分子熒光光譜法(去磷光)

1、1第二章第二章 分子熒光光譜法分子熒光光譜法Molecular Fluorescence Spectrometry2 分子熒光光譜是一種分子熒光光譜是一種發(fā)射光譜發(fā)射光譜分析方法。分析方法。分子熒光光譜法分子熒光光譜法 分子吸收能量后，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)分子吸收能量后，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)通常是不穩(wěn)定的，會釋放能量而產生躍遷回到基態(tài)，通常是不穩(wěn)定的，會釋放能量而產生躍遷回到基態(tài)，如果是以光輻射的形式釋放能量，就稱為如果是以光輻射的形式釋放能量，就稱為發(fā)光發(fā)光。相。相應的光譜分析法就稱為分子發(fā)射光譜法。應的光譜分析法就稱為分子發(fā)射光譜法。分子熒光是一種分子熒光是一種光致發(fā)光光致發(fā)光

2、過程。過程。日本富山海邊的熒光烏賊用產生不同顏色熒光蛋白的細菌創(chuàng)作的圖畫 熒光棒4分子熒光光譜法分子熒光光譜法2.1 分子熒光的產生過程分子熒光的產生過程2.2 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜2.3 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素2.4 分子熒光光譜儀分子熒光光譜儀2.5 分子熒光光譜法的應用分子熒光光譜法的應用5 由由分子結構分子結構理論，主要討論熒光的產生機理。理論，主要討論熒光的產生機理。1. 1. 分子能級與躍遷分子能級與躍遷 分子能級的每個電子能級上，都存在振動、轉動能分子能級的每個電子能級上，都存在振動、轉動能級；級； 2.1 分子熒光的產生過程分子熒光的產

3、生過程基態(tài)基態(tài)激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)：吸收特定頻率的輻射；量子化；吸收特定頻率的輻射；量子化； 躍遷一次到位；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)：基態(tài)：多種途徑和方式多種途徑和方式( (見能級圖見能級圖) )；速度最快、；速度最快、 激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；62.2.電子激發(fā)態(tài)的多重度電子激發(fā)態(tài)的多重度2.1 分子熒光的產生過程分子熒光的產生過程單重態(tài)：與基態(tài)中的電子自旋方向單重態(tài)：與基態(tài)中的電子自旋方向相反，相反，壽命較短壽命較短. .三重態(tài)：與基態(tài)中的電子自旋方向三重態(tài)：與基態(tài)中的電子自旋方向相同相同，壽命較長，壽命較長7 基態(tài)基態(tài)S S0 0 第一、第二、第一、第二、電

4、子激發(fā)電子激發(fā)單重態(tài)單重態(tài) S S1 1 、S S2 2 ； 第一、第二、第一、第二、電子激發(fā)電子激發(fā)三重態(tài)三重態(tài) T T1 1 、T T2 2 ；2.1 分子熒光的產生過程分子熒光的產生過程8 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過通過輻射躍遷輻射躍遷( (發(fā)光發(fā)光) )和和無輻射躍遷無輻射躍遷等方式等方式失去能量失去能量的過程的過程；傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷輻射躍遷熒光熒光延遲熒光延遲熒光磷光磷光內轉移內轉移外轉移外轉移系間跨越系間跨越振動弛預振動弛預無輻射躍遷無輻射躍遷2.1 分子熒光的產生過程分子熒光的產生過程2. 2. 分子的去激發(fā)過程分

5、子的去激發(fā)過程9S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內轉換振動弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉換l l 2T2內轉換振動弛豫2.1 分子熒光的產生過程分子熒光的產生過程103. 3. 分子的去激發(fā)形式分子的去激發(fā)形式2.1 分子熒光的產生過程分子熒光的產生過程振動馳豫振動馳豫 同一電子能級內同一電子能級內以以熱能量交換熱能量交換形式由形式由高振動能級高振動能級至至相鄰低振動能級相鄰低振動能級間的間的躍遷。躍遷。 發(fā)生振動弛豫的時間發(fā)生振動弛豫的時間1010- -1212 S S 。 見見JablonskiJablonski能級圖能級圖113. 3. 分子

6、的去激發(fā)過程分子的去激發(fā)過程2.1 分子熒光的產生過程分子熒光的產生過程內轉換內轉換 同多重度電子能級中同多重度電子能級中（如（如S S2 2S S1 1，T T2 2T T1 1）, ,等能級間的無輻射能級交換。等能級間的無輻射能級交換。 見見Jablonski能級圖能級圖內轉換發(fā)生的時間約在內轉換發(fā)生的時間約在1010- -1212 S S。 通過內轉換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)通過內轉換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)第一激發(fā)單重態(tài)的的最低振動能級最低振動能級。123. 3. 分子的去激發(fā)過程分子的去激發(fā)過程2.1 分子熒光的產生過程分子熒光的產生過程v外轉換外轉

7、換 激發(fā)態(tài)分子與激發(fā)態(tài)分子與溶劑溶劑和和其他溶質分子其他溶質分子間間的的相互作用及能量轉移相互作用及能量轉移的的非輻射躍遷非輻射躍遷。v外轉換使發(fā)光強度減弱或消失，這種現(xiàn)象稱為外轉換使發(fā)光強度減弱或消失，這種現(xiàn)象稱為“猝滅猝滅”或或“熄滅熄滅”。 見見JablonskiJablonski能級圖能級圖133. 3. 分子的去激發(fā)過程分子的去激發(fā)過程系間跨躍系間跨躍 不同多重態(tài)之間不同多重態(tài)之間如（如（S S1 1T T1 1）的一種無輻射的一種無輻射躍遷。躍遷。見見JablonskiJablonski能級圖能級圖該過程是激發(fā)態(tài)電子改變其自旋態(tài)，分子的多重性發(fā)生該過程是激發(fā)態(tài)電子改變其自旋態(tài)，分子

8、的多重性發(fā)生變化的結果。即變化的結果。即單重態(tài)單重態(tài)到到三重態(tài)三重態(tài)的躍遷。的躍遷。當兩種能態(tài)的振動能級重迭時，這種躍遷的幾率增大。當兩種能態(tài)的振動能級重迭時，這種躍遷的幾率增大。 即即較低單重態(tài)振動能級較低單重態(tài)振動能級與與較高的三重態(tài)振動能級重疊較高的三重態(tài)振動能級重疊。這種躍遷是這種躍遷是“禁阻禁阻”的。的。 2.1 分子熒光的產生過程分子熒光的產生過程143. 3. 分子的去激發(fā)過程分子的去激發(fā)過程熒光發(fā)射熒光發(fā)射 激發(fā)態(tài)分子由激發(fā)態(tài)分子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級級S S1 1回到回到基態(tài)基態(tài)S S0 0伴隨的光輻射稱為伴隨的光輻射稱為熒光熒光。熒光發(fā)射是

9、熒光發(fā)射是相同多重態(tài)相同多重態(tài)間的躍遷，間的躍遷，幾率較大，速度很快，幾率較大，速度很快， 10-710 -9 s,見見Jablonski能級圖能級圖2.1 分子熒光的產生過程分子熒光的產生過程153. 3. 分子的去激發(fā)過程分子的去激發(fā)過程磷光發(fā)射磷光發(fā)射 激發(fā)態(tài)分子激發(fā)態(tài)分子從從第一激發(fā)三第一激發(fā)三重重態(tài)（態(tài)（T T1 1）的最低振）的最低振動能級動能級上返回上返回基態(tài)基態(tài)S S0 0伴隨的光輻射伴隨的光輻射稱為稱為磷光發(fā)射。磷光發(fā)射。磷光發(fā)射是磷光發(fā)射是不同多不同多重重態(tài)態(tài)之間的躍遷（即之間的躍遷（即T T1 1SS0 0）。故屬于）。故屬于“禁阻禁阻”躍遷，因此磷光的躍遷，因此磷光的輻

10、射速度遠遠小于輻射速度遠遠小于熒光熒光，約為約為1010-4-4到到1010- -5 5 s s。所以，將激發(fā)光從磷光樣品移走后，還?？捎^察到后發(fā)光所以，將激發(fā)光從磷光樣品移走后，還常可觀察到后發(fā)光現(xiàn)象。而熒光發(fā)射卻觀察不到該現(xiàn)象。現(xiàn)象。而熒光發(fā)射卻觀察不到該現(xiàn)象。 見見JablonskiJablonski能級圖能級圖2.1 分子熒光的產生過程分子熒光的產生過程16熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜，簡稱激發(fā)光譜，簡稱激發(fā)光譜，測量化合物發(fā)射測量化合物發(fā)射的的某一固定波長的某一固定波長的熒光的強度熒光的強度（選最大發(fā)射波（選最大發(fā)射波長）與長）與激發(fā)光波長激發(fā)光波長的關系曲線；的關系曲線；1. 1. 熒

11、光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜曲線熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜曲線 激發(fā)光譜反映了激發(fā)光譜反映了在某一在某一固定的發(fā)射波長固定的發(fā)射波長下，下，不同激發(fā)波長不同激發(fā)波長激發(fā)的熒光的相對效率。激發(fā)的熒光的相對效率。2.2 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜17200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IFl l 2.2 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜18B.B.熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜，又稱熒光光譜，又稱熒光光

12、譜, ,固定激發(fā)固定激發(fā)光波長光波長( (選最大激發(fā)波長選最大激發(fā)波長), ), 化合物發(fā)射的化合物發(fā)射的熒熒光光與與發(fā)射光波長發(fā)射光波長關系曲線。關系曲線。2.2 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜發(fā)射光譜發(fā)射光譜反映了反映了在相同的激發(fā)條件下，在相同的激發(fā)條件下，不同不同波長處波長處分子分子熒光熒光的相對的相對發(fā)射強度發(fā)射強度。19200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IFl l2.2 熒光的激發(fā)光譜和

13、發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 20212.2 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 在溶液中，熒光光譜顯示了某些普遍的特征。為我在溶液中，熒光光譜顯示了某些普遍的特征。為我們識別熒光物質的正常熒光提供了基本原則。們識別熒光物質的正常熒光提供了基本原則。3. 3. 熒光光譜的特征熒光光譜的特征(1). (1). StokesStokes位移位移 在溶液中，分子的在溶液中，分子的熒光發(fā)射波長熒光發(fā)射波長總是比總是比其相應的激發(fā)波長其相應的激發(fā)波長長長。這種波長位移現(xiàn)象是這種波長位移現(xiàn)象是18521852年年StokesStokes首次觀察到的。首次觀察到的。222.2 熒光的激發(fā)光

14、譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 熒光熒光總是從總是從最低激發(fā)單重態(tài)最低激發(fā)單重態(tài)回到回到基態(tài)基態(tài)時所發(fā)射的時所發(fā)射的輻射，而輻射，而激發(fā)過程激發(fā)過程有可能將分子有可能將分子激發(fā)到高的振動能級激發(fā)到高的振動能級或或更高的電子能級更高的電子能級上去。上去。 振動、熱輻射等使分子失去能量。即激發(fā)與發(fā)射熒振動、熱輻射等使分子失去能量。即激發(fā)與發(fā)射熒光間的光間的能量損失能量損失是斯托克斯位移產生的主要原因。是斯托克斯位移產生的主要原因。 其他如溶劑效應、激發(fā)態(tài)分子的反應也會引起斯托其他如溶劑效應、激發(fā)態(tài)分子的反應也會引起斯托克斯位移?？怂刮灰?。 232.2 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和

15、發(fā)射光譜(2).(2).鏡像對稱規(guī)則鏡像對稱規(guī)則 分子的分子的熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜與其與其激激發(fā)光譜發(fā)光譜之間存在著之間存在著鏡像關系鏡像關系。20025030035040045050055060065070075080085090004008001200160020002400280032003600400044004800 IFl l242.2 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 鏡像對稱規(guī)則的產生，是鏡像對稱規(guī)則的產生，是由于由于: : 大多大多激發(fā)激發(fā)光譜光譜的形狀表明的形狀表明了了分子的第一激發(fā)態(tài)分子的第一激發(fā)態(tài)的的振動能振動能級結構級結構， 而而熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)

16、射光譜則表明了則表明了分子基態(tài)分子基態(tài)的的振動能級結構振動能級結構。 25 一般情況下，一般情況下，分子的分子的基態(tài)基態(tài)和和第一激發(fā)單第一激發(fā)單線線態(tài)態(tài)的的振動能級結構振動能級結構類似類似，因此，因此激發(fā)激發(fā)光譜的形狀與熒光發(fā)光譜的形狀與熒光發(fā)射光譜的形狀呈射光譜的形狀呈鏡像對稱鏡像對稱關系關系。2.2 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜262.2 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜3. 3. 熒光光譜的特征熒光光譜的特征 (3). (3). 發(fā)射光譜不變形發(fā)射光譜不變形 或者說或者說熒光發(fā)射光譜的形熒光發(fā)射光譜的形狀狀與與激發(fā)波長激發(fā)波長無關。無關。 一般地，用一

17、般地，用不同激發(fā)波長不同激發(fā)波長激發(fā)熒光分子，可以觀察激發(fā)熒光分子，可以觀察到到形狀相同的形狀相同的熒光發(fā)射光譜。熒光發(fā)射光譜。 這是由于熒光分子無論被激發(fā)到哪一個激發(fā)態(tài)，處這是由于熒光分子無論被激發(fā)到哪一個激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子經振動弛豫及內轉換等過程后，最終回于激發(fā)態(tài)的分子經振動弛豫及內轉換等過程后，最終回到到第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級。 27 分子的熒光發(fā)射總是從分子的熒光發(fā)射總是從第一激發(fā)態(tài)的最低振動能第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級級躍遷到躍遷到基態(tài)的各振動能基態(tài)的各振動能級上級上（S1S0）。 所以熒光光譜的形所以熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關。狀與激發(fā)波長無關。2.

18、2 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜28292.3 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素分子產生熒光必須具備兩個條件：分子產生熒光必須具備兩個條件： 分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應的結分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應的結構，才能吸收激發(fā)光；構，才能吸收激發(fā)光； 吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的須具有一定的熒光量子產率熒光量子產率。302.3.1 熒光量子產率熒光量子產率熒光量子產率：熒光量子產率： 也稱為也稱為熒光效率或熒光效率或量子效率，量子效率，表示物質發(fā)射熒光的能表示物質發(fā)射熒光的能力力。 可以定義為物

19、質吸光后可以定義為物質吸光后發(fā)射的熒光的光子數發(fā)射的熒光的光子數與與吸收吸收的激發(fā)光的光子數的激發(fā)光的光子數之比值。之比值。）吸收的光強（）熒光強度（吸收的光子數發(fā)射的光子數affII31 返回基態(tài)返回基態(tài)速率速率強熒光物質強熒光物質： 熒光發(fā)射熒光發(fā)射 無輻射躍遷無輻射躍遷 大大 低熒光物質低熒光物質： 無輻射躍遷無輻射躍遷 發(fā)射熒光發(fā)射熒光 小小 因此，因此，熒光量子效率熒光量子效率與與熒光發(fā)射過程的熒光發(fā)射過程的速率速率及及無輻無輻射過程的射過程的速率速率有關。有關。2.3.1 熒光量子產率熒光量子產率32 式中，式中，kf 是是熒光發(fā)射過程熒光發(fā)射過程的速度的速度常數，常數， ki 是

20、是系間跨躍和外轉換等有系間跨躍和外轉換等有關無輻射躍遷過程關無輻射躍遷過程的速率常數。的速率常數。iffkkk 一般而言，一般而言， kf 主要取決于主要取決于分子的化學結構分子的化學結構，而，而ki 主要主要取決于取決于化學環(huán)境化學環(huán)境。 分子結構分子結構 發(fā)光分子所處的環(huán)境發(fā)光分子所處的環(huán)境因此，因此，影響物質熒光強度的因素主要有兩個：影響物質熒光強度的因素主要有兩個：2.3.1 熒光量子產率熒光量子產率332.3.2 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素 一般地，具有一般地，具有強熒光的分子強熒光的分子都具有都具有大的共軛大的共軛鍵鍵結構，結構，同時，同時，給電子取代基給電子取代基，剛性

21、的平面結構剛性的平面結構均有利于熒光的發(fā)射。均有利于熒光的發(fā)射。 因此，分子中因此，分子中至少具有一個芳環(huán)至少具有一個芳環(huán)或或具有多個共軛雙鍵具有多個共軛雙鍵的有的有機化合物才容易機化合物才容易發(fā)射熒光發(fā)射熒光，而飽和的或只有孤立雙鍵的化合物，而飽和的或只有孤立雙鍵的化合物，不呈現(xiàn)顯著的熒光。不呈現(xiàn)顯著的熒光。 結構對分子熒光的影響主要表現(xiàn)在以下幾個方面：結構對分子熒光的影響主要表現(xiàn)在以下幾個方面：1. 1. 分子結構分子結構342.3.2 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素( (1 1) ) 共軛效應共軛效應 產生產生熒光的有機物質，都含有共軛雙的有機物質，都含有共軛雙鍵體系，鍵體系，共軛

22、體系越大，離域大共軛體系越大，離域大鍵的電子越容易激發(fā)，鍵的電子越容易激發(fā)，熒光熒光越容易產生。越容易產生。芳香族化合物容易發(fā)生熒光，能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)芳香族化合物容易發(fā)生熒光，能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少。族化合物極少。352.3.2 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素 ( (2 2) ) 結構剛性效應結構剛性效應 可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。有很強的熒光。 實驗表明，具有剛性結構的分子容易產生熒光。若實驗表明，具有剛性結構的分子容易產生熒光。若熒光染料吸附在固體表面上，由于固體表面提供的附加熒光染料吸附在

23、固體表面上，由于固體表面提供的附加剛性，也會使熒光增強。剛性，也會使熒光增強。362.3.2 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素芴芴 聯(lián)苯聯(lián)苯 f=1.0 f=0.237偶氮苯偶氮苯雜氮菲雜氮菲382.3.2 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素 此外，分子的這種平面剛性結構效應對許多金屬此外，分子的這種平面剛性結構效應對許多金屬配合物的熒光發(fā)射也有影響。配合物的熒光發(fā)射也有影響。 如如: : 8 8- -羥基喹啉本身的熒光強度遠比其鋅配合物低。羥基喹啉本身的熒光強度遠比其鋅配合物低。 利用這種性質可進行利用這種性質可進行痕量金屬離子痕量金屬離子的測定。的測定。392.3.2 影響熒光強度的

24、因素影響熒光強度的因素(3) 取代基效應取代基效應給電子基團給電子基團，如，如 -NH2、-OH、-OCH3、-NHCH3和和 -N（CH3）2等，使熒光增強；等，使熒光增強；原因：產生了原因：產生了p- 共軛作用，增強了共軛作用，增強了 電子共軛程電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。402.3.2 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素(3) 取代基效應取代基效應 吸電子基團，吸電子基團，如如 -Cl、-Br、-I、-NHCOCH3、-NO2和和 -COOH等，使熒光減弱。等，使熒光減弱。 原因：原因：n*躍遷的躍遷的摩爾吸光系

25、數摩爾吸光系數、量子產率、量子產率均低于均低于*躍遷躍遷。*躍遷躍遷是有機化合物產生熒光的主要躍遷類型。是有機化合物產生熒光的主要躍遷類型。41小結：強熒光的有機化合物具備下特征小結：強熒光的有機化合物具備下特征: :大的共軛大的共軛鍵結構；鍵結構；剛性的平面結構；剛性的平面結構；取代基團為給電子取代基。取代基團為給電子取代基。2.3.2 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素422.3.2 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素 ( (1 1) ) 溶劑效應溶劑效應 溶劑對熒光光譜的影響主要是由于溶劑對熒光光譜的影響主要是由于溶液的介電常數溶液的介電常數和和折射率折射率等因素的作用，這稱為等因素

26、的作用，這稱為一般溶一般溶劑效應劑效應，這種效應是普遍存在的。，這種效應是普遍存在的。 除一般溶劑效應外，除一般溶劑效應外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；都將使化合物的熒光發(fā)生變化； 一般地，一般地，增大溶劑的極性，增大溶劑的極性，光譜紅移。光譜紅移。這是由于這是由于躍遷的能量減小，從而使熒光光譜向長波方向躍遷的能量減小，從而使熒光光譜向長波方向移動。移動。2. 2. 環(huán)境因素環(huán)境因素432.3.2 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素 ( (2 2) ) 溫度的影響溫度的影響 一般地，一般地，隨溫度降低隨溫度降低，溶液中熒光物質的，溶

27、液中熒光物質的量子量子效率效率和和熒光強度熒光強度將將增大增大，并伴隨，并伴隨光譜的藍移。光譜的藍移。原因：原因：溫度降低，介質的粘度增大，溶劑的溫度降低，介質的粘度增大，溶劑的馳豫作用馳豫作用大大減小。大大減小。溫度升高，碰撞頻率增加，溫度升高，碰撞頻率增加，外轉換外轉換的去激發(fā)幾率增加。的去激發(fā)幾率增加。 因此，選擇因此，選擇低溫條件下低溫條件下進行熒光檢測將進行熒光檢測將有利于提高有利于提高分析的靈敏度分析的靈敏度。442.3.2 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素 ( (3 3) ) pHpH的影響的影響 對于含有對于含有酸性酸性或或堿性基團堿性基團的熒光物質的熒光物質而言，而言，溶

28、液的溶液的pHpH將對這類物質的將對這類物質的熒光強度熒光強度產生較大的影響。產生較大的影響。 因此在熒光測量中往往需要因此在熒光測量中往往需要控制溶液的控制溶液的pHpH值值。NH3OHHNH2NHOHHpH12 無熒光無熒光 苯胺陽離子苯胺陽離子 苯胺分子苯胺分子 苯胺陰離子苯胺陰離子452.3.2 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素 ( (4 4) ) 散射光的影響散射光的影響 p 瑞利瑞利( (ReyleighReyleigh) )散射光散射光 光子和物質分子碰撞時，未發(fā)生能量交換，僅運動方向發(fā)生光子和物質分子碰撞時，未發(fā)生能量交換，僅運動方向發(fā)生改變，波長與入射光波長相近，由溶劑、

29、容器、膠體等散射引起改變，波長與入射光波長相近，由溶劑、容器、膠體等散射引起 選擇適當的波長，由單色器消除選擇適當的波長，由單色器消除p 溶劑的拉曼（溶劑的拉曼（RamanRaman）光散射）光散射 光子和物質分子碰撞時，運動方向發(fā)生改變，同時發(fā)生能量光子和物質分子碰撞時，運動方向發(fā)生改變，同時發(fā)生能量交換，波長與熒光波長相近，隨激發(fā)光改變而改變，由空白溶劑產交換，波長與熒光波長相近，隨激發(fā)光改變而改變，由空白溶劑產生。生。 采用波長較短的激發(fā)光可避免干擾。采用波長較短的激發(fā)光可避免干擾。 462.3.2 影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素 ( (5 5) ) 熒光猝滅熒光猝滅 熒光分子與熒

30、光分子與溶劑溶劑或或其它溶質分子之間其它溶質分子之間相互作用，使相互作用，使熒光強度減弱熒光強度減弱的作用稱為的作用稱為熒光猝滅熒光猝滅。包括包括碰撞碰撞猝滅猝滅、氧、氧的的猝滅猝滅、濃度（自）猝滅濃度（自）猝滅 和自吸收和自吸收等。等。 能引起熒光強度降低的物質稱為能引起熒光強度降低的物質稱為猝滅劑猝滅劑。 472.4 分子熒光光譜儀分子熒光光譜儀熒光光譜儀是由熒光光譜儀是由光源光源，激發(fā)單色器激發(fā)單色器，樣樣品池品池，發(fā)射單色器發(fā)射單色器，檢測器檢測器及及記錄系統(tǒng)記錄系統(tǒng)等組成。等組成。482.4 分子熒光光譜儀分子熒光光譜儀 光源發(fā)出的光經光源發(fā)出的光經激發(fā)單色器激發(fā)單色器分光后分光后得

31、到得到特定波特定波長激發(fā)光長激發(fā)光，入射到樣品使熒光物質激發(fā)產生熒光，入射到樣品使熒光物質激發(fā)產生熒光，通常在通常在9090度度方向上進行熒光測量。方向上進行熒光測量。 發(fā)射單色器與激發(fā)單色器互成直角。經發(fā)射單發(fā)射單色器與激發(fā)單色器互成直角。經發(fā)射單色器分光后使熒光達到檢測器而被檢測。色器分光后使熒光達到檢測器而被檢測。492.4 分子熒光光譜儀分子熒光光譜儀502.4 分子熒光光譜儀分子熒光光譜儀512.4 分子熒光光譜儀分子熒光光譜儀522.4 分子熒光光譜儀分子熒光光譜儀53激發(fā)單色器激發(fā)單色器 用于熒光激發(fā)光譜的掃描及選擇激發(fā)波長；用于熒光激發(fā)光譜的掃描及選擇激發(fā)波長；發(fā)射單色器發(fā)射單

32、色器 用于掃描熒光發(fā)射光譜及分離熒光發(fā)射波長。用于掃描熒光發(fā)射光譜及分離熒光發(fā)射波長。2.4 分子熒光光譜儀分子熒光光譜儀54電荷偶合元件檢測器電荷偶合元件檢測器2.4 分子熒光光譜儀分子熒光光譜儀55紫外紫外-可見分光光度計可見分光光度計測量池測量池(吸收池吸收池)I0ItI0ItIF,p562.5 分子熒光光譜法的應用分子熒光光譜法的應用 分子熒光光譜法具有分子熒光光譜法具有高的靈敏度高的靈敏度和和好的選擇性好的選擇性。 熒光分析法的應用廣泛，可熒光分析法的應用廣泛，可測定測定6060余種元素余種元素，尤其，尤其適合對適合對生物大分子的檢測生物大分子的檢測。 此外，還可作為高效液相色譜及毛

33、細管電泳的此外，還可作為高效液相色譜及毛細管電泳的檢測檢測器器。572.5 分子熒光光譜法的應用分子熒光光譜法的應用（1 1）熒光強度與濃度的基本關系式）熒光強度與濃度的基本關系式1 1. . 熒光定量分析熒光定量分析bC303. 20teT,bCIIlgTlgA bC303.20te1T1II1 )e1(IIIbC303.20t0 P13958)1 ()(303200bC.tFeIIII!nx!4x!3x!2x!1x1en432x 2.5 分子熒光光譜法的應用分子熒光光譜法的應用)! 4)30. 2(! 3)30. 2(! 2)30. 2(30. 2(4320 bCbCbCbCIIF59對于

34、稀溶液，當對于稀溶液，當 bcbc0.020.02時：時：CbIk30. 2I0FF IF-熒光強度熒光強度 F-熒光量子產率熒光量子產率b-吸收光程吸收光程 -摩爾吸光系數摩爾吸光系數C-熒光物質濃度熒光物質濃度CKIF 當當I0一定時，一定時，2.5 分子熒光光譜法的應用分子熒光光譜法的應用60 低濃度低濃度時，時，熒光強度與物質的濃度呈線性關系，熒光強度與物質的濃度呈線性關系， 高濃度高濃度時，由于自熄滅和自吸收等原因，熒光強度時，由于自熄滅和自吸收等原因，熒光強度與物質的濃度與物質的濃度不呈線性關系不呈線性關系2.5 分子熒光光譜法的應用分子熒光光譜法的應用 與紫外可見分光光度法相比，

35、其靈敏度可與紫外可見分光光度法相比，其靈敏度可高出高出24個數量級個數量級，其檢測下限通常可達，其檢測下限通?？蛇_0.10.001 gcm-3。 原因？原因？612.5 分子熒光光譜法的應用分子熒光光譜法的應用（2）單組分的熒光測定）單組分的熒光測定n 直接測定法：直接測定法：適用于有熒光的物質適用于有熒光的物質n 間接測定法：間接測定法：適用于適用于不發(fā)生熒光，或熒光量子不發(fā)生熒光，或熒光量子效率很低物質。效率很低物質。l利用利用化學反應化學反應使非熒光物質轉變?yōu)闊晒馕镔|；使非熒光物質轉變?yōu)闊晒馕镔|；例：例：甾族化合物，經甾族化合物，經濃濃H2SO4處理后，使不產生熒光的環(huán)狀醇類結構改變處理

36、后，使不產生熒光的環(huán)狀醇類結構改變?yōu)槟墚a生熒光的酚類結構。為能產生熒光的酚類結構。l熒光猝滅法熒光猝滅法，若被測物質具有熒光猝滅劑的作用，可若被測物質具有熒光猝滅劑的作用，可測量熒光強度的降低來測定該熒光物質的濃度。測量熒光強度的降低來測定該熒光物質的濃度。例：硼砂對姜黃素的熒光強度有顯著的淬滅作用，可用于測定食品中的硼例：硼砂對姜黃素的熒光強度有顯著的淬滅作用，可用于測定食品中的硼砂。砂。 622.5 分子熒光光譜法的應用分子熒光光譜法的應用無機化合物無機化合物 利用金屬離子，如鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂及某些稀利用金屬離子，如鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂及某些稀土元素等，土元素等，與有機試劑形成熒光

37、配合物與有機試劑形成熒光配合物來進行熒光分析。來進行熒光分析。有機化合物有機化合物 熒光分析可測定許多類有機化合物，在臨床、生物熒光分析可測定許多類有機化合物，在臨床、生物化學和環(huán)境保護等領域中十分重要?；瘜W和環(huán)境保護等領域中十分重要。632.5 分子熒光光譜法的應用分子熒光光譜法的應用CCHOOHNOHNHOCOOHOH幾種常用的熒光試劑幾種常用的熒光試劑試劑試劑測定的元素測定的元素安息香安息香B, Zn, Ge, Si2,2-二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯Al, F, MgNOH2-羥基羥基-3-萘甲酸萘甲酸Al, Be8-羥基喹啉羥基喹啉Al, Be652.5 分子熒光光譜法的應用分子熒光光譜

38、法的應用（2）單組分的熒光測定）單組分的熒光測定 定量方法可采用定量方法可采用標準曲線法標準曲線法。 首先測定一系列的標準溶液的熒光強度，首先測定一系列的標準溶液的熒光強度，繪制熒光強度繪制熒光強度濃度標準曲線，再測量試樣的濃度標準曲線，再測量試樣的熒光強度，從而求得其濃度。熒光強度，從而求得其濃度。1 1. . 熒光定量分析熒光定量分析662.5 分子熒光光譜法的應用分子熒光光譜法的應用（3）多組分的熒光測定）多組分的熒光測定 利用熒光物質本身具有的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，利用熒光物質本身具有的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，實驗時可以選擇任一波長來進行多組分的熒光測定實驗時可以選擇任一波長來進行多

39、組分的熒光測定。 若二組分的若二組分的熒光光譜峰熒光光譜峰不重疊不重疊，可選用，可選用不同的發(fā)不同的發(fā)射波長射波長來測定各組分的熒光強度；來測定各組分的熒光強度； 若二組分的若二組分的熒光光譜峰熒光光譜峰相近相近，甚至，甚至重疊重疊，而，而激發(fā)激發(fā)光譜光譜有明顯差別，這時可選用有明顯差別，這時可選用不同的激發(fā)波長不同的激發(fā)波長來進行來進行測定。測定。672.5 分子熒光光譜法的應用分子熒光光譜法的應用（1）溶液中單分子行為的研究）溶液中單分子行為的研究2 2. . 其它應用其它應用 分子熒光方法利用激光誘導產生超高靈敏度，這分子熒光方法利用激光誘導產生超高靈敏度，這已能已能實時檢測到溶液中單分子的行為實時檢測到溶液中單分子的行為。這一研究工作受。這一研究工作受到了廣泛的關注。到了廣泛的關注。 目前，已觀察到溶液中羅丹明目前，已觀察到溶液中羅丹明6G6G分子，熒光素分子分子，熒光素分子等及其標記的等及其標記的DNADNA分子的單分子行為。分子的單分子行為。682.5 分子熒光