實驗細菌的簡單染色和革蘭氏染色學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1實驗細菌的簡單實驗細菌的簡單(jindn)染色和革蘭氏染染色和革蘭氏染色色第一頁，共27頁。革蘭氏染色革蘭氏染色(rns)C.Gram（革蘭）于（革蘭）于1884年發(fā)明年發(fā)明(fmng)的一種鑒別不同類的一種鑒別不同類型細菌的染色方法。型細菌的染色方法。第1頁/共26頁第二頁，共27頁。用堿性染料用堿性染料(rnlio)結(jié)晶紫對菌液涂片進行初染結(jié)晶紫對菌液涂片進行初染用碘溶液進行媒染，其作用是提高染料用碘溶液進行媒染，其作用是提高染料(rnlio)和細和細 胞間的相互作用從而使二者結(jié)合得更牢固。胞間的相互作用從而使二者結(jié)合得更牢固。用乙醇或丙酮沖洗進行脫色用乙醇或丙酮沖洗進行脫色(tu

2、 s)。在經(jīng)歷脫色。在經(jīng)歷脫色(tu s)后后 仍將結(jié)晶紫保留在細胞內(nèi)的為革蘭氏陽性細仍將結(jié)晶紫保留在細胞內(nèi)的為革蘭氏陽性細 菌，而革蘭氏陰性細菌的結(jié)晶紫被洗掉，細菌，而革蘭氏陰性細菌的結(jié)晶紫被洗掉，細 胞呈無色。胞呈無色。用一種與結(jié)晶紫具有不同顏色的堿性染料對用一種與結(jié)晶紫具有不同顏色的堿性染料對 涂片進行復(fù)染。例如沙黃，它使原來無色的涂片進行復(fù)染。例如沙黃，它使原來無色的 革蘭氏陰性細菌最后呈現(xiàn)桃紅到紅色，而革革蘭氏陰性細菌最后呈現(xiàn)桃紅到紅色，而革 蘭氏陽性細菌繼續(xù)保持深紫色蘭氏陽性細菌繼續(xù)保持深紫色第2頁/共26頁第三頁，共27頁。第3頁/共26頁第四頁，共27頁。第4頁/共26頁第五頁

3、，共27頁。第5頁/共26頁第六頁，共27頁。1 1 學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)(xux)(xux)制染色片技術(shù)，學(xué)習(xí)制染色片技術(shù)，學(xué)習(xí)(xux)(xux)簡單染色簡單染色 革蘭氏染色原理，理解著色機理。革蘭氏染色原理，理解著色機理。學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)(xux)(xux)并掌握無菌操作的技術(shù)。并掌握無菌操作的技術(shù)。3 3 掌握簡單染色掌握簡單染色 革蘭氏染色的方法，并能正確染色革蘭氏染色的方法，并能正確染色4 4 鞏固顯微鏡油鏡的使用方法。鞏固顯微鏡油鏡的使用方法。第6頁/共26頁第七頁，共27頁。二二 基本原理基本原理第7頁/共26頁第八頁，共27頁。l細菌細胞微小，且含水量較多，在普通光鏡下表現(xiàn)為無色透明，不易觀察，

4、所以必細菌細胞微小，且含水量較多，在普通光鏡下表現(xiàn)為無色透明，不易觀察，所以必須進行染色處理，使細胞著色須進行染色處理，使細胞著色(zhu s)(zhu s)，便于觀察。，便于觀察。l簡單染色是使用單一染料染色，可用于觀察細菌形態(tài)、大小、及排列方式簡單染色是使用單一染料染色，可用于觀察細菌形態(tài)、大小、及排列方式. .l染色前一般要將細胞固定，其目的是殺死菌體并使之粘附于玻片上，還可以增強菌染色前一般要將細胞固定，其目的是殺死菌體并使之粘附于玻片上，還可以增強菌體的著色體的著色(zhu s)(zhu s)能力。固定有加熱法和化學(xué)法兩種，無論采用何種方法均應(yīng)維持能力。固定有加熱法和化學(xué)法兩種，無論

5、采用何種方法均應(yīng)維持細胞原有形態(tài)。細胞原有形態(tài)。 （一）細菌（一）細菌(xjn)(xjn)的簡單染的簡單染色原理色原理第8頁/共26頁第九頁，共27頁。 革蘭氏染色是用于細菌鑒別的一種重要染色方法。它是根據(jù)革蘭氏陽性細菌、陰性細菌細胞壁結(jié)構(gòu)、組成的不同而使用一系列的染色處理使之差別革蘭氏染色是用于細菌鑒別的一種重要染色方法。它是根據(jù)革蘭氏陽性細菌、陰性細菌細胞壁結(jié)構(gòu)、組成的不同而使用一系列的染色處理使之差別(chbi)(chbi)顯色。其染色方法是先將細菌分別用結(jié)晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脫色，再經(jīng)復(fù)染劑復(fù)染。最終被染成紅色的是革蘭氏陰性細菌；被染成紫色的是革蘭氏陽性細菌。顯色。其染色方法是先

6、將細菌分別用結(jié)晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脫色，再經(jīng)復(fù)染劑復(fù)染。最終被染成紅色的是革蘭氏陰性細菌；被染成紫色的是革蘭氏陽性細菌。第9頁/共26頁第十頁，共27頁。占細胞壁占細胞壁的的10%占細胞壁的占細胞壁的90%第10頁/共26頁第十一頁，共27頁。第11頁/共26頁第十二頁，共27頁。1 1、細胞壁、細胞壁 革蘭氏陽性革蘭氏陽性(yngxng)細菌的細胞壁細菌的細胞壁第12頁/共26頁第十三頁，共27頁。革蘭氏染色革蘭氏染色(rns)與細胞壁：與細胞壁：革蘭氏陽性革蘭氏陽性(yngxng)陰性細菌的細胞壁對比陰性細菌的細胞壁對比占占細細胞胞壁壁干干重重的的%成成分分革蘭氏陽性細菌革蘭氏陰性細

7、菌肽聚糖含量很高（5090）含量很低（10）磷壁酸含量較高（50）無類脂質(zhì)一般無（2）含量較高（20）蛋白質(zhì)無含量較高第13頁/共26頁第十四頁，共27頁。v革蘭氏染色原理：革蘭氏染色原理：v第一步：結(jié)晶紫使菌體著上紫色第一步：結(jié)晶紫使菌體著上紫色v第二步：碘和結(jié)晶紫形成大分子復(fù)合物，分子大，能被細第二步：碘和結(jié)晶紫形成大分子復(fù)合物，分子大，能被細胞壁阻留在細胞內(nèi)。胞壁阻留在細胞內(nèi)。v第三步：酒精脫色，細胞壁成分和構(gòu)造不同，出現(xiàn)不同的第三步：酒精脫色，細胞壁成分和構(gòu)造不同，出現(xiàn)不同的反應(yīng)。反應(yīng)。vG+ G+ 菌：細胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，當(dāng)乙醇脫色菌：細胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，

8、當(dāng)乙醇脫色時，肽聚糖因脫水而孔徑時，肽聚糖因脫水而孔徑(kngjng)(kngjng)縮小，故結(jié)晶紫縮小，故結(jié)晶紫- -碘復(fù)碘復(fù)合物被阻留在細胞內(nèi)，細胞不能被酒精脫色，仍呈紫色。合物被阻留在細胞內(nèi)，細胞不能被酒精脫色，仍呈紫色。vGG菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，因其含脂量高縮，因其含脂量高, ,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫- -碘復(fù)碘復(fù)合物溶出細胞壁，酒精將細胞脫色，細胞無色，蕃紅復(fù)染后合物溶出細胞壁，酒精將細胞脫色，細胞無色，蕃紅復(fù)染后呈紅色。呈紅色。第14頁/共26頁第十五頁，共27頁。

9、1234？第15頁/共26頁第十六頁，共27頁。大腸桿菌大腸桿菌(d chn n jn)(d chn n jn)（24 h 24 h 培養(yǎng)）斜面菌種培養(yǎng)）斜面菌種枯草桿菌（枯草桿菌（16 h 16 h 培養(yǎng)）斜面菌種培養(yǎng)）斜面菌種第16頁/共26頁第十七頁，共27頁。無菌操作：不讓除我們接種無菌操作：不讓除我們接種(jizhng)的微的微生物以外生物以外 其它微生物侵入的技術(shù)。其它微生物侵入的技術(shù)。第17頁/共26頁第十八頁，共27頁。第18頁/共26頁第十九頁，共27頁。1 1涂片：載玻片、無菌水、斜面菌種、無菌操作、均勻的薄層涂片：載玻片、無菌水、斜面菌種、無菌操作、均勻的薄層2 2干燥：

10、干燥：3 3固定：加熱固定固定：加熱固定4 4染色：結(jié)晶紫染染色：結(jié)晶紫染1min1min或蕃紅染或蕃紅染2-3min2-3min或石炭酸復(fù)紅染或石炭酸復(fù)紅染1min1min。5 5水洗：水洗：6 6 干燥：干燥：7 7鏡檢：低倍鏡觀察鏡檢：低倍鏡觀察(gunch)(gunch)以確定目標(biāo)和范圍，再換用油鏡觀察以確定目標(biāo)和范圍，再換用油鏡觀察(gunch)(gunch)繪圖。繪圖。 五五 操作步驟操作步驟第19頁/共26頁第二十頁，共27頁。第20頁/共26頁第二十一頁，共27頁。1 1涂片：方法同單染色，然后干燥、固定。涂片：方法同單染色，然后干燥、固定。2 2初染：滴加結(jié)晶紫染色初染：滴加

11、結(jié)晶紫染色1min1min，后用水沖洗。，后用水沖洗。3 3媒染：滴加碘液染色媒染：滴加碘液染色1-2min1-2min，后用水沖洗，甩盡殘余水，后用水沖洗，甩盡殘余水4 4脫色：用脫色：用95%95%乙醇沖洗乙醇沖洗3030秒（需要嚴格控制時間和濃度），秒（需要嚴格控制時間和濃度）， 然后立即然后立即(lj)(lj)用水沖洗。用水沖洗。5 5復(fù)染：用蕃紅或石炭酸復(fù)紅覆蓋涂片進行復(fù)染，蕃紅染復(fù)染：用蕃紅或石炭酸復(fù)紅覆蓋涂片進行復(fù)染，蕃紅染 2-3min 2-3min，如果石炭酸復(fù)紅染，如果石炭酸復(fù)紅染1min1min。水洗，晾干。水洗，晾干。6 6鏡檢：先用低倍鏡觀察，后用油鏡觀察鏡檢：先用低

12、倍鏡觀察，后用油鏡觀察第21頁/共26頁第二十二頁，共27頁。陽性菌陽性菌陰性菌陰性菌1234第22頁/共26頁第二十三頁，共27頁。1 寫出實驗?zāi)康膶懗鰧嶒災(zāi)康? 寫出簡單染色、革蘭氏染色的基本原理寫出簡單染色、革蘭氏染色的基本原理3 根據(jù)根據(jù)(gnj)實驗結(jié)果繪出簡單染色和革蘭氏染色的結(jié)果圖。實驗結(jié)果繪出簡單染色和革蘭氏染色的結(jié)果圖。第23頁/共26頁第二十四頁，共27頁。菌名：放大(fngd)倍數(shù)：細菌簡單細菌簡單(jindn)染色結(jié)果圖染色結(jié)果圖細菌革蘭氏染色結(jié)果圖細菌革蘭氏染色結(jié)果圖 要求要求(yoqi)： 標(biāo)出菌名、顏色、陽性或陰性菌標(biāo)出菌名、顏色、陽性或陰性菌放大倍數(shù)： 第24頁

13、/共26頁第二十五頁，共27頁。1 1 細菌細菌(xjn)(xjn)簡單染色操作過程中應(yīng)注意哪些事項？簡單染色操作過程中應(yīng)注意哪些事項？2 2 如果對一未知菌進行革蘭氏染色，如何能確證染色結(jié)果正確可靠？如果對一未知菌進行革蘭氏染色，如何能確證染色結(jié)果正確可靠？3 3 為什么說為什么說95%95%酒精脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟？酒精脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟？ 下次實驗內(nèi)容：下次實驗內(nèi)容：實驗四實驗四 微生物細胞大小的測定微生物細胞大小的測定(cdng)(cdng)及顯微鏡下直接計數(shù)及顯微鏡下直接計數(shù)第25頁/共26頁第二十六頁，共27頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)會計學(xué)。染色前一般要將細胞固定