一株產(chǎn)耐高溫漆酶真菌的篩選

1、安徽大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）Journal of Anhui University Natural Science Edition2007年3月第32卷第2期March 2007Vol. 32 No. 2一株產(chǎn)耐高溫漆酶真菌的篩選吳旺寶，鄧澤濤,鄧國志(安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230039)摘 要:從安徽省合肥市西郊的大蜀山上采集了 40余株木腐真菌，將其在含有a -荼酚的鉄皮汁 平板上分離純化后,根據(jù)菌落周圍產(chǎn)生紫色氧化圈的顯著程度篩選出4株漆酶活性較高的菌株，將這4 株真菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定并比較它們所產(chǎn)漆酶的活性，得到一株產(chǎn)酶活力最高的菌株SY04.菌株SY04 在液體培養(yǎng)3d后粗酶

2、液漆酶活力為33OU/mL,在對(duì)其漆酶粗酶液進(jìn)行活性分析后發(fā)現(xiàn),該菌所產(chǎn)漆酶 在60*下保溫30min后,活性不受明顯影響,其最適反應(yīng)溫度為60兀.該菌所產(chǎn)漆酶具有較高的最適反 應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性，具有一定的研究和應(yīng)用價(jià)值.關(guān)鍵詞:漆酶;耐高溫;真菌篩選中圖分類號(hào):Q939.96文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào)：1000 - 2162(2007)02 - 0091-04；=4IIIIMIlf安徽大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）Journal of Anhui University Natural Science Edition2007年3月第32卷第2期March 2007Vol. 32 No. 2安徽大學(xué)學(xué)報(bào)（自

3、然科學(xué)版）Journal of Anhui University Natural Science Edition2007年3月第32卷第2期March 2007Vol. 32 No. 2I!I1漆酶(EC.l.10.3.2)是一種含銅多酚氧化酶,1883年，日本學(xué)者首次從日本漆樹中分離得到漆 酶，后來發(fā)現(xiàn)漆酶廣泛存在于植物、昆蟲、真菌體內(nèi)，細(xì)菌甚至高等動(dòng)物也產(chǎn)生漆酶，但用于漆酶生 產(chǎn)的主要是一些高等真菌，其中擔(dān)子菌亞門的白腐真菌產(chǎn)漆酶能力較強(qiáng)，研究較多漆酶的底物非常 廣泛，主要是酚類化合物、芳胺類、芳香竣酸類、笛體激素及生物色素、金屬有機(jī)化合物等4>53.因此，漆 酶可以用來處理木質(zhì)素、

4、酚類污染物、農(nóng)藥、除草劑等，在環(huán)境保護(hù)、造紙工業(yè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域具有很大 的研究和應(yīng)用價(jià)值，另外，利用漆酶進(jìn)行藥物的修飾加工、功能高分子材料的合成也是近年來研究的熱 點(diǎn)之一熱穩(wěn)定性較好的漆酶因在污水處理、功能高分子的合成等領(lǐng)域具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值而倍受 關(guān)注7,8.本實(shí)驗(yàn)從合肥市大蜀山采集40多個(gè)木腐真菌子實(shí)體，分離純化后從中篩選得到了產(chǎn)漆酶活性較高 的一株真菌,隨后對(duì)該菌進(jìn)行產(chǎn)酶分析和粗酶液性質(zhì)的研究.1材料與培養(yǎng)基1.1種安徽大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）Journal of Anhui University Natural Science Edition2007年3月第32卷第2期March 20

5、07Vol. 32 No. 2主要采集于大蜀山及周邊地區(qū)，從枯死的樹干上采集木腐真菌的子實(shí)體和帶有菌絲體的朽木供菌 種篩選分離.1.2主要試劑和實(shí)驗(yàn)材料 a-蔡酚,分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化工試劑公司生產(chǎn);愈創(chuàng)木酚，分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)其他試劑均為分析純.13培養(yǎng)基U!(1) 菌種篩選培養(yǎng)基:稱取100g鉄皮加適量水，煮沸30rnin后，用四層紗布過濾,在濾液中加入a - 蔡酚至最終濃度為5xlO-4mol/L,pH自然，加瓊月旨條20g融化后定容到1000mL,121遲滅菌30min.(2) 漆酶發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10g/L；鉄皮50g/L；KH2P0415 g/L；MgSO

6、47爲(wèi)0 0.1 g/L,pH自 然,121X.滅菌 30min.(3) 馬鈴薯培養(yǎng)基：將馬鈴薯去皮后取200g切成小塊煮沸30min,4層紗布過濾，取濾液，加 KH2P04 3.0g.MgS041.5g,pH自然,加瓊脂20g融化后定容到1000mL,12代滅菌30mini-12-07f-s isj /i :犬吐寶(1977 -),男，安徽楓陽人，安徽大學(xué)助教.第2期吳旺寶，等:一株產(chǎn)耐高溫漆酶真菌的篩選及其漆酶性質(zhì)的研究952方法2.1產(chǎn)漆酶真菌的篩選(1) 粗篩:用躡子或解剖針從采集到的真菌子實(shí)體或朽木內(nèi)部挑取少量菌絲體或帶有菌絲體的木 屑接種到含有a -蔡酚的鉄皮汁平板上，倒置于28乞

7、培養(yǎng)箱中培養(yǎng).28弋培養(yǎng)3d后，從周圍具有紫色氧化帶的菌落邊緣挑取少量菌絲體進(jìn)行轉(zhuǎn)接,28七培養(yǎng)3d后觀 察,菌落周圍具有紫色氧化帶的菌株具有產(chǎn)漆酶能力.1H從分離到的產(chǎn)漆酶菌株中挑選菌落周圍變色圈較大而顯著的4株真菌，編號(hào)為SY01、SY02、SY03、 SY04,轉(zhuǎn)接到PDA斜面,28兀恒溫培養(yǎng)，形成菌苔后4兀保存.I1(2) 復(fù)篩:將粗篩得到的四株產(chǎn)漆酶真菌接種于PDA平板,培養(yǎng)形成菌苔后刮取適量菌絲體，加無 菌水,用勻漿器打勻，然后取20mL菌絲體懸液接種于200mL的液體搖瓶中，于28弋J20rpm恒溫?fù)u床 培養(yǎng),從培養(yǎng)的第二天起每天從搖瓶中取lmL發(fā)酵液，在pH為4. 5、溫度為2

8、5弋下測(cè)定發(fā)酵液中漆酶 的活性.2.2漆酶活性的測(cè)定r/r in(1) 漆酶粗酶液的制備:在產(chǎn)漆酶菌株液體搖瓶培養(yǎng)一段時(shí)間后，取發(fā)酵混合液用8層紗布過濾、 4000rpm離心后得到的上清液即為粗酶液.(2) 漆酶活性測(cè)定:將18.6mL 50mmol/L pH為4. 5的乙酸-乙酸鈉緩沖液25兀預(yù)熱lOmin后，加 入ImL粗酶液和0.4mL lOmmol/L愈創(chuàng)木酚，組成20mL的反應(yīng)體系,在反應(yīng)溫度為25%時(shí)測(cè)定465nm 處光吸收的增加酶活單位定義為1 min內(nèi)吸光度增加0.01所需要的酶量為一個(gè)酶活單位(I)®。.23真菌SY04漆酶性質(zhì)的研究(1) 漆酶的熱穩(wěn)定性：將粗酶液

9、分別在0兀、10弋、20兀、30匯、40七、50兀、60七和70弋水浴保溫 30min后，在溫度為25P、pH4.5時(shí)測(cè)定漆酶活性,以沒有經(jīng)過保溫處理的漆酶活性作為對(duì)照，計(jì)算剩余 酶活性.(2) 漆酶的pH穩(wěn)定性:將粗酶液分別加入50mmol/L、pH值分別為3.0、40、5.0、60、70和8.0 的乙酸-乙酸鈉緩沖液中,25兀下維持30min后，在溫度為25°C、pH4. 5時(shí)進(jìn)行漆酶活性的測(cè)定，以沒 有經(jīng)過預(yù)處理的漆酶活性作為對(duì)照，計(jì)算剩余酶活性.(3) 漆酶的最適反應(yīng)溫度:將18.6mL濃度為50mmol/L、pH為45的乙酸-乙酸鈉緩沖液分別在I10戲JOX：、20玄、30

10、七、40弋、50七、60七和70咒水浴中預(yù)熱lOmin后，加入0.4mL 10mmol/L的愈創(chuàng)木酚 和ImL粗酶液，在相應(yīng)的溫度下測(cè)定粗酶液的漆酶活力.(4) 漆酶的最適反應(yīng)pH值:在pH分別為3.0.4.0、5.0、6.0.7.0和& 0、濃度為50mmol/L的乙酸 -乙酸鈉緩沖液體系中，測(cè)定25*時(shí)粗酶液的漆酶活力.3結(jié)果3.1產(chǎn)漆酶真菌的篩選1!(1) 初篩:將采集來的真菌子實(shí)體和含有菌絲體的朽木在含有a -荼酚的鉄皮汁平板上分離純化, 得到25株具有紫色氧化圈的真菌，挑選氧化圈較顯著的四株真菌編號(hào)為SY01、SY02、SY03、SY04,轉(zhuǎn)接 在PDA斜面上4T保存.(2)

11、 復(fù)篩:將SY01、SY02、SY03、SY04四株真菌分別于28T ,120rpm搖瓶培養(yǎng)，從培養(yǎng)的第2d起, 每天從搖瓶中取ImL發(fā)酵液，在pH為4.5、溫度為25乞下測(cè)定漆酶活性,得到四株真菌產(chǎn)漆酶活性隨 培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖1所示，圖1表明菌株SY04產(chǎn)漆酶活性最高，在培養(yǎng)第3d時(shí)達(dá)到最高酶活 330UT350培養(yǎng)時(shí)間(d)圖14株真菌在培養(yǎng)不同時(shí)間后產(chǎn)漆酶活性變化曲線-SY01 -SY02 -ASY03 SY043.2真菌SY04漆酶性質(zhì)的研究(1)真菌SY04漆酶的熱穩(wěn)定性:將菌株SY04的粗酶液分別在0、10、20、30、40、50、60兀和70花水 浴中保溫30rnin后，在

12、25弋下測(cè)定剩余漆酶活性，測(cè)定的結(jié)果如圖2所示:真菌SY04漆酶在0 -60龍的 條件下非常穩(wěn)定,60覽下預(yù)處理30min后漆酶活性沒有明顯損失，但溫度超過60龍時(shí),酶活性損失很 快.溫度CC)圖2菌株SY04漆酶的熱穩(wěn)定性pH圖3菌株SY04漆酶pH穩(wěn)定性(2)真菌SY04漆酶的pH穩(wěn)定性:將真菌SY04漆酶粗酶液分別加入pH值為30、40、4. 5.5.0. 6.0J.0和& 0乙酸-乙酸鈉緩沖液中,25*下維持30min后,在pH4. 5、溫度為25弋的條件下進(jìn)行酶 活性的測(cè)定,測(cè)定結(jié)果如圖3所示圖3表明該菌株所產(chǎn)漆酶在pH4.0 5.0之間比較穩(wěn)定，在pH低于I1I1第2期吳旺

13、寶，等:一株產(chǎn)耐高溫漆酶真菌的篩選及其漆酶性質(zhì)的研究#4.0時(shí)，漆酶的活性有一定損失,pH超過5.0后漆酶很快失去活性.(3)真菌SY04漆酶的最適反應(yīng)溫度:分別測(cè)定真菌SY04漆酶粗酶液在0、10、20、30、40、50、60七和70弋下,pH為4.5時(shí)的漆酶活力，得到的結(jié)果如圖4所示.圖4中表明從0弋到60花,SY04粗酶液的 漆酶活力穩(wěn)步上升,但高于60乜活力又開始下降，漆酶活力在40弋和70匯之間都比較高，最適反應(yīng)溫度為60弋.溫度CC)圖4菌株SY04漆酶最適反應(yīng)溫度pH圖5菌株SY04漆酶的最適反應(yīng)pH第2期吳旺寶，等:一株產(chǎn)耐高溫漆酶真菌的篩選及其漆酶性質(zhì)的研究99Y04漆酶的最

14、適反應(yīng)pH值:測(cè)定在溫度為25七、pH分別為30、4.0 4 5、5. 0 6 0、7.0和乞乙酸鈉反應(yīng)體系中菌株SY04粗酶液的漆酶活力,測(cè)定結(jié)果如圖5所示.圖5表明反應(yīng)pH從30到4.5 ,菌株SY04粗酶液的漆酶活力逐漸上升，但大于45后漆酶活力迅速下降，從pH 30到pH 4.5漆酶的活力都比較高，最適反應(yīng)pH值為4.5.4討論很多真菌產(chǎn)漆酶需要酚型化合物的誘導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)采用鉄皮汁作為篩選培養(yǎng)基的氮源和部分碳源，鉄 皮汁中復(fù)雜的木質(zhì)纖維素成分可以作為漆酶的誘導(dǎo)劑，從而促進(jìn)某些產(chǎn)誘導(dǎo)型漆酶的真菌產(chǎn)生漆酶.耐高溫漆酶因在污染物降解等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景而受到人們的關(guān)注本研究篩選到的真菌 產(chǎn)

15、生的漆酶在60*下能保持較髙的活性和穩(wěn)定性，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值.另外該菌株的篩選也為進(jìn) 一步研究漆酶在自然條件下的作用機(jī)制提供了很好的材料.參考文獻(xiàn):134Yoshi H. Chemistry of Lacquer ( Urusht) parti J. J Chem Soc,1883,43 ：472 -486.季立才，胡培植.漆酶的結(jié)構(gòu)功能及應(yīng)用J.氨基酸與生物資源,1996,18(1)：25 -29.許穎,蘭進(jìn)真菌漆酶研究進(jìn)展J食用菌學(xué)報(bào),2005,12( 1) ：57 -64.宋安東，王艷婕，等.漆酶的分子生物學(xué)研究及其應(yīng)用J.信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2004,17(2)：244-

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