“生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)”理論知識考查題教學(xué)教材

1、資料收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除1. 酶有什么不同于一般催化劑的特性？在酶的分離純化過程中要注意哪些環(huán)節(jié)？1、高效性2、專一性3、條件溫和4、酶活性的可調(diào)控性5、酶催化的活性與輔酶、輔基和金屬離子有關(guān)6、不穩(wěn)定易失活酶是一種特殊的蛋白質(zhì)，在分離純化過程中需要注意溫度以及PH 值等的控制， 注意在純化過程中所使用的緩沖溶液的離子強(qiáng)度的控制(常用 PBS緩沖溶液 )，在實(shí)際純化過程中，一般要在低溫冰箱中進(jìn)行，緩沖溶液中注意加入EDTA二鈉鹽 (1-5mM) 螯和重金屬離子一般避免酶失活。2. 如何評價(jià)蛋白質(zhì)純化方法的優(yōu)劣？判斷分離提純方法的優(yōu)劣，一般用兩個(gè)指標(biāo)來衡量，一是總活力的回收；而是比

2、活力的提高倍數(shù)。理想的分離提純方法希望比活力和總活力越高越好，但兩者往往不可兼得。因此在考慮分離條件和方法時(shí)，需要在比活力多提高一些和總活力多回收一些作適當(dāng)?shù)倪x擇。3、純化蛋白質(zhì)的層析方法有哪些？凝膠過濾層析；離子交換層析；疏水層析；親和層析；聚焦層析；高效液相層析。4、請回答 Q Sepharose柱-層析法純化蔗糖酶的基本原理是什么？離子交換劑是以纖維索或葡聚糖凝膠等不溶性物質(zhì)為母體，通過酯化、醚化或氧化等化學(xué)反應(yīng)引入陽性或陰性離子基團(tuán)的特殊制劑可與帶相反電荷的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行交換吸附。Q Sepharose 柱代表季氨基瓊脂糖色譜，以瓊脂糖作為不溶性母體引入季銨型基團(tuán)，為強(qiáng)陰離子交換劑。酵母

3、蔗糖酶的等電點(diǎn)為5.0 左右，在 Tris-HCl 緩沖液（ pH 7.3）下帶負(fù)電。在pH7 左右， Q Sepharose 凝膠帶正電，與帶負(fù)電的蔗糖酶結(jié)合。洗脫液中的離子基因與結(jié)合在離子交換劑上的蛋白質(zhì)離子基團(tuán)相競爭時(shí)親合力小的蛋白質(zhì)分子先被解吸而洗脫下來，而親合力大者則后被解吸而后洗脫下來。因此依靠增加緩沖液的離子強(qiáng)度和(或 )改變酸堿度即可改變蛋白質(zhì)的吸附狀態(tài)，使不同親合力的蛋白質(zhì)得以分離。5. 什么是酶活力？根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會(huì)，在進(jìn)行酶活力測定時(shí)要注意哪些問題？什么是酶活力 :酶活力也稱為酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的活力。測定酶活力實(shí)際就是測定酶促反應(yīng)的速度，一般采用測定酶促反應(yīng)初速

4、度的方法來測定酶活力。酶促反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。word 可編輯資料收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除酶活力測定的注意事項(xiàng):（ 1）量取時(shí)要用專門的移液管，每次加入新的試劑立即混勻。將各試管內(nèi)液體混合均勻。震蕩混勻。移液管使用方法，按減少量加入準(zhǔn)確。（2）測吸光值要求：測定數(shù)據(jù)在（0.1-0.7A ），波動(dòng)可以到0.2-0.8 ，最小不能小于0.1 ，最大不能超過1.0。要求 R2 值接近 1，至少 0.999。（3）稀釋樣品要從低到高的順序，即CBA，因?yàn)槿萘科坑玫耐粋€(gè)，防止污染使?jié)舛扔懈淖?。?）

5、做酶水解蔗糖反應(yīng)：稀釋酶液和蔗糖反應(yīng)前要在35 度水浴鍋預(yù)熱，每個(gè)試管準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，每個(gè)單獨(dú)反應(yīng)單獨(dú)結(jié)束。加入0.05 毫升， 2mol/L NaOH/ml，立即搖勻！（ 5）測反應(yīng)液吸光度：從各水解反應(yīng)液中取出適合量的體積（V 測）。用移液管量取每種反應(yīng)液應(yīng)先取對照后取反應(yīng)液。如果測得的OD 值結(jié)果不在標(biāo)準(zhǔn)曲線還原糖范圍內(nèi)，則可增加或減少取樣量，加倍或減半，直到OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)為止。P.S 酶活力測定的注意事項(xiàng)給的答案跟老師PPT上的答案不一樣，然后我選擇了老師PPT上的答案。6. 請回答酶活力、酶活力單位、酶的比活力的含義？酶活力也稱為酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的活力。測定酶活力實(shí)際

6、就是測定酶促反應(yīng)的速度，一般采用測定酶促反應(yīng)初速度的方法來測定酶活力。酶促反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。酶活力單位是酶活力的度量單位。酶活力單位可以自己定義，1 個(gè)酶活力單位是指在特定條件（25或其它最適條件）下，在單位時(shí)間內(nèi)能將一定量底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所用的酶量。國際酶學(xué)委員會(huì)于1961 年規(guī)定, 在確定的最適反應(yīng)條件下, 每分鐘催化1mol 底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物所需的酶量為一個(gè)酶活力單位, 單位符號為IU 或U。比活力 ( 性) 是酶純度的量度, 比活力指的是每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg

7、蛋白質(zhì)表示。酶的比活力在酶學(xué)研究中用來衡量酶的純度，對于同一種酶來說，比活力越大，酶的純度越高。利用比活力的大小可以用來比較酶制劑中單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力，是表示酶的純度高低的一個(gè)重要指標(biāo)。7、 Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)濃度的基本原理是什么，此法有什么優(yōu)缺點(diǎn)？此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下， 藍(lán)色

8、深度與蛋白的量成正比，這一藍(lán)色溶液在750nm和 660nm 有較強(qiáng)的光吸收能力，固可用來測未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。word 可編輯資料收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多；缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)較長，要嚴(yán)格控制操作時(shí)間，蛋白質(zhì)濃度和光吸收值線性關(guān)系不夠嚴(yán)格，且專一性較差， 干擾物質(zhì)較多。 凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)，如 -CO-NH2, -CH2-NH2,CS-NH2以及 Tris 緩沖液、蔗糖、硫酸銨、巰基化合物均可干擾 Folin酚反應(yīng)，而且對后者的影響還要大得多。此外，酚類、檸檬酸對此反應(yīng)也有干擾作用。8、微量凱氏定氮法的基本原理是什么？操作時(shí)應(yīng)注意哪些環(huán)節(jié)？原理：蛋白質(zhì)

9、與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量，即可計(jì)算出樣品的含氮量，根據(jù)換算系數(shù)，即可計(jì)算出蛋白質(zhì)的量。含氮量*6.25= 蛋白含量。本法適于測定0.2 2.0mg 的氮（老師PPT上 0.1-2.0mg ）。操作時(shí)注意消化完全徹底（溶液澄清淺綠色），蒸餾的時(shí)候密封好減少氨的揮發(fā)這一部分損失，氨被硼酸全部吸收，滴定要準(zhǔn)確。9、 SDSPAGE測定蛋白質(zhì)的相對分子量是根據(jù)什么原理？SDS 是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級

10、結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和 SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和 SDS結(jié)合成蛋白 -SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。此鑒定方法中，蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子形狀無關(guān)。當(dāng)分子量在15KD 到 200KD 之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中： MW 為分子量， X 為遷移率， k、b 均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未

11、知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。10、常用沉淀蛋白質(zhì)的方法有哪些？能否用其它沉淀法分離蔗糖酶？至少說出3 種方法。中性鹽沉淀（鹽析法）、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)聚合物沉淀、重金屬離子沉淀11.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)銓W(xué)了多少種蛋白質(zhì)含量測定方法？試比較優(yōu)缺點(diǎn)。1、凱氏定氮:將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨， 用酸吸收后滴定。 干擾少，用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測定。靈敏度低，適用于 0.1-1.0mg 氮，費(fèi)時(shí)3-4 小時(shí)。2、雙縮脲法（ Biuret 法):肽鍵堿性Cu2紫色絡(luò)合物。靈敏度低20 mg ，中速2030 分鐘，干擾物

12、多（硫酸銨，Tris 緩沖液）。用于快速測定 ,但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似。word 可編輯資料收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除3、紫外吸收法:蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm 處有較大吸光值。較為靈敏50100 mg， 快速10 分鐘，各種嘌吟和嘧啶干擾結(jié)果，用于層析柱流出液的測定。4、 Folin酚試劑法（ Lowry 法） :磷鉬酸磷鎢酸試劑被Tyr 和 Phe 還原。靈敏度高5 mg ，較耗時(shí)， 40 60 分鐘，干擾物多，操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)，試劑配置較困難。5、考馬斯亮藍(lán)法(Bradford 法) :考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí),其最大吸收光波長由465nm 變?yōu)?595n

13、m。靈敏度最高5mg ，快速 515分鐘，干擾物質(zhì)少（去垢劑）；顏色穩(wěn)定。12.考題：微量凱氏定氮實(shí)驗(yàn)中消化時(shí)所加的K2SO4、CuSO4各起什么作用？常量凱氏定氮與微量凱氏定氮在操作上有何不同？CuSO4的作用：催化劑K2SO4的作用：提高沸點(diǎn)，沸點(diǎn)由330 提高到 400加速了反應(yīng)過程。不同：常量由于可以把全部消化液一同蒸餾測定，故較適合蛋白質(zhì)含量低的樣品。微量差別在裝置上，二者皆屬于水蒸汽蒸餾操作，只是前者把蒸汽直接導(dǎo)入反應(yīng)室內(nèi)，后者把蒸汽導(dǎo)入反應(yīng)室外加熱，由于二者皆取消化液的一部份操作，可平行蒸餾操作，但檢測限要較常量法高?？碱}：酶活力是怎么定義的？酶活測定中需要注意哪些？13，酶活力

14、是怎么定義的？酶活測定中需要注意哪些？答：也稱酶活性，是酶催化反應(yīng)的能力。酶活力單位是一定條件下，一定時(shí)間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量。注意事項(xiàng)：（ 1）儀器不清潔，含有其他物質(zhì)，比如雜蛋白，抑制劑，及針對本次實(shí)驗(yàn)的其他還原性物質(zhì)等 （2）底物受空氣影響自然分解（3）絕大多數(shù)酶會(huì)因久置而活力降低存于4冰箱中。（ 4）酶促反應(yīng)過程中， 只有最初一段時(shí)間內(nèi)反應(yīng)速度與酶濃度成正比，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，反應(yīng)速度即逐漸降低（5）pH 值和溫度（ 6）測定時(shí)的底物（7）反應(yīng)的時(shí)間8）其他因素14，建立離子交換法純化蛋白質(zhì)的方法需要摸索哪些條件？答：（ 1）p H 值，緩沖液的 pH 值對于蛋白結(jié)

15、合離子交換層析有非常大的影響，需要先摸索出合適的pH 值，既能保證蛋白結(jié)合上離子交換層析，又不會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定沉淀的情況。（ 2）鹽濃度，鹽濃度是離子交換層析洗脫的關(guān)鍵，需要摸索出蛋白能在什么樣的鹽濃度下被洗脫，且洗脫后純度能夠達(dá)到最初的要求。word 可編輯資料收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除（ 3）柱體積，盡管各種離子交換層析均有理論結(jié)合蛋白量，但各種蛋白情況不一樣，需要摸索出能夠完全結(jié)合目的蛋白合適的柱體積。既不會(huì)太大造成洗脫濃度過稀，也不會(huì)太小造成目標(biāo)蛋白過載。（ 4）溫度，溫度可能會(huì)造成蛋白變性等等。15、 Q Sepharose的母體是什么？其所帶的活性基團(tuán)又是什么？本實(shí)驗(yàn)為何采用該

16、離子交換劑？Q Sepharose 是以瓊脂糖作為不溶性母體引入季銨型基團(tuán)，為強(qiáng)陰離子交換劑，具有硬度大，性質(zhì)穩(wěn)定，凝膠后的流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。(1)提高實(shí)驗(yàn)效果。瓊脂糖凝膠離子交換介質(zhì)載量高，分離純化蔗糖酶穿透峰小，分辨率高,回收率高。蔗糖酶與雜蛋白得到了很好的分離,提高純度 , 真正體現(xiàn)離子交換色譜蛋白質(zhì)純化上的優(yōu)越性,增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的意義。(2)縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。減少不必要的實(shí)驗(yàn)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)過程比較緊湊。(3)節(jié)約實(shí)驗(yàn)支出。瓊脂糖介質(zhì)在分辨率、回收率、流速等具有優(yōu)越性。且其化學(xué)穩(wěn)定性極高，不易破碎，可以承受 1MNaOH 的清洗，重生效果好 ,可以使用數(shù)百至上千次，因而降低了成本。16、胞內(nèi)酶

17、提取過程中需要破壁，常用破壁方法有哪些？機(jī)械方法：液氮研磨法、高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲波破碎法非機(jī)械法：甲苯自溶法、化學(xué)滲透法、酶溶法、SDS抽提法、反復(fù)凍融法、低滲溶液法17、微量凱氏定氮實(shí)驗(yàn)中消化的作用是什么？SDS化學(xué)名是什么？作用：樣品與濃硫酸共熱,含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化）SDS：十二烷基磺酸鈉18、 SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)的相對分子量實(shí)驗(yàn)中SDS起什么作用？SDS 是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和 SDS

18、后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和 SDS結(jié)合成蛋白 -SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。19.簡述濃縮膠的濃縮效應(yīng)。學(xué)長給的答案（感覺不是很好）上樣孔里加樣的時(shí)候，樣品是有一定的高度的，樣品里的蛋白沒有站在一條起跑線上。濃縮膠的作用就是壓縮樣品中的蛋白質(zhì)成為一條細(xì)線站在同一條起跑線上，這樣影響蛋白遷移速率的因素就只有分子量的大小了，也就更有可比性了。 DNA 電泳的驅(qū)動(dòng)力靠 DNA 骨架本身的負(fù)電荷，蛋白質(zhì)電泳的驅(qū)動(dòng)力靠與蛋白質(zhì)結(jié)合的 SDS上所攜帶的負(fù)電荷。 SDS將蛋白質(zhì)變性成直線分子并緊密包裹于其上，使得其所攜帶的

19、電荷與蛋白分子量成了一定的比例，所以當(dāng)樣品跑出濃縮膠后，剩下的就和核酸電泳一樣了。word 可編輯資料收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除生物化學(xué)上指在進(jìn)行SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳）中由于凝膠孔徑的不連續(xù)性（2 種孔徑）、緩沖液離子成分的不連續(xù)性(2 種緩沖體系 )、 PH 值（ 3 種 PH）和電位梯度的不連續(xù)性使得蛋白質(zhì)分子在濃縮膠和分離膠的界面處濃縮成一條狹小的縫帶，成為濃縮效應(yīng)。自己查的凝膠由兩種不同的凝膠層組成，上層為濃縮膠，下層為分離膠。濃縮膠為大孔膠，緩沖液pH67，分離膠為小孔膠， 緩沖液 pH8.9 ，這樣便形成凝膠孔徑和緩沖液ph 值的不連續(xù)性。 濃縮膠中

20、 HCl 全部解離為Cl-，稱為快離子， 極少部分甘氨酸 （等電點(diǎn)pI6.0）解離為 Gly-，稱為慢離子。 有效泳動(dòng)率依次為Cl->蛋白質(zhì) >Gly-。電泳開始后，快離子泳動(dòng)到最前面，快慢離子之間形成一個(gè)離子濃度低的區(qū)域，即低電導(dǎo)區(qū)域，而電導(dǎo)與電壓梯度成反比，因此低電導(dǎo)區(qū)有較高的電壓梯度，驅(qū)使慢離子加速泳動(dòng)。當(dāng)快慢離子移動(dòng)速率相等時(shí)，就建立一個(gè)不斷向陽極移動(dòng)的界面，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速度恰好介于快慢離子之間，因而被擠壓在快慢離子之間形成一條窄帶。這種濃縮作用可使蛋白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。另一方面，濃縮膠為大孔徑凝膠，分離膠為小孔徑凝膠，待分離蛋白質(zhì)在大孔凝膠中受到阻力小，移動(dòng)速度快，泳動(dòng)到小孔

21、凝膠處時(shí)，阻力突然加大，速度變慢，這樣就在兩種凝膠的交界處使待分離樣品的區(qū)帶變窄，濃度升高。20.簡述 SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的基本原理。SDS 是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和 SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和 SDS結(jié)合成蛋白 -SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。此鑒定方法中，蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子

22、形狀無關(guān)。當(dāng)分子量在15KD 到 200KD 之間時(shí)， 蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式： logMW=K-bX，式中： MW 為分子量， X 為遷移率， k、b 均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。21、乙醇沉淀提取酶需要注意哪些事項(xiàng)？（ 1）必須緩慢加入（ 2）邊加邊攪拌（ 3）避免產(chǎn)生泡沫，使蛋白質(zhì)的溶解度呈一個(gè)光滑的曲線（ 4）提取液和乙醇在混合時(shí)要采取冰浴，混合過程不少于35min 。22、影響酶活力的因素有哪些？pH、溫度、紫外線、重金屬鹽、抑

23、制劑、激活劑等word 可編輯資料收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除23.柱平衡指的是什么，目的又是什么柱平衡指在柱的使用前用PH 與樣品相同的緩沖液對柱子進(jìn)行沖洗。目的是使柱子上的基團(tuán)都帶有離子交換劑中的陽離子，并在柱內(nèi)營造一個(gè)相同的外在環(huán)境，減少樣品本身特性因素外其他因素的影響： PH、溫度等24.凝膠過濾和SDS-PAGE均具有分子篩的作用，說明它們有何不同？為什么？過濾層析：當(dāng)被分離物質(zhì)的各成分通過凝膠時(shí)，小于篩眼的分子將完全滲入凝膠網(wǎng)眼，并隨著流動(dòng)相的移動(dòng)沿凝膠網(wǎng)眼孔道移動(dòng)，從一個(gè)顆粒的網(wǎng)眼流出，又進(jìn)入另一顆粒的網(wǎng)眼，如此連續(xù)下去，直到流過整個(gè)凝膠柱為止，因而流程長、阻力大、流速慢；

24、大于篩眼的分子則完全被篩眼排阻而不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)眼，只能隨流動(dòng)相沿凝膠顆粒的間隙流動(dòng)，其流程短、阻力小、流速快，先于小分子流出層析柱；分子大小介于兩者之間的則居中流出。這樣被分離物質(zhì)即被按分子的大小分開。SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白 - SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。分子量大的蛋白質(zhì)跑得慢，分子量小的蛋白質(zhì)的條帶在前面。25.柱層析實(shí)驗(yàn)中洗穿透峰的目的是什么？穿

25、透峰中含有哪些物質(zhì)？用來洗掉緩沖液中未與交換劑結(jié)合的蛋白質(zhì)，使復(fù)雜的組份分離完全。穿透峰中包括大量未結(jié)合的游離蛋白如陽離子的雜蛋白、不帶電荷的雜蛋白、帶陰離子的雜蛋白。26、什么叫對照實(shí)驗(yàn)？如何做對照實(shí)驗(yàn)？對照組是在需要進(jìn)行對比的科學(xué)實(shí)驗(yàn)中，起輔助、對比作用，以突出并有力支持從實(shí)驗(yàn)組所能得出結(jié)論的單組或多組實(shí)驗(yàn)。在比較性實(shí)驗(yàn)研究中，將實(shí)驗(yàn)對象分為二個(gè)或數(shù)個(gè)獨(dú)立的組，其中一組施加實(shí)驗(yàn)因素，而另一組不施加或施加其他因素。前者稱為實(shí)驗(yàn)組，后者即為對照組。對照又分為空白對照、自身對照、條件對照、相互對照等類型。對照組要盡可能消除無關(guān)變量。如何做：設(shè)置對照組有4 種方法： (1)空白對照 (2)條件對照

26、 (3)自身對照 (4)相互對照所有用生物材料要相同。即所用生物材料的數(shù)量、質(zhì)量、長度、體積、來源和生理狀況等方面特點(diǎn)要盡量相同或至少大致相同。所用實(shí)驗(yàn)器具要相同。即試管、燒杯、水槽、廣口瓶等器具的大小型號要完全一樣。所用實(shí)驗(yàn)試劑要相同。即試劑的成分、濃度、體積要相同。尤其要注意體積上等量的問題。所用處理方法要相同。如：保溫或冷卻：光照或黑暗；攪拌或振蕩都要一致。有時(shí)盡管某種處理對對照實(shí)驗(yàn)來說，看起來似乎是毫無意義的，但最好還是要作同樣的處理。27、用離子交換層析分離蛋白質(zhì)，流動(dòng)相的pH 如何選擇？對于陽離子交換劑一般是pH 值從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是pH 值從高到低。如蔗糖酶的等wo

27、rd 可編輯資料收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除電點(diǎn)為 5.0，在 pH 為 7 時(shí)呈負(fù)電與結(jié)合劑結(jié)合。洗脫液pH 大于 5.0，初始由pH7.3 逐漸降低pH，使蔗糖酶帶的陰離子逐漸減小，結(jié)合力減弱，即可將結(jié)合的蔗糖酶被洗脫下來28、離心機(jī)使用需要注意哪些？1、離心機(jī)要放在平坦和結(jié)實(shí)的地面或?qū)嶒?yàn)臺上，不允許傾斜；2、通常離心機(jī)都會(huì)有登記表，請?jiān)谑褂们按_實(shí)登記使用者、轉(zhuǎn)頭、轉(zhuǎn)速、時(shí)間；3、離心管一定要用天平平衡重量（重量平衡），蓋上離心管蓋子并旋緊；4、把平衡好的離心管對稱地放入離心陀中（位置平衡），蓋上離心陀的蓋子，注意有無旋緊；5、完成離心時(shí)，要等待離心機(jī)自動(dòng)停止，不允許用手或其他物件迫

28、使離心機(jī)停轉(zhuǎn)，待轉(zhuǎn)頭完全靜止后，才能打開艙門，請盡快取出離心管，先觀察離心管是否完全，以及沉淀的位置，盡速把上清倒出，小心不要把沉淀弄混濁。29.什么叫梯度洗脫？為什么要梯度洗脫？梯度洗脫又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個(gè)分析周期中，按一定程度不斷改變流動(dòng)相的濃度配比，稱為梯度洗脫。從而可以使一個(gè)復(fù)雜樣品中的性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k 達(dá)到良好的分離目的。當(dāng)被吸附的蛋白質(zhì)的Kd 值有差異時(shí)，降低pH 值或提高離子強(qiáng)度均可使之洗脫下來，用含陰離子（如Cl-)的溶液洗柱，含電荷少的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來，增加Cl-濃度，含電荷多的蛋白質(zhì)也被洗脫下來，于是兩種蛋白質(zhì)被分開。梯度洗脫的優(yōu)

29、點(diǎn)： 1.縮短分析周期； 2.提高分離能力； 3.峰型得到改善，很少拖尾； 4.增加靈敏度。但有時(shí)引起基線漂移。30.酶活測定中需要控制反應(yīng)時(shí)間，常用的有哪幾種終止酶反應(yīng)的方法？（ 1）溫度調(diào)節(jié)：酶促反應(yīng)一般都在一定的溫度范圍內(nèi)有效，可以突然降低溫度或者升高溫度，使酶失去活性。（ 2）pH 調(diào)節(jié)：酶在一定的 pH 內(nèi)具有活性，超出一定范圍后降低或失去活性。（ 3）加酶的抑制劑 (如底物類似物，某些金屬離子等 )，使得酶失去活力。（ 4）大部分酶是蛋白質(zhì)，可 3 加入有機(jī)溶劑使其變性。31、使用分光光度計(jì)的比色皿有哪幾種？各在什么場合使用？按使用的波長范圍可分為三大系列，即可見光系列（稱玻璃比色

30、皿），紫外可見光系列（稱石英比色皿），紅外光系列（稱紅外比色皿）測試在紫外區(qū)有吸收的樣品時(shí)用石英比色皿，測試只在可見光區(qū)有吸收的樣品時(shí)使用玻璃比色皿，測試在word 可編輯資料收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除紅外區(qū)有吸收的樣品時(shí)用紅外比色皿32、為什么要做對照實(shí)驗(yàn)？凱氏定氮實(shí)驗(yàn)中用到的硫酸銅、硫酸鉀各起什么作用？設(shè)置對照組的目的在于消除無關(guān)變量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。檢驗(yàn)對比試驗(yàn)的效果。實(shí)驗(yàn)組和對照組之間僅有一個(gè)變量變化，結(jié)果不一樣的地方一般認(rèn)為就是由那個(gè)變量引起的。沒有對照組，實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將會(huì)無法確定。33、酶反應(yīng)需要控制哪些實(shí)驗(yàn)條件？如何控制？溫度：對酶的作用具有雙重

31、影響，在較低的溫度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨溫度升高而增大，但是超過一定溫度后，反應(yīng)速度反而下降。酶促反應(yīng)的溫度要盡量控制在恒定的最適溫度下進(jìn)行，溫度波動(dòng)要控制在±1。該實(shí)驗(yàn)要將反應(yīng)溫度控制在 35進(jìn)行?？刂茰囟群愣ǖ姆椒ㄗ畛Ｒ姷木褪撬〖訜岜?，將兩種或多種反應(yīng)體系中的反應(yīng)液分別在相同溫度的水浴中進(jìn)行預(yù)加熱，然后在該溫度下混合反應(yīng)，準(zhǔn)確測定反應(yīng)時(shí)間后取出，測定酶活。pH：在最適pH 時(shí)，酶的活性最強(qiáng)，高于或低于最適pH，酶的活性都降低。該反應(yīng)應(yīng)控制pH 為 4.6左右?？刂品磻?yīng)的pH 可以通過加入一定量的緩沖液（例如PBS緩沖液、磷酸鹽緩沖液、醋酸- 醋酸鹽緩沖液）緩沖液要有足夠的緩沖容量，緩沖液的pKa 與最適pH 越接近，緩沖容量越大。有酸堿的產(chǎn)生或消耗的酶促反應(yīng)，對緩沖容量的要求更高。通過pH 計(jì)在顯示器上實(shí)時(shí)反映體系中的pH 值，用滴管滴加少量 HCl 或 NaOH 使反應(yīng)體系的pH 達(dá)到最適 pH。 直接用緩沖液反應(yīng)時(shí)間：酶活力測定時(shí)要控制好反應(yīng)時(shí)間，并且各管的酶反應(yīng)時(shí)間一定要一致。該反應(yīng)規(guī)定蔗糖酶的活力單位是在 3min 內(nèi)轉(zhuǎn)化底物的酶量，所以應(yīng)控制反應(yīng)時(shí)間為準(zhǔn)確的 3min 。將反應(yīng)體系各溶液配制好或準(zhǔn)備好后，分別在水浴中預(yù)熱到最適溫度，將最后一種反應(yīng)物添加進(jìn)去立刻搖勻后立刻用秒表等計(jì)時(shí)工具進(jìn)行精確的計(jì)時(shí)