10氨基酸生產(chǎn)

1、第二節(jié) 氨基酸生產(chǎn)工藝主講人：韓北忠 劉 萍第九章第九章 發(fā)酵工程各論發(fā)酵工程各論 氨基酸是構(gòu)成蛋白成分 目前世界上可用發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸有20多種。Introduction History of amino acids production:The story of started in 1908 Isolated glutamic acid, delicious tasteScreen for amino-acid-excreting microorganisms:Corynebacterium glutamicum, In 1957.Monosodium glutamate (MSG):A

2、 flavor-enhancing compound (Umami)氨基酸 碳原子分別以共價(jià)鍵連接氫原子、羧基和氨基及側(cè)鏈。側(cè)鏈不同，氨基酸的性質(zhì)不同。氨基酸的用途1. 食品工業(yè)： 強(qiáng)化食品(賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸于小麥中) 增鮮劑：谷氨酸單鈉和天冬氨酸 苯丙氨酸與天冬氨酸可用于制造低熱量二肽甜味劑(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此產(chǎn)品1981年獲FDA批準(zhǔn),現(xiàn)在每年產(chǎn)量已達(dá)數(shù)萬噸。 2. 飼料工業(yè)： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造動(dòng)物飼料 3. 醫(yī)藥工業(yè)： 多種復(fù)合氨基酸制劑可通過輸液治療營養(yǎng)或代謝失調(diào) 苯丙氨酸與氮芥子氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對骨髓腫瘤治療有效,且副作用低。 4. 化學(xué)工業(yè)：谷氨

3、基鈉作洗滌劑,丙氨酸制造丙氨酸纖維。Introduction Amino acids are used for a variety of purposesFood Industry:Flavor enhancer; Sweetener (Glycine)Chemical Industry:Building blocks of compoundsPharmaceutical Industry:In Infusion; in special dietary food(essential amino acid)Animal feed additive:Feedstuff; eg. Soybean -

4、 methionineLeu, Ile, Lys, Phe, Met, Trp, Val, Thr, Arg, HisIntroduction The barrel represents the nutritive value of soybean meal, which is first limited by its methionine content. Production methods and tools Classical strain development:Bacteria do not normally excrete amino acids in significant a

5、mountsbecause regulatory mechanisms control the amino acid synthesis in an economical way.A great number of amino-acid-producing bacteria have been derived by mutagenesis and screening programmes. Production methods and tools Consecutive application:Undirected mutagenesis;Selection for a specific ph

6、enotype;Selection of the mutant with the best AA accumulationProduction methods and tools Application of recombinant techniques:To rapidly develop new producers by increasing limiting enzyme activities;To analyse mechanisms of flux control;To combine this knowledge with classically obtained strains

7、for their further development氨基酸的生產(chǎn)方法 發(fā)酵法： 直接發(fā)酵法：野生菌株發(fā)酵、營養(yǎng)缺陷型突變發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵和營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株發(fā)酵。 添加前體法 酶法：利用微生物細(xì)胞或微生物產(chǎn)生的酶來制造氨基酸。 提取法：蛋白質(zhì)水解，從水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 傳統(tǒng)的提取法、酶法和化學(xué)合成法由于前體物的成本高,工藝復(fù)雜,難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的目的。 生產(chǎn)氨基酸的大國為日本和德國。 日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。它們能

8、生產(chǎn)高品質(zhì)的氨基酸,可直接用于輸液制劑的生產(chǎn)。 日本在美國、法國等建立了合資的氨基酸生產(chǎn)廠家,生產(chǎn)氨基酸和天冬甜精等衍生物。 國內(nèi)生產(chǎn)氨基酸的廠家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前無論生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品質(zhì)量還難于與國外抗衡。 在80年代中后期,我國從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)合作的方式引進(jìn)輸液制劑的制造技術(shù)和仿造產(chǎn)品,1991年銷售量為二千萬瓶,1996年達(dá)六千萬瓶,主要廠家有無錫華瑞,北京費(fèi)森尤斯,昆明康普萊特,但生產(chǎn)原料都依賴進(jìn)口。 據(jù)專家估計(jì),到2000年,世界氨基酸產(chǎn)值可達(dá)45億美元,占生物技術(shù)市場的7%,國內(nèi)的氨基酸產(chǎn)值可達(dá)40億元,占全國發(fā)酵產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值的12%。 氨基酸

9、發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)展的歷史回顧 所謂氨基酸發(fā)酵,就是以糖類和銨鹽為主要原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物,積累特定的氨基酸。 這些方法成立的一個(gè)重要原因是使用選育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。菌株的育種 從自然界中篩選有產(chǎn)酸能力的菌株,并建立其培養(yǎng)條件. 在確立突變技術(shù)和闡明氨基酸生物合成系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上發(fā)展為營養(yǎng)缺陷變異株、抗藥性菌株的育種。 隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展,接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、細(xì)胞融合等手段首先用于體內(nèi)基因重組,是早期用基因重組方法構(gòu)建生產(chǎn)菌株的嘗試。 隨著載體、受體系統(tǒng)的構(gòu)建及體外基因重組技術(shù)的日益完善,氨基酸生物工程菌的構(gòu)建有了長足的發(fā)展。 蘇氨酸等的生產(chǎn)菌株被成功地構(gòu)建并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)

10、。2.1用野生株的方法 這是從自然界獲得的分離菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的一種方法。 典型的例子就是谷氨酸發(fā)酵。 改變培養(yǎng)條件的發(fā)酵轉(zhuǎn)換法中,有變化銨離子濃度、磷酸濃度，使谷氨酸轉(zhuǎn)向谷氨酰胺和纈氨酸發(fā)酵 2.2用營養(yǎng)缺陷變異株的方法 這一方法是誘變出菌體內(nèi)氨基酸生物合成某步反應(yīng)阻遏的營養(yǎng)缺陷型變異體，使生物合成在中途停止，不讓最終產(chǎn)物起控制作用。 這種方法中有用高絲氨酸缺陷株的賴氨酸發(fā)酵，有用精氨酸缺陷株的鳥氨酸發(fā)酵，還有用異亮氨酸缺陷株的脯氨酸發(fā)酵。 2.3類似物抗性變異株的方法 用一種與自己想獲得的氨基酸結(jié)構(gòu)相類似的化合物加入培養(yǎng)基內(nèi)，使其發(fā)生控制作用，從而抑制微生物的生長。這樣，就可以得到在這種培

11、養(yǎng)基中能夠生長的變異株，而這種變異株正是解除了調(diào)控機(jī)制的，能夠生成過量的氨基酸。 利用此方法發(fā)酵的有:蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、組氨酸和精氨酸。 2.4 體內(nèi)及體外基因重組的方法 基因工程包括細(xì)胞內(nèi)基因重組方法和試管內(nèi)的體外基因重組方法。 體內(nèi)基因重組在應(yīng)用上又稱為雜交育種，主要方法包括：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞融合等，這都是在細(xì)胞內(nèi)暫時(shí)地產(chǎn)生染色體的局部二倍體，在兩條DNA鏈之間引起兩次以上的交叉，是遺傳性重組現(xiàn)象。 細(xì)胞內(nèi)基因重組技術(shù)的缺點(diǎn)是，現(xiàn)在只在同種或有近緣關(guān)系的微生物之間進(jìn)行并較難成功。 代謝工程在闡明代謝途徑及其調(diào)控規(guī)律的基礎(chǔ)上，應(yīng)用重組DNA技術(shù)可以改變代謝途徑分支點(diǎn)上

12、的流量或引入新的代謝步驟與構(gòu)建新的代謝網(wǎng)絡(luò)。 其主要步驟為: 鑒定目標(biāo)代謝途徑涉及的酶(特別是限速酶); 取得酶基因，必要時(shí)可用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，如定點(diǎn)誘變，基因剪接等，使蛋白具有新的特點(diǎn)(增強(qiáng)活性或穩(wěn)定性、解除反饋抑制等); 將一種或多種異源的或改造后的酶基因與調(diào)節(jié)元件一起克隆進(jìn)目標(biāo)生物; 使調(diào)節(jié)元件的作用及培育條件最優(yōu)化。 3.1載體-受體系統(tǒng)及克隆表達(dá)的研究 3.1.1受體的獲得 目前使用的氨基酸工程菌受體主要是大腸桿菌K-12及棒狀桿菌家族，通常是通過誘變選育出的基礎(chǔ)產(chǎn)率較高的菌株。 大腸桿菌遺傳背景研究得清楚，載體系統(tǒng)完善，利于工程菌的構(gòu)建，但它含有內(nèi)毒素且不能將蛋白產(chǎn)物分泌至胞外，為

13、應(yīng)用帶來困難。 棒狀桿菌能克服這兩個(gè)缺點(diǎn)，但載體受體系統(tǒng)研究較晚且有限制修飾系統(tǒng)的障礙，所以獲得利于外源基因?qū)爰氨磉_(dá)且能穩(wěn)定遺傳的受體菌是尚待解決的問題。 3.1.2載體的構(gòu)建 有效的載體需要有在受體菌中可啟動(dòng)的復(fù)制起始位點(diǎn)，這可從棒狀桿菌家族內(nèi)源小質(zhì)粒中獲得; 載體所需的篩選標(biāo)記及外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，可從常用的克隆載體中獲得。 3.1.3基因轉(zhuǎn)移手段 由于棒狀桿菌是革蘭氏陽性菌，CaCl2轉(zhuǎn)化法對它不適用。 通常采用的方法有:原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)，電轉(zhuǎn)化，接合轉(zhuǎn)移。 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法是較早采用的方法，由于受到原生質(zhì)體再生條件的局限，效率不高; 電轉(zhuǎn)化方法由于高效，快速被廣泛使用，目前

14、它的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的1001000倍。 接合轉(zhuǎn)移可用于基因在親緣關(guān)系遠(yuǎn)的物種之間的轉(zhuǎn)移，并且可將外源基因整合于染色體上，易于穩(wěn)定遺傳。 氨基酸發(fā)酵的代謝控制 控制發(fā)酵的條件 控制細(xì)胞滲透性 控制旁路代謝 降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛?消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用 促進(jìn)ATP的積累，以利氨基酸的生物合成控制發(fā)酵的條件 專性需氧菌，控制環(huán)境條件可改變代謝途徑和產(chǎn)物?？刂萍?xì)胞滲透性生物素、油酸和表面活性劑，引起細(xì)胞膜的脂肪酸成分的改變。青霉素：抑制細(xì)胞壁的合成，由于細(xì)胞面內(nèi)外的滲透壓而泄露出來?？刂婆月反x降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛?利用營養(yǎng)缺陷型突變株進(jìn)行氨基酸發(fā)酵必須限制所要求的氨基酸的量。限

15、制精氨酸的濃度可解除反饋抑制，實(shí)現(xiàn)鳥氨酸的生物合成。消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用 使用抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的方法。促進(jìn)ATP的積累，以利氨基酸的生物合成 ATP的積累可促進(jìn)氨基酸的生物合成氨基酸發(fā)酵的工藝控制 培養(yǎng)基 pH 溫度 氧培養(yǎng)基 1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烴 碳源濃度過高時(shí)，對菌體生長不利，氨基酸的轉(zhuǎn)化率降低。 菌種性質(zhì)、生產(chǎn)氨基酸種類和所采用的發(fā)酵操作決定碳源種類2、氮源：銨鹽、尿素、氨水； 同時(shí)調(diào)整pH值。 營養(yǎng)缺陷型添加適量氨基酸主要以添加有機(jī)氮源水解液。 需生物素和氨基酸，以玉米漿作氮源。 尿素滅菌時(shí)形成磷酸銨鎂鹽，須單獨(dú)滅菌?？煞峙骷?/p>

16、。 氨水用pH自動(dòng)控制連續(xù)流加 3、合適C/N 氮源用于調(diào)整pH。 合成菌體 生成氨基酸，因此比一般微生物發(fā)酵的C/N高。 4、磷酸鹽：對發(fā)酵有顯著影響。不足時(shí)糖代謝受抑制。 5、鎂：是已糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑，并促進(jìn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力。 6、鉀：促進(jìn)糖代謝。谷氨酸產(chǎn)酸期鉀多利于產(chǎn)酸，鉀少利于菌體生長。 7、鈉：調(diào)節(jié)滲透壓作用，一般在調(diào)節(jié)pH值時(shí)加入。 8、錳：是許多酶的激活劑。 9、鐵：是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過氧化氫酶的活性基的組成分，可促進(jìn)谷氨酸產(chǎn)生菌的生長。 10、銅離子：對氨基酸發(fā)酵有明顯毒害作用。 生長因子：生物素 作用：影響細(xì)胞膜透性和代謝途徑。 濃

17、度：過多促進(jìn)菌體生長，氨基酸產(chǎn)量低。過少菌體生長緩慢，發(fā)酵周期長。 與其它培養(yǎng)條件的關(guān)系：氧供給不足，生物素過量時(shí)，發(fā)酵向其它途徑轉(zhuǎn)化。 種類：玉米漿、麩皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜為來源。pH對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 作用機(jī)理：主要影響酶的活性和菌的代謝。 控制pH方法：流加尿素和氨水 流加方式：根據(jù)菌體生長、pH變化、糖耗情況和發(fā)酵階段等因素決定。 控制： （1）菌體生長或耗糖慢時(shí)，少量多次流加尿素，避免pH過高 （2）菌體生長或耗糖過快時(shí)，流加尿素可多些，以抑制菌體生長。 （3）發(fā)酵后期，殘?zhí)巧?，接近放罐時(shí)，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困難。 （4）氨水對pH影響大，應(yīng)采取連續(xù)流

18、加。溫度對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 菌體生長達(dá)一定程度后再開始產(chǎn)生氨基酸，因此菌體生長最適溫度和氨基酸合成的最適溫度是不同的。 菌體生長溫度過高，則菌體易衰老，pH高，糖耗慢，周期長，酸產(chǎn)量低。 采取措施：少量多次流加尿素，維持最適生長溫度，減少風(fēng)量等，促進(jìn)菌體生長。氧對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸發(fā)酵：生物合成與TCA循環(huán)有關(guān)。 適宜在缺氧條件下進(jìn)行的亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸發(fā)酵：菌體呼吸受阻時(shí)產(chǎn)量最大。 供氧不足時(shí)產(chǎn)酸受輕微影響的天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵谷氨酸生產(chǎn)工藝 工業(yè)化生產(chǎn)開始于由水解小麥面筋或大豆蛋白質(zhì)而制取。 1957年，日本率先采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，并投入

19、大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，這是被譽(yù)為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重大創(chuàng)舉，使發(fā)酵工業(yè)進(jìn)入調(diào)節(jié)代謝的調(diào)控階段。 目前世界產(chǎn)谷氨酸鈉30噸/年，占氨基酸總量的2/3。 我國現(xiàn)已有200余家生產(chǎn)，年產(chǎn)量達(dá)15萬噸，居世界首位。 產(chǎn)生菌株特點(diǎn)： 革蘭氏陽性 不形成芽胞 沒有鞭毛，不能運(yùn)動(dòng) 需要生物素作為生長因子 在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸。 谷氨酸生物合成機(jī)理： 由三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脫氫酶和氫供體存在下進(jìn)行還原性氨化作用而得到。 一、淀粉水解糖的制備：酸水解或酶水解 1、調(diào)漿：干淀粉用水調(diào)成10-11Bx的淀粉乳，加鹽酸0.5-0.8至pH1.5。 2、糖化：蒸汽加熱，加壓糖化25min。冷卻至80下

20、中和。 3、中和：燒堿中和，至pH4.0-5.0 4、脫色：活性炭脫色和脫色樹脂。活性炭用量為0.6-0.8，在70度及酸性條件下攪拌后過濾。 酶法糖化：以大米或碎米為原料時(shí)采用 大米進(jìn)行浸泡磨漿，再調(diào)成15Bx，調(diào)pH6.0，加細(xì)菌a-淀粉酶進(jìn)行液化，85 30min，加糖化酶60 糖化24h，過濾后可供配制培養(yǎng)基。 糖蜜原料：不宜直接用來作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因含豐富的生物素。 預(yù)處理方法：活性碳或樹脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。也可以在發(fā)酵液中加入表面活性劑吐溫60或添加中青霉素。 二、菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 1、斜面培養(yǎng)：主要產(chǎn)生菌是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬、節(jié)桿菌屬。 我國各工廠目

21、前使用的菌株主要是鈍齒棒桿菌和北京棒桿菌及各種誘變株。 生長特點(diǎn)：適用于糖質(zhì)原料，需氧，以生物素為生長因子。 斜面培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉組成的pH7.0-7.2瓊脂培養(yǎng)基，32培養(yǎng)18-24h。 2、一級種子培養(yǎng)：由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳組成。pH6.5-6.8。1000ml裝200-250ml振蕩，32 培養(yǎng)12h。 3、二級種子培養(yǎng)：用種子罐培養(yǎng)，料液量為發(fā)酵罐投料體積的1，用水解糖代替葡萄糖，于32 進(jìn)行通氣攪拌7-10h。種子質(zhì)量要求：二級種子培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，無雜菌或噬菌體污染，菌體大小均一，呈單個(gè)或八字排列。活菌數(shù)為108-109 /ml。三、谷

22、氨酸發(fā)酵 1、適應(yīng)期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。 措施：接種量和發(fā)酵條件控制使期縮短。 2、對數(shù)生長期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急劇下降后維持在一定水平。菌體濃度迅速增大，菌體形態(tài)為排列整齊的八字形。不產(chǎn)酸。12h。 措施：及時(shí)供給菌體生長必須的氮源及調(diào)節(jié)pH，在pH7.5-8.0時(shí)流加尿素；維持溫度30- 32 3、菌體生長停止期：谷氨酸合成。 措施：提供必須的氨及pH維持在7.2-7.4。大量通氣，控制溫度34-37 。 4、發(fā)酵后期：菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑汀?措施：營養(yǎng)物耗盡酸濃度不增加時(shí)，及時(shí)放罐。 發(fā)酵周期一般為30h。Production Process of L-Glutamic acid Sketch of main reaction in Corynebacterium glutamicumConnected with the citric acid cycly谷氨酸發(fā)酵控制 （1）生物素：作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA的輔酶，參與脂肪酸的生物合在，進(jìn)而影響磷酯的合成。 當(dāng)磷酯含量減少到正常時(shí)的一半左右時(shí)，細(xì)胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內(nèi)滲