RNAⅢ抑制肽抑制葡萄球菌在人工關(guān)節(jié)材料表面粘附的實(shí)驗(yàn)研究

1、RNA抑制肽抑制葡萄球菌在人工關(guān)節(jié)材料表面粘附的實(shí)驗(yàn)研究 作者：郝立波，邢慶昌，王繼芳，王巖，盧世璧，張小斌【摘要】 目的通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RNA抑制肽（RIP）能否抑制葡萄球菌在人工關(guān)節(jié)材料表面黏附，探討其用于人工關(guān)節(jié)感染治療的可行性。方法制作超高分子聚乙烯、鈦合金和鈷鉻鉬合金試樣，葡萄球菌經(jīng)FITC標(biāo)記，人工關(guān)節(jié)材料試樣消毒后接種FITC標(biāo)記的葡萄球菌，每種試樣4組，分別為空白組、RIP組、左氧沙星組和聯(lián)合組，將含有細(xì)菌、試樣和藥物的24孔板在37下孵育30 min后，用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果三種材料的用藥組細(xì)菌光點(diǎn)計(jì)數(shù)（P0.001）和覆蓋面積（P0.05）均顯著低于空白組；左氧組細(xì)菌光點(diǎn)計(jì)

2、數(shù)少于RIP組，但兩組的細(xì)菌覆蓋面積無差別；聯(lián)合組光點(diǎn)計(jì)數(shù)和細(xì)菌覆蓋面積均少于左氧組和RIP組，差別顯著（P0.01）。結(jié)論RIP可以抑制表皮葡萄球菌對(duì)關(guān)節(jié)假體材料表面的粘附，如果與抗生素聯(lián)合應(yīng)用可以起協(xié)同作用。 【關(guān)鍵詞】 人工關(guān)節(jié)； 感染； 葡萄球菌； 黏附； RNA抑制肽 Abstract: ObjectiveTo investigate the inhibiting effects of RNA inhibiting peptide (RIP).On the adhesion ability of staphylococcus on joint implant material sur

3、face,determine the feasibility of RIP on prevention and treatment of infection from total joint replacement. MethodStaphylococcus cells were marked with FITC,and cultivated together with commonly used biomaterials:Ti alloy,CoCmo alloy,and UHMWPE.Photos were taken twith fluorescence microscope and an

4、alyzed with Photoshop 9.0 and Image pro plus 6.0 software to study the adhesion difference between control,RIP ,Levofloxacin,and RIP+Levofloxacin groups.ResultRIP significantly reduced cell adhesion to the joint implant material surface(P Key words：total joint arthroplasty; infection; staphylococcus

5、; adhesion; RNA-inhibiting peptide 人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染診斷治療困難，主要原因是細(xì)菌在假體表面形成生物被膜，生物被膜保護(hù)細(xì)菌對(duì)抗不利的外界環(huán)境，阻止抗體、細(xì)胞和抗生素殺滅被膜內(nèi)細(xì)菌，而且生物被膜不易被清除，導(dǎo)致感染遷延不愈和必須取出假體13。細(xì)菌黏附在假體表面是生物被膜形成的始動(dòng)階段，也是最重要的階段，抑制細(xì)菌的黏附則可以抑制生物被膜形成，對(duì)于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染具有重要意義3。 細(xì)菌生物被膜形成過程受 “群體感應(yīng)信號(hào)(quorum sensing，QS)”機(jī)制調(diào)節(jié)4。抑制這一細(xì)菌間的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制以抑制細(xì)菌的黏附、生物被膜形成和毒素分泌，進(jìn)而預(yù)防和控制感

6、染，是一條有別于抗生素的感染治療新途徑5。RNAIII抑制肽(RIP)是最近發(fā)現(xiàn)的葡萄球菌QS有效抑制劑，具有預(yù)防和治療葡萄球菌感染的潛在價(jià)值6、7。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RIP能否抑制葡萄球菌在人工關(guān)節(jié)材料表面黏附，探討其用于人工關(guān)節(jié)感染治療的可行性。 1 材料和方法 1.1 人工關(guān)節(jié)材料試樣 超高分子聚乙烯、鈦合金和鈷鉻鉬合金試樣由北京力達(dá)康公司加工制作，直徑10 mm，厚度2 mm，各24枚，表面拋光(圖1)。 1.2 細(xì)菌標(biāo)記 表皮葡萄球菌ATCC 35984源自Naomi Balaban，由上海復(fù)旦大學(xué)范長(zhǎng)勝教授轉(zhuǎn)贈(zèng)。挑取單個(gè)菌落接種于50 mlTSB培養(yǎng)基內(nèi)，在37、150 r/

7、min培養(yǎng)箱中搖晃過夜。取20 ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期菌液，離心后從上清液收集細(xì)菌，懸浮于含10 mg FITC、由1.5 mlPBS和10.5 ml碳酸氫鈉(0.5 mol/L pH 9.5)組成的混合溶液中進(jìn)行FITC標(biāo)記，大幅度攪拌菌液，4培養(yǎng)過夜。用0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液將菌液離心洗滌3次，用比濁儀調(diào)配成0.5 Mc的PBS菌液備用。 1.3 RIP合成 有機(jī)化學(xué)固相Fmoc法合成RIP，由C端至N端合成，即將該多肽C端的第一個(gè)Fmoc-AA的羧基活化后與HMP樹脂結(jié)合，再脫去Fmoc-保護(hù)基，與第二個(gè)羧基活化的Fmoc-AA結(jié)合，循環(huán)重復(fù)，直至合成肽樹脂。然后用TFA將合成的肽從肽

8、樹脂上切下，得到粗品肽。應(yīng)用Waters600高效液相色譜儀對(duì)合成得到的RIP粗品進(jìn)行純化，洗脫系統(tǒng)為：A液：50 ml/L乙腈H2O溶液；B液：950 mlL乙腈H2O溶液。手動(dòng)加樣，每次1 ml，流速4 mlmin，線性梯度，30 min。B液從50 ml/L增加至500 ml/L，然后在5min內(nèi)增加到950 ml/L，B液做最后洗脫。用紫外分光光度計(jì)在214 nm波段檢測(cè)吸收光譜，按峰收集組分，凍干，制成純品RIP備用。 1.4 粘附實(shí)驗(yàn) 人工關(guān)節(jié)材料試樣在121溫度下高壓消毒25 min，烘干后放入無菌24孔板內(nèi)。將FITC標(biāo)記的細(xì)菌細(xì)胞按1100用PBS液稀釋，按106個(gè)細(xì)菌(90

9、0 lPBS)孔的標(biāo)準(zhǔn)將菌液滴入24孔板內(nèi)。分組如下：超高分子聚乙烯、鈦合金和鈷鉻鉬合金試樣各24枚，分為4組，每組各6枚。4組分別為空白組、RIP組、左氧沙星組和聯(lián)合組，空白組每孔內(nèi)加入50 l含0.75%DMSO的生理鹽水，RIP組每孔加入50 l含有濃度為lmgmlRIP的0.75%DMSO溶液，左氧氟沙星組每孔加入50 l含100 g左氧氟沙星的水溶液，聯(lián)合組用藥劑量參照上述兩組。將含有細(xì)菌和試樣的24孔板在37下孵育30 min，取出材料試樣，PBS沖洗后，用熒光顯微鏡在400 nm波段進(jìn)行觀察、拍照。 1.5 圖像采集和數(shù)據(jù)處理 在40倍物鏡下用熒光顯微鏡拍照，采用image pr

10、o plus 6.0軟件對(duì)數(shù)字圖像進(jìn)行熒光光點(diǎn)計(jì)數(shù)和熒光覆蓋面積比計(jì)算，結(jié)果為細(xì)菌數(shù)和細(xì)菌覆蓋面積。獲得的結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，a=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05為差異有顯著性。 2 結(jié)果 三種材料的用藥組細(xì)菌光點(diǎn)計(jì)數(shù)(P<0.001)和覆蓋面積(P<0.05)均顯著低于空白組；左氧組細(xì)菌光點(diǎn)計(jì)數(shù)少于RIP組，但兩組的細(xì)菌覆蓋面積并無差別；聯(lián)合組光點(diǎn)計(jì)數(shù)和細(xì)菌覆蓋面積均少于左氧組和RIP組，差別顯著(P<0.01)(表1、2、3和圖2、3、4)。 表1 RIP對(duì)表皮

11、葡萄球菌在超高分子聚乙烯表面粘附的影響分組細(xì)菌對(duì)材料表面的粘附注：與空白組相比P<0.05，P<0.01，P<0.001； 與RIP組相比P<0.05，P<0.01； 與左氧組相比P<0.05，P<0.01。 (下同)表2 RIP對(duì)表皮葡萄球菌在鈦合金表面粘附的影響分組細(xì)菌對(duì)材料表面的粘附表3 RIP對(duì)表皮葡萄球菌在鈷鉻鉬合金表面粘附的影響分組細(xì)菌對(duì)材料表面的粘附 3 討論 生物被膜對(duì)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染可能起到如下影響：（1）生物被膜是引起關(guān)節(jié)置換感染的原因之一，多數(shù)關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染是慢性感染，

12、其始動(dòng)環(huán)節(jié)是手術(shù)當(dāng)中污染的細(xì)菌，這些細(xì)菌在假體表面黏附并形成生物被膜，被膜內(nèi)細(xì)菌無法被殺滅，逐步發(fā)展成感染；（2）生物被膜增加了感染診斷的難度，生物被膜感染的細(xì)菌局限在被膜內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)方法，如穿刺培養(yǎng)等很難采集到細(xì)菌；（3）生物被膜使感染治療困難，尤其是人工關(guān)節(jié)感染，如不取出假體并徹底清創(chuàng)，一般很難治愈?；谏鲜龇治觯髡哒J(rèn)為，抑制細(xì)菌在假體表面形成生物被膜對(duì)預(yù)防和治療人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染具有價(jià)值。 細(xì)菌黏附在內(nèi)植物表面是生物被膜形成的起始步驟，如果能夠抑制細(xì)菌在假體表面的黏附，則可抑制生物被膜形成。但是目前抑制細(xì)菌黏附的方法不多，包括：（1）植入體內(nèi)的假體必須非常潔凈，在植入時(shí)才從包裝內(nèi)取出

13、，最大限度減少細(xì)菌的黏附；（2）設(shè)計(jì)能夠抵抗細(xì)菌黏附的內(nèi)植物材料，如在內(nèi)植物材料內(nèi)加入銀離子；（3）在內(nèi)植物材料表面涂層抗生素。上述方法效果均有限7、8。 圖1常用骨科內(nèi)植物材料（從左到右依次為鈦合金、高分子聚乙烯、鈷鉻鉬合金） 圖2RIP對(duì)表皮葡萄球菌在聚乙烯材料表面粘附的影響 圖2a空白組（246，1.33%，×40） 圖2bRIP組（127，0.78%，×40） 圖2c左氧組（69，0.161%，×40） 圖2d聯(lián)合組（49，0.076%，×40） 圖3RIP對(duì)表皮葡萄球菌在鈦合金材料表面粘附的影響 圖3a空白組（338，2.75%，×4

14、0） 圖3bRIP組（192，1.77%，×40） 圖3c左氧組（43，0.72%，×40） 圖3d聯(lián)合組（12，0.62%，×40） 圖4RIP對(duì)表皮葡萄球菌在鈷鉻鉬合金材料表面黏附的影響 圖4a空白組（293，2.86%，×40） 圖4b左氧組（74，1.48%，×40） 圖3cRIP組（98，0.61%，×40） 圖4d聯(lián)合組（13，0.23%，×40） RNA抑制肽(RIP)是一種人工合成的7肽，可以抑制葡萄球菌的QS系統(tǒng)，體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明RIP治療葡萄球菌感染有效，而且一些研究證明RIP能夠抑制葡萄球菌在人上

15、皮細(xì)胞和塑料表面的黏附。本研究目的是驗(yàn)證RIP抑制葡萄球菌在人工關(guān)節(jié)材料表面黏附的作用。結(jié)果顯示各用藥組的聚乙烯、鈦合金和鈷鉻鉬合金表面熒光光點(diǎn)個(gè)數(shù)和細(xì)菌覆蓋面積均明顯少于空白組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.001)，而聯(lián)合用藥明顯優(yōu)于單用RIP和左氧氟沙星。上述結(jié)果說明RIP可以抑制表皮葡萄球菌對(duì)關(guān)節(jié)假體材料表面的粘附，如果與抗生素聯(lián)合應(yīng)用可以起協(xié)同作用。需指出的是，盡管左氧組的熒光光點(diǎn)計(jì)數(shù)要明顯少于RIP組(P<0.05)，但在細(xì)菌覆蓋面積方面兩組并無明顯差別(P>0.05)，這一結(jié)果在某種意義上說明在局部抗生素作用下細(xì)菌

16、更趨向于聚集生長(zhǎng)、黏附和形成生物被膜，加強(qiáng)自身的保護(hù)作用，而抗生素雖能殺滅浮游細(xì)菌，但抑制細(xì)菌黏附和形成生物被膜的能力較有限，更難以殺滅被膜內(nèi)細(xì)菌，因此應(yīng)用抗生素同時(shí)復(fù)合能夠抑制細(xì)菌黏附和形成生物被膜的RIP對(duì)預(yù)防和治療感染非常有意義。 RNA抑制肽(RIP)作用機(jī)理如下711：葡萄球菌的群體感應(yīng)機(jī)制被縮寫為SQS，該機(jī)制在細(xì)菌增殖早期控制細(xì)菌表達(dá)黏附分子，促進(jìn)細(xì)菌在內(nèi)植物表面黏附，在增殖中晚期調(diào)整其表達(dá)，使細(xì)菌分泌毒素，引起癥狀。已發(fā)現(xiàn)葡萄球菌有兩套QS通路，SQSl和SQS 26。SQSl由自誘導(dǎo)肽-RAP及其目標(biāo)分子TRAP組成。細(xì)菌在增殖時(shí)開始分泌RAP，RAP達(dá)到閾值濃度后使TRAP

17、發(fā)生組氨酸磷酸化。TRAP磷酸化通過一種未知機(jī)制激活基因調(diào)控系統(tǒng)agr，后者編碼第二套群體感應(yīng)系統(tǒng)-SQS2。SQS2由agr的產(chǎn)物組成。Agr編碼兩種轉(zhuǎn)錄方向不同的轉(zhuǎn)錄物RNA和RNA。RNAII編碼AgrA、B、C和D。AgrD是一種自誘導(dǎo)前肽，在細(xì)菌增殖的冥數(shù)階段中期自動(dòng)分泌，修飾為一種八肽-AlP，AgrB協(xié)助AlP產(chǎn)生和分泌，AgrC和AgrA是一個(gè)二組分系統(tǒng)，AgrC為AlP的感受器，AgrA為調(diào)節(jié)器。一旦agr系統(tǒng)被激活并開始分泌AIP，將引起AgrC的磷酸化，導(dǎo)致RNA產(chǎn)生。RNA調(diào)節(jié)毒素(如腸毒素B、C、D和溶血素以及休克綜合癥毒素-1)和細(xì)胞表面蛋白(如蛋白A和纖連蛋白)的

18、分泌。RNA抑制肽(RIP)與RAP結(jié)構(gòu)相似，競(jìng)爭(zhēng)性抑制TRAP的磷酸化，從而阻礙葡萄球菌的QS系統(tǒng)發(fā)揮作用【參考文獻(xiàn)】 1 王巖，郝立波，等.人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染的臨床經(jīng)驗(yàn)分析J.中華外科雜志，2005，43：1313-1316.2 郝立波，韓黎，王巖，等.髖關(guān)節(jié)置換后感染的微生物學(xué)分析和生物被膜研究J.微生物學(xué)通報(bào)，2005，32：124-128.3 Trampuz AJ, Osmon DR, Hanssen AD,et al. Molecular and antibiofilm approaches to prosthetic joint infectionJ. Clin Orth R

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