腸道致病菌多重PCR快速檢測體系探究

1、腸道致病菌多重pcr快速檢測體系探究沙門菌屬、志賀菌屬、侵襲性大腸埃希菌、腸產(chǎn)毒素大ei£3腸埃希菌是常見的引起人類和動(dòng)物細(xì)菌性痢疾和細(xì)菌性食 物中毒的腸道致病菌，嚴(yán)重的危害著人類健康和牲畜的安全"。因此，建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確、特異地檢測方法 具有重要意義。目前常見病原菌的檢驗(yàn)方法存在著檢測周期 長、工作量大、所需試劑多，而且假陰性率高，靈敏度低， 或假陽性率高，特異性差等缺點(diǎn)。pcr技術(shù)提供了理想的檢 測方法。本實(shí)驗(yàn)采用多重pcr方法，可在同一反應(yīng)體系中 檢測不同的細(xì)菌，整個(gè)過程只需要23h ,應(yīng)用前景廣闊。1材料與方法11實(shí)驗(yàn)菌株 腸炎沙門菌、阿柏丁沙門菌，雞雛沙門

2、菌，德爾比沙門菌、鼠傷寒沙茁福氏志賀2a福氏志賀2b ,宋氏志賀菌，枸緣酸桿菌，變形桿菌，河弧菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽抱桿菌（四川省疾病預(yù)防控制中心）;產(chǎn)毒 素大腸埃希菌c83921 ,產(chǎn)毒素大腸埃希菌c83902 （中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；侵襲性大腸埃希菌（中國生物制品研究12試劑 染料、緩沖溶液.taqdna聚合酶、dntps、核酸染料(gv)、瓊脂糖、marker等(北京塞百盛基因技術(shù)公 司)。3主要設(shè)備pcr基因擴(kuò)增儀、臺式高速離心機(jī)、紫外可見凝膠成像系統(tǒng)、核酸分析儀、微量加樣槍(德國 eppendorf公司);電泳槽、dyy-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市 六一儀器廠)。14方法14 1引

3、物設(shè)計(jì)沙門菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因片段具有沙門菌屬特異性 04,根據(jù)genebank v01373提供的基因序列設(shè)計(jì)引物，即引物1:5-act ggc gtt atccct ttc tct ggt g3 ;引物 2:5'atg ttg tcc tgceidccc tgg taa gag a3由于ipah基因存在于所有志賀菌 屬和侵襲性大腸埃希菌(eiec )的質(zhì)粒和染色體上5,根 據(jù)genebank m32063提供的序列設(shè)計(jì)志賀菌和eiec引物,引物序列為:引物 1 :5z- tgt atc aca gat atg gca tgc 3 ;引物 2 : tcc gga gat tgt t

4、cc atg tg 3。選 擇不耐熱腸毒素(lt)的編碼基因保守區(qū)6，根據(jù)genebank s60731提供的序列設(shè)計(jì)一對引物為：引物仁5jgcgttacta tcc tct cta tgt g-3'引物 2 : 5z-agt ttt ccatac tga ttg ccg c3。4 2dna模板的提取采用熱裂解法，取細(xì)菌培養(yǎng)液1 oml,置于eppendorf管中,8000r / min，滅菌蒸館水洗 滌2次,最后用1ml蒸館水懸浮，隔水煮沸10min,8000r / min ,離心10min,取上清，即為dna模板溶液。14 3多重pcr擴(kuò)增條件的優(yōu)化通過多次試驗(yàn)先確定了變化較小的因

5、素buffer,dntp,再對影響較大的因素如mgci2濃度、引物濃度、taq酶用量、模板濃度，在1個(gè)范圍內(nèi)做正交實(shí)驗(yàn)，再進(jìn)行局部微調(diào)，最后調(diào)整退火溫度和循 環(huán)數(shù)參數(shù)等。取pcr產(chǎn)物5pl及dna marker參照物在含有(gv)的1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓75v,電泳40min后在紫外燈下觀察結(jié)果。14 4多重pcr體系的特異性、靈敏度、樣品檢測(1) 特異性檢測：9株標(biāo)準(zhǔn)目的菌株和7株非目的菌株，提取 dna模板，然后進(jìn)行pcr擴(kuò)增，電泳后觀察有無條帶的出現(xiàn)。(2) 靈敏度檢測：將從目的菌株提取的dna模板用核酸分析 儀測定dna含量,然后作10倍梯度稀釋，取每個(gè)稀釋度的 dna進(jìn)行pcr

6、擴(kuò)增，電泳后觀察條帶的亮度,直到不出現(xiàn)擴(kuò)增帶為止。(3)樣品的檢測：從牛肉中分離的可疑菌株，提取 dna模板，進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增。同時(shí),按常規(guī)進(jìn)行生化檢驗(yàn) 和玻板凝集試驗(yàn)。14 5pcr試劑盒組成經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，組裝多重pcr試劑盒。包括pcr反應(yīng)管,pcr反應(yīng)液染料，緩沖溶液 (mg2+ ), dntp，引物，瓊脂糖粉.goldview 染料，taq 酶，陽性對照，陰性對照，液體石蠟。2結(jié)果21 pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化反應(yīng)體積50pl,10xbuffer5pl ,引物各 0 25pl ( 50pmol/l ) ,taq 聚合酹 0 8pl(5u/pl),dntps 2p( 10mmol/l )粗提

7、 dna 模板各 1 plo 擴(kuò)增條件:949預(yù)變性4min,94oc變性45s,退火58940s,延 伸72°c60s,32個(gè)循環(huán)，最后72°c保溫5min，見圖1 :腸炎沙門菌；2 :阿柏丁沙門菌；3:雞雛沙門4 :德爾比沙門菌；5 :鼠傷寒沙門菌；6 :產(chǎn)毒素大腸埃希 菌c83902 ; 7 :產(chǎn)毒素大腸埃希菌c83902 ; 8 :福氏志賀2a ; 9 :福氏志賀2b ; 10 :宋氏志賀；"：侵襲性大腸埃希12 :腸炎沙門菌+產(chǎn)毒素大腸埃希甘13 :產(chǎn)毒素大腸埃希菌+福氏志賀2a ; 14 :腸炎沙門菌+福氏志賀2a ; 15 :福氏志賀2a+腸炎沙門菌

8、+產(chǎn)毒素大腸埃希16 :腸炎沙門菌+產(chǎn)毒素大腸埃希菌+福氏志賀2a ;17 :腸炎沙門菌+產(chǎn) 毒素大腸埃希菌+福氏志賀2a圖1多重pcr反應(yīng)檢測結(jié)果（略）2特異性用所建立的方法檢測沙門菌、志賀菌屬、侵襲性大腸埃希菌、腸產(chǎn)毒素大腸埃希菌均擴(kuò)增出特異的、與預(yù)期結(jié)果相符的dna片段,未見非特異性擴(kuò)增帶，且其他的非目的菌株未擴(kuò)增出條帶。m22 3靈敏度 單獨(dú)及多重pcr體系中幾種菌的靈敏度均達(dá)到10-8fg/mh兩體系靈敏度一致,即沙門菌屬為9 13x10-8fg/ml ,志賀菌屬（侵襲性大腸埃希菌）為7 23x10-8fg/pl ,腸產(chǎn)毒素大腸埃希234x10-8fg/pl ,見圖2om : dna

9、 marker ; 1 4 :各模板dna稀釋度分別為10-1 , 10-2 , 10-3 , 倍圖2多重pcr反應(yīng)靈敏度檢測結(jié)果（略）4牛肉中志賀菌的檢測用多重pcr方法從牛肉中共檢測出9個(gè)陽性樣品。經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)衛(wèi)生檢驗(yàn)方法驗(yàn)證均 為陽性7。5試劑盒穩(wěn)定性和重復(fù)性 除taq酶,pcr反應(yīng)液,陰、陽性模板置209貯存外，其余試劑均49條件下貯存。在貯存時(shí)間為 30 , 60 , 90 , 120 , 150 , 180 , 210 , 240 , 270和300d時(shí)取出，用已知pcr陽性樣品檢測試劑盒的穩(wěn) 定性，結(jié)果直到300d,樣品pcr仍呈陽性，說明該試劑盒的有 效期在300d以上。此外,p

10、cr陽性樣品用試劑盒重復(fù)試驗(yàn)3 次，結(jié)果均為陽性;而pcr陰性樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，均為陰性。 說明該試劑盒的重復(fù)性好。3討論本研究在于應(yīng)用多重pcr快速檢測腸道致病菌，考慮到引物間的配對、引物間的競爭性擴(kuò)增、退火溫度等均可影 響多重pcr的擴(kuò)增效果8,因此，查找的序列均具有很 強(qiáng)的保守性，設(shè)計(jì)的3對引物之間不能相互配對，形成二聚 體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，tm值基本一致等。對選取的目的菌株和非 目的菌株同時(shí)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果目的菌株均顯示出特異擴(kuò) 增，而所有非目的菌株均不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，說明引物具有很強(qiáng) 的特異性。多重pcr影響因素復(fù)雜，不同的引物、模板、引 物濃度、模板濃度、mg2+濃度、dntp濃度及其

11、比例、緩沖 液成分與濃度、反應(yīng)體系、循環(huán)參數(shù)等會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的綜合效 應(yīng)9。本體系中10xbuffer,dntpsm板量等對多重?cái)U(kuò)增 的影響不大,taq酹、引物、mg2+濃度、循環(huán)次數(shù)、退火溫 度等對pcr反應(yīng)的特異性和反應(yīng)效率影響較大。通過優(yōu)化pcr反應(yīng)體系和條件，使實(shí)驗(yàn)效果達(dá)到了最佳，且?guī)追N細(xì)隨機(jī)組合的擴(kuò)增也獲成功,未岀現(xiàn)相互間強(qiáng)抑制現(xiàn)象。pcr 試劑盒的穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)表明，該試劑盒重復(fù)性好，有效 期長，特異性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，對待檢樣品要求不高, 檢測時(shí)間更短等。通過對牛肉樣品的檢測，顯示pcr法陽性 率明顯高于培養(yǎng)法，且培養(yǎng)法陽性的樣品,pcr法均為陽性, 說明試驗(yàn)結(jié)果可靠。因此

12、,該試劑盒有一定的應(yīng)用價(jià)值，可在 生產(chǎn)生活中推廣應(yīng)用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】韓文瑜病原細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)m 長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社,1992 : 1-78.2 cohen nd,neibergs hl,megruder ed,et al.genus-specific detection of salmonellae using the polymerase chain reaction (pcr) j j vet diagn invest,1993,5(3):368-371.3 cohen nd,wallis de,neibergs hl,et al.comparison of the polymerase

13、 chain reaction using genus-specific oligonucleotide primers and microbiology culture for the detection of salmonela in drag-swabs from poultry houses j poult sci, 1994,73(8): 1276-1281.4 cohen nd,mcg ruder ed,neibergs hl,et al.detection of salmonella enteritidis in feces from poultry using booster

14、polymerase chai n reacti on and oligonucleotide primers specific for all members of the genus salmonella j poult sci,1994,73(2):354-357.5venkatesa n mm,buysse jm,kopecko dy .use of shigella flexnery ipac and ipah gene sequenee for the general identification of shigella spp.and enterioinvasive e.coli j clin microbiol,1989,27:2671-2691.6stacy-phipps s,mecca jj,weiss jb.multiplex pcr assay and simple preparation method for stool specimens detect enterotoxigenic escherichia