN，N，N，N四甲基乙二胺36mg過(guò)硫酸銨，立即加入溶液A，4聚合30min，凝膠水洗，干燥，即為固定化酶。1.2.3 微生物細(xì)胞的固定化方法 菌體細(xì)胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有包埋法、吸附法和不用載體法等。(1) 包埋法 包埋法是制備固定化細(xì)胞最常用的方法。將產(chǎn)酶菌株用包埋劑如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、瓊脂、海藻酸、

40、卡拉膠、二和三醋酸纖維、膠原、明膠和戊二醛等包埋起來(lái)，發(fā)揮酶或酶系的作用。1977年我國(guó)投入生產(chǎn)的固定化青霉素酰胺酶，是使用明膠、戊二醛包埋大腸桿茵而成。美國(guó)、歐洲和日本等大規(guī)模生產(chǎn)高果糖漿的工藝多數(shù)采用固定化菌體的酶柱工藝。包埋法制備固定化細(xì)胞與其制備固定化酶大體相似，茲舉例介紹如下。聚丙烯酰胺凝膠包埋法 3m1細(xì)胞懸浮液，加入12m1生理鹽水和丙烯酰胺2.25g、甲叉雙丙烯酰胺O.25g、5二甲氨基丙氰1.5ml及2.5過(guò)硫酸銨1.5ml，在10min內(nèi)聚合，得到終濃度為15的聚丙烯酰胺凝膠切成3mmX3mmX3mm小塊，用蒸餾水、生理鹽水各洗二次，抽干即可。又如用聚丙烯酰胺包埋大腸桿菌(

41、Ecoli ATCCll303)固定天冬氨酸酶：將大腸桿菌細(xì)胞懸浮液和單體溶液(750g丙烯酰胺和40gNN中叉雙丙烯酰胺溶于2.4L水)在8混合后，加入100m125(體積比)P二甲氨丙氰和500ml1過(guò)硫酸鉀，混勻后于2025放置約5min開(kāi)始聚合并升溫，當(dāng)升至30即用冷水冷卻，放置1520min完成聚合。凝膠切成直徑34mm顆粒。再用水洗滌。約10ml凝膠相當(dāng)于1g濕細(xì)胞，酶活力約為13001800umol/h。若用1mmol/LMg2+和1mol/L反丁烯二酸(pH8.5)將膠在37保溫2448h酶活力可提高910倍。瓊脂凝膠包理 3m1細(xì)胞懸浮液加入到20ml4瓊脂液(45)中，攪拌

42、均勻，凝固后，切成3mm3mm3mm小方塊，用100m1生理鹽水洗二次。海藻酸包埋 3m1細(xì)胞懸浮液加人到20ml 2CaCl2溶液中，置冰箱10h，用100ml生理鹽水洗二次。 卡拉膠包埋法 8g濕菌、8m1生理鹽水在45混勻；再將1.5g卡拉膠溶于3m1生理鹽水中，兩者于50混合后、冷至10，30min后將凝膠浸于0.3mol/L KCl溶液中4h，切塊或制粒。 明膠包埋法 將3m1細(xì)胞懸浮液加入到200ml 10明膠液，34混勻冷凝后，切塊，加入20m15戊二醛溶液，室溫下文聯(lián)1.5h，用蒸餾水、生理鹽水各洗二次。 其他包埋方法還有膠原膜、四氯化鈉在水中形成的聚合的金屬氧化物沉淀及液體膜

43、等。(2)吸附法吸附法也分物理吸附法和離子交換吸附法 物理吸附法 物理吸附法是將微生物細(xì)胞附著于固體載體上的一種固定方法。載體常用的多孔磚、瓷杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纖維等。如將酵母用聚氯乙烯或多孔磚固定化，每克載體可以固定80mg酵母；也可將固定化的釀酒酵母，裝入反應(yīng)柱，以生產(chǎn)乙醇，乙醇可達(dá)120g/L。在環(huán)境保護(hù)中用木片、石礫等固定微生物細(xì)胞作為污水處理的過(guò)濾器。物理吸附法載體與微生物細(xì)胞間不起反應(yīng)，吸附量大.但細(xì)胞極容易脫落而流失.有待于進(jìn)一步改善.離子交換吸附法 利用離子交換吸附細(xì)胞常用的載體是離于交換樹(shù)脂，例如利用陰離子交換樹(shù)脂吸附放線(xiàn)菌含葡萄糖異構(gòu)酶含酶菌株；用Dow

44、ea吸附敏捷固氮菌(含多酶)菌株；用離子交換纖維素吸附無(wú)色桿菌(含頭孢霉素酰化酶菌株)以及用離子交換纖維素吸附米曲霉含轉(zhuǎn)化酶菌株等獲得成功.這種方法制備的固定化細(xì)胞，細(xì)胞易脫落，需不斷補(bǔ)充新細(xì)胞. 不用載體法這是選擇適當(dāng)?shù)臈l件，通過(guò)一定處理使酶固定在細(xì)胞內(nèi)的種方法。如葡萄糖異構(gòu)酶是一種胞內(nèi)酶，將生物細(xì)胞加熱至60，10min，其他酶失活，則該酶被固定在細(xì)胞內(nèi)，所以又稱(chēng)加熱固定化。又如鏈霉菌細(xì)胞用檸檬酸處理使酶固定在細(xì)胞內(nèi)，若再用殼聚糖處理，使之凝聚干燥即成固定化細(xì)胞。2 輔基與輔酶的固定方法2.1輔基的固定方法 對(duì)于與酶結(jié)合牢固的輔基，可以考慮在固定化酶時(shí)一般可以將輔基同時(shí)固定，但是在一些條件

45、下如酶蛋白與輔基結(jié)合弱而輔基容易泄露時(shí)，或者用于親和層析來(lái)分離純化相應(yīng)酶等，必須將輔基固定。輔基固定化過(guò)程是，將載體與連接臂連接，再以適當(dāng)反應(yīng)與輔基連接。裁體應(yīng)符合以下條件： 沒(méi)有非專(zhuān)一件吸附，具有多孔性和定的機(jī)械強(qiáng)度；具有適合與臂或輔基結(jié)合的功能基團(tuán)；具有化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性等.載體大多采用瓊脂糖，也使用纖維素、多孔玻璃珠或合成高分子材料等。連接臂，尚需考慮其疏水性、親水性、離子性和體積、長(zhǎng)度等因素。選擇偶聯(lián)反應(yīng)有兩種情況： 是在不影響輔基活性條件下，引入適當(dāng)?shù)墓δ芑鶊F(tuán)，如羧基或氨基等容易與載體連接；二是如果輔基分子本身具備有參與催化活性的功能基團(tuán)，無(wú)須再引入功能團(tuán)。如磷酸吡哆醛(胺)、FAD

46、、FMA、TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等，大都利用分子本身原有的功能基團(tuán)。接著，將具有某種功能團(tuán)的輔基與連接臂結(jié)合，再與活化載體結(jié)合.用瓊脂糖為載體時(shí)有如下反應(yīng)：2.1.1溴化氰法活化載體可直接與輔基偶聯(lián)。2.1.2帶羧基載體2.1.3帶氨基載體2.1.4帶巰基或二硫基裁體2.1.5帶芳香氨基線(xiàn)體2.2輔酶的固定方法輔酶的固定方法主要有兩種：載體結(jié)合法和包埋法。載體結(jié)合法與捕基固定方法相似，主要用于制備親和吸附利。包埋法中，由于輔酶相對(duì)分子質(zhì)量小，先將輔酶與水溶性高分子結(jié)合，然后再來(lái)包埋。這種包埋和酶的包埋法相似。因此，輔酶固定化包括：引入一個(gè)功能基團(tuán)，生成輔酶衍生物，再與水溶性高分子聚合物結(jié)

47、合。2.2.1引入功能基團(tuán) 對(duì)于一些腺苷酸的輔酶，如NAD+、NADP+、CoA和ATP等，在腺嘌呤的第6位或第8位上引入氨基或羧基。其反應(yīng)分別如下：2.2.2高分子化 選擇高分子化合物時(shí)，首先要考慮的是其溶解度大、分子大小適當(dāng)，既能保持在半適膜內(nèi)，又不會(huì)過(guò)大地增加粘度而影響活性；其次是，高分子大小、結(jié)構(gòu)、親水性、解離基團(tuán)、結(jié)合量等都影響高分子化輔酶的活性。一般引入羧基的輔酶，用碳二亞胺縮合反應(yīng)使其與聚Lys、聚乙亞胺結(jié)合，形成水溶性高分子化合物；引入氨基的輔酶， 一般用BrCN活化后，再與水溶性多糖類(lèi)(如右旋糖苷)結(jié)合，而高分子化。 酶反應(yīng)器中，使用高分子輔酶衍生物還有捕酶的再生問(wèn)題。一般采

48、用與主反應(yīng)共組合和獨(dú)立進(jìn)行二種方式來(lái)解決。如下頁(yè)圖： 在實(shí)踐中，許多重要的生物活性物質(zhì)或生化藥物的生物合成中，尚需輔酶參加酶反應(yīng)，所以，輔酶的固定化和固定化輔酶的再生是酶工程的一項(xiàng)重要任務(wù)。目前尚未見(jiàn)用于工業(yè)生產(chǎn)的報(bào)道。3 動(dòng)植物細(xì)胞固定化3.1植物細(xì)胞固定化 植物細(xì)胞比菌體細(xì)胞嬌嫩得多，需要溫和的固定化方法。80年代開(kāi)始研究，目前一般采用吸附法和包埋法(下表 )。3.1.1吸附法 吸附法是將植物細(xì)胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi)?；蛭接谥锌绽w維外壁上。如將植物細(xì)胞定置在中空纖維的外壁與容器內(nèi)壁之間，培養(yǎng)液及O2在中空維管內(nèi)流動(dòng)，透過(guò)中空纖維管壁(具半透膜性)，傳遞給附著于外壁的細(xì)胞，細(xì)胞代謝

49、產(chǎn)物亦透過(guò)外壁隨管內(nèi)培養(yǎng)液流出。利用此法固定的豌豆細(xì)胞和胡蘿卜細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)多酚化合物的研究，可連續(xù)使用1個(gè)多月。又如將洗凈、滅茵后的泡沫塑料放進(jìn)辣椒細(xì)胞培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一 段時(shí)間，細(xì)胞吸附于塑料孔洞內(nèi)，并能生長(zhǎng)繁殖。3.1.2包埋法 包埋法是將植物細(xì)胞包埋于瓊脂、海藻酸鈣、聚丙烯酰胺、明膠和角叉菜膠等多孔凝膠中。 Brodelius等(1979)首次用海藻酸鈣包埋制備了固定化長(zhǎng)春花細(xì)胞、毛地黃細(xì)胞、海巴戟細(xì)胞。3.2 動(dòng)物細(xì)胞固定化 動(dòng)物細(xì)胞比菌體細(xì)胞、植物細(xì)胞更嬌嫩需要最溫和的固定化方法。目前,動(dòng)物細(xì)胞固定的方法有吸附法和包埋法兩種，其中吸附法用的最多。3.2.1吸附法 由于大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞

50、屬于附著細(xì)胞，它們?cè)谂囵B(yǎng)過(guò)程中趨向于附著固體表面。因此，吸附法特別適合于制備固定化動(dòng)物細(xì)胞。主要載體及固定方法有：(1)轉(zhuǎn)瓶法。轉(zhuǎn)瓶是由玻璃或塑料制成。其表面經(jīng)一定處理而帶有電荷，如用高錳酸鉀等氧化劑，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或紫外輻射等表而處理，可使動(dòng)物細(xì)胞附著于表面，轉(zhuǎn)瓶以一定旋轉(zhuǎn)速度進(jìn)行培養(yǎng).若在轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)增大表面積，可提高生產(chǎn)能力。(2)微載體法。微載體是指直徑為100200um，相對(duì)密度接近于1.0的顆粒固定化載體。它是由表面帶有電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。微載體具有較大的表面，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和物質(zhì)傳遞特別有利，但強(qiáng)度不夠易破碎，使用時(shí)間較短，已用于固定多種細(xì)胞。如

51、用于生產(chǎn)p干擾素、人纖溶酶原活化劑白細(xì)胞介素及各種疫苗的細(xì)胞固定化。(3)中空纖維法 中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。其管壁具有半透性。將細(xì)胞胞置于管外壁扣容器外殼之間，則細(xì)胞附著于外壁上，培養(yǎng)液從管內(nèi)流動(dòng)，能透過(guò)管壁進(jìn)行質(zhì)熱傳遞，中空纖維起著體內(nèi)微血管的作用，有利細(xì)胞生長(zhǎng)及其新陳代謝。已有多種中空纖維固定化細(xì)胞用于生產(chǎn)各種單克降抗體和疫苗等。3.2.2包埋法 包埋法根據(jù)載體與方法不同，亦有凝膠包埋法和半透膜包埋法兩種.(1)凝膠包埋法。用于動(dòng)物細(xì)胞固定化的凝膠主要有瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖蛋白等。瓊脂糖包埋法是，將1一2.5的瓊脂糖加熱溶解后冷至3738,與一定量動(dòng)物

52、細(xì)胞混合后分布于石蠟油中.使溫度湖37降至10左右，可得到直徑為0.10.3mm的微球狀固定化細(xì)胞，用于單克隆抗體、白細(xì)胞介素等的生產(chǎn)。海藻酸鈣凝膠包埋法是，將動(dòng)物細(xì)胞與一定濃度的海藻酸凝膠溶液混合均勻后，用注射器將混合液滴到一定CaCl2溶液中即成。 血纖蛋白包埋法是將動(dòng)物細(xì)胞與血纖蛋白混合后加入凝血酶而固定化。 (2)半透膜包埋法。利用高分子聚合物形成的半透膜將動(dòng)物細(xì)胞包埋形成微囊形固定化動(dòng)物細(xì)胞。例如：先用海藻酸鈣包埋動(dòng)物細(xì)胞制成膠粒后，再在外面包一層聚Lys膜，然后放入檸檬酸鈉溶液中去除海藻酸鈣，便可獲得由多聚Lys包埋的動(dòng)物細(xì)胞。3.3原生質(zhì)體固定化 原生質(zhì)體固定化，首先要制備較穩(wěn)定

53、的原生質(zhì)體，然后用凝膠進(jìn)行包埋。（1）瓊脂多孔醋酸纖維固定法 用生理鹽水配制3一4的瓊脂，加熱，溶解，滅菌后冷至50左右，勺等體積一定濃度的原生質(zhì)體混合，將混合液滴加于多孔醋酸纖維上，置冰箱冷卻凝固。（2）海藻酸鈣凝膠固定法 以3一6海藻酸鈣溶液與等體積 定濃度的原生質(zhì)體混合，混合液滴入CaCl2溶液中，并浸泡12h。即成。（3）角叉萊膠固定法 配制1一8角叉菜膠加熱溶解，滅菌后，冷卻至50左右，與等體積原生質(zhì)體混合，混合液滴入一定濃度的預(yù)冷KCl中，即得球狀固定化原生質(zhì)體。（4）光交聯(lián)樹(shù)脂固定法 配制30一60濃度的光交聯(lián)樹(shù)脂預(yù)聚體加熱溶解后，在50左右加人1光敏劉與等體積的原生質(zhì)體混合后，

54、攤成薄層經(jīng)紫外光照射，聚合后形成小塊，制成片狀的固定化原生質(zhì)體。 固定化原生質(zhì)體用于生產(chǎn)各種氨基酸、酶和生物堿等物質(zhì)以及甾體轉(zhuǎn)化等。4 固定化酶的性質(zhì)4.1固定化酶活力 與其溶液酶相比，大多數(shù)固定化酶活性下降。固定化酶活力下降的原因主要有：酶與不溶性載體相結(jié)合引起結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化；酶活性中心的重要氨基酸殘基與裁體相結(jié)合。這兩者造成的酶活力下降可以適當(dāng)條件加以克服。載體與酶結(jié)合后，酶雖不失活，但酶與底物間的相互作用受到空間位阻，從而使活力下降。這個(gè)影響難以克服。另外，在包埋法中，酶活性的下降可能是在酶的固定過(guò)程中有變性所致。4.1.1酶固定化效果的測(cè)定 固定化酶活力測(cè)定基本上與溶液酶相似，也以反應(yīng)

55、初速度表示即每毫克干重固定化酶每分鐘轉(zhuǎn)化1umol底物量或形成1umol產(chǎn)物的酶量為一個(gè)單位(umol/mgmin)，對(duì)于酶管、酶膜、酶板等，則以單位面積（cm2）的初速度來(lái)表示。4.1.2偶聯(lián)效率 偶聯(lián)效率以載體結(jié)合酶量(或酶活力)的百分?jǐn)?shù)表示： 由于在偶聯(lián)反應(yīng)中酶往往會(huì)有些失活，因此，測(cè)定殘留活力還不能正確反映與載體結(jié)合的酶活力，所以，仍以測(cè)定蛋白量較為難確。在酶固定化操作中，當(dāng)酶與載體結(jié)合后，用適量適當(dāng)?shù)木彌_液淋洗固定化酶，以洗除未固定的酶，收集洗脫液，并測(cè)定其中蛋白量(或酶活力)，即為殘留的蛋白量(或酶活力)。4.1.3活力回收和相對(duì)活力 酶固定化般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分?jǐn)?shù)稱(chēng)為活力回收。4.2 固定化酶的穩(wěn)定性 大多數(shù)酶在固定化后都不同程度地提高了穩(wěn)定性延長(zhǎng)了有效壽命。這是由于：第一，固定化增加了酶構(gòu)象的牢固程度。第二、擋住了不利因素對(duì)酶的侵襲。第三，限制了酶分子間的相互作用。但是，如果固定化觸及到酶活性