宏基因組測序技術(shù)檢測方法

1、宏基因組測序技術(shù)檢測標(biāo)準(zhǔn)簡介：宏基因組測序介紹宏基因組學(xué)是以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，通過現(xiàn)代基 因組技術(shù)手段包括功能基因的篩選和測序分析，對環(huán)境中微生物多樣性、種群結(jié) 構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系以及環(huán)境之間的關(guān)系進(jìn)行研究的新的微 生物研究方法。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，為宏基因組學(xué)研究提供了新的理想 研究方法。高通量測序的方法無需分離環(huán)境中各種微生物， 也無需構(gòu)建克隆文庫 就可以直接對環(huán)境中所有微生物進(jìn)行測序。 可以真實客觀的反映環(huán)境中微生物的 多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系等。目前乂可以分為針對16s DNA/18sDNA/ITS測序和針對宏基因組全序列的測序研究。下面

2、就是對這兩者的具體介紹。一、16s DNA/18s DNA/ITS 測序16sDNA是最常用的微生物物種分子鑒定的標(biāo)簽，通過對樣品中16sDNA 測序可以鑒定其中微生物物種的豐度和分布情況。目前，普遍使用 Roche 454 平臺來對環(huán)境樣品進(jìn)行16s DNA測序。因為16s DNA序列比較相似，讀長短的 話，難以進(jìn)行有效的比對，而 454平臺的平均讀長在400bp左右，可以很好的 避免此類問題。二、宏基因組全測序在這種測序方式中，我們可以假定一個環(huán)境中的所有微生物就是一個整體， 然后對其中所有的微生物進(jìn)行測序。這樣我們就可以研究樣品中的功能基因以及 其在環(huán)境中所起的作用而不用關(guān)心其來自哪個微

3、生物?？梢园l(fā)現(xiàn)新的基因，可以進(jìn)行基因的預(yù)測，甚至有可能得到某個細(xì)菌基因組的全序列。 此外，該項測序不 單可以針對DNA水平，也可以針對全RNA進(jìn)行基因表達(dá)水平的研究。樣品處理：宏基因組樣品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮膚和糞便。 樣品采集遵照樣品采集規(guī)范（人）所規(guī)定的操作來進(jìn)行。盡量留足備份樣品。核酸提?。汉昊蚪M核酸提取主要有兩種方法： 膜過濾法和直接裂解提取。對于液體樣品如痰液，灌洗液兩種方法都適用，對丁固體樣品如糞便宜采用直接裂解的方法。核 酸提取后用 NanoDrop ND-1000測定，260/280 = 1.8-2.0, 260/230 = 1.8-2.0,電 泳

4、檢測DNA應(yīng)是完整的一條帶。測序 Sequencing1) 16S/18S 測序：Sanger 測序：用丁低通量的16S/18S DNA測序，提取宏基因組后，首先通過PCR將16S/18S 序列擴(kuò)增出來，再將其連接到克隆載體上，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，涂平板做藍(lán)白斑篩 選，選出陽性克隆提質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行測序反應(yīng)，測序反應(yīng)后純化后用ABI 3130或ABI 3730進(jìn)行毛細(xì)管電泳測序。由丁其測序準(zhǔn)確率比較高，而通量非常低，現(xiàn)通常用做二代測序結(jié)果的驗證。454 Platform:454 平臺主要包括兩種測序系統(tǒng)：454 GS FLX+ Systeft 454 GS Junior SysteE54 GS F

5、LX+ Systems序讀長可以達(dá)到 600-1000bp,通量 450-700M , GS Junior System 測序讀長在400bp左右，通量在35M。Library PrAparationnboiQirnai RNA tungau froni MmpiQg usingrusfitim primers.$»qu&ncing Am>rHNA Amphcanadwwl址 inijan-rriPCR and 同時m 日 mving thv GS FLJC+ CXLR79 Ssiqiivngiing Mil wiiyj er JuniarDala Atwlysit U

6、ullirt o vanely of friw end ccwmimvrcifit wTtwaris wirnlcrdbiHil pdpulJlIon d訶目andmalkA ±«mipans；an9. GS Ampli|»is-n WnriAnt A.iFi-alyTQr (AVAJ sanwore* GE Riltrin>E4 MnpptF uflwira Public n>QLfl|4HQinqlC in«|i)r»li< EqqI Figure1 2： WcpirkHI dl a ribasd>hial rfiM

7、A AmfHlie>anequenung experivnenL LFmry piBpaiabDn using a dirBoUo- nai pMiiier com<wi to # spocies miigiroion uf nws Speths im a !j«qLM<icmg ami. For detailed irriorriarL maiccom.文庫構(gòu)建：用fusion Primer擴(kuò)增核糖體RNA將已擴(kuò)增的rRNA直接做乳液PCR在GSFLX+和GS Junior系統(tǒng)上進(jìn)行測序。測序深度：數(shù)據(jù)分析：使用免費的軟件包對微生物的種群多樣性進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行比較

8、1. MEGAN 一個宏基因組分析工具，可以在大量的測序數(shù)據(jù)中對測序結(jié)果進(jìn)行 聚類分析。2. MG-RAST用丁注釋宏基因組樣品的全自動軟件。3. IMG/M :基丁宏基因組序列微生物群體的功能性。4. CAMERA致力丁微生物生態(tài)學(xué)研究。5. CARMA可以通過未拼接的序列來進(jìn)行物種組成和微生物的遺傳潛力的研究。6. GALAXY用丁高等真核生物的研究，例如昆蟲等。7. Greengenes 16S rRNA的數(shù)據(jù)庫，可以用來做16S rRNA的比對。8. QIIME:針對454測序數(shù)據(jù)的宏基因組分析。9. The Ribosome Database Project RDP :針對焦磷酸測序

9、的分析方法。Miseq Platform:Miseq平臺讀長可以是 2X250bp或2X300b使用Miseq Reagent Kit V2可以 產(chǎn)出7.5-8.5Gb的數(shù)據(jù)，使用 Miseq Reagent Kit V3可以產(chǎn)出13.2-15Gb的數(shù)據(jù)。Rgur&1:16S Amplicon Sequencing WorkflowDesign and order region of inhrest spocific pfimerawith Qvarharig adaptera白 Mmpia帕 Hbrary by PCRt>y PCRNonnalize and pool hbra

10、msPertDrm autonialed cluster generation and sequencing on the MiSeq systemVie# data 如ng the MotaganomW 1BS rRNAWwkflcw in MiSeq Reporter w A/npiiconVtewfrr In HaseSpaca16S uniplcon gqwxuig 的 u utarnw舊。皿心 yokx心 kr 0噂 Ml wq 日 V鳴 indiiring 呻沖 pnmrinn.urrl 劇心月 小腳畝with ooimhumerri： sctwaB far reviaving r

11、HBijite文庫構(gòu)建：根據(jù)感興趣的片段設(shè)計引物，通過PCRT增出片段做為模板構(gòu)建文庫。使用 Nextera XT Sample Prep Kit構(gòu)建文庫，按照試劑盒說明書操作。將建好的文庫歸 一化處理并將其混到一起。在 Miseq系統(tǒng)里自動進(jìn)行成簇反應(yīng)，進(jìn)而完成測序。 文庫檢驗：用Agilent 2100檢測文庫大小片段是否與預(yù)期一致。文庫片段是否集中。 測序深度：16S rRNA測序深度應(yīng)至少在50,000條reads以上，以保證較好的覆蓋度。 數(shù)據(jù)分析：對微生物生態(tài)進(jìn)行定量觀察Greengenes 16S rRNAS因數(shù)據(jù)庫和分析工具； 宏基因組分析工具：MEGAN 核糖體數(shù)據(jù)庫計劃（R

12、DP）Ion Torrent Platform:Ion Torrent平臺主要有兩個測序系統(tǒng)：Ion PGM SystemB Ion Proton System Ion PGM有兩種讀長，200bp和400bp,Ion PGM主要應(yīng)用三種芯片，Ion 314 Chip, Ion 316 Chip和Ion 318 Chip,最多數(shù)據(jù)產(chǎn)出可以達(dá)到 2Gb。Ion Proton讀長為200bp, 最多數(shù)據(jù)產(chǎn)出可達(dá)到10Gb。文庫構(gòu)建：使用 Ion Plus Fragment LibraryKi的 16S rRNA增產(chǎn)物加上 barcode 標(biāo)簽，一 共有96個barcode可以選擇。加上標(biāo)簽后使用I

13、on PGM? Template OT2 200 Kit 在Ion OneTouch? DLSystem±進(jìn)行乳液PCR完成文庫構(gòu)建。測序時根據(jù)需要不 同的讀長選擇不同的測序試劑盒。測序深度：對于人體腸道微生物16S rRNA測序，對于檢測高豐度的樣品，每個樣品至 少要測10000條reads,而對于檢測低豐度的樣品，則需要1,000,000以上的reads 數(shù)。2）全宏基因組測序 Whole-metagenomics SequencingRoche 454 platform:文庫構(gòu)建：提取宏基因組DNA,總量不低丁 10ug,且樣品DNA應(yīng)相對完整。使用GS FLX Titaniu

14、m Rapid Library Preparation Kit構(gòu)建文庫，按照說明書進(jìn)行相應(yīng)操作。文庫檢驗：DNA reads數(shù)與微球的比例在8%左右，可以達(dá)到比較理想的測序結(jié)果。 測序深度：每個樣品應(yīng)至少保證10,000條以上的reads數(shù)。Hiseq platform:Hiseq平臺主要有Hiseq 2000和Hiseq 2500兩個測序系統(tǒng)。Hiseq 2000測序 讀長是2X100bp Paired-end測序，一次運行通量可達(dá) 600Gb以上，Hiseq 2500有 兩種運行模式：快速運行和高通量，快速運行可以達(dá)到2X150bp,產(chǎn)生最多180Gb 的數(shù)據(jù)，高通量讀長在2X125bp,數(shù)據(jù)產(chǎn)出在600Gb以上。文庫構(gòu)建：將提取的宏基因組 DNA用Covaris M220片段化后，使用 Truseq DNA XT/LT Sample Prep Kit (illumina)按照protocol進(jìn)行文庫構(gòu)建,DNA起始投入量應(yīng)在1ug 以上。文庫檢驗：將建好的宏基因組文庫使用