淺述蛋白質分離純化的新技術綜述模板

1、淺述蛋白質分離純化的新技術摘要：本文主要介紹了濁點萃取法、置換色譜法、親和層析法、親和色 譜法、凝膠電泳、雙水相萃取等蛋白質的最新分離純化技術，綜和近年來 國內外的一些研究結果，結合實際應用的例子，分析了各種分離純化方法 的優(yōu)點，同時指出其不足之處。文章最后展望了蛋白質分離純化技術的發(fā) 展趨勢。關 鍵詞：分離純化 蛋白質 進展生物技術的發(fā)展非常迅速，基因工程、蛋白質工程、發(fā)酵工程等生物技術, 已經能設計、制造、生產人們急需的多種蛋白質。和其它生物產品的生產過程一樣蛋白質的生產過程一般也分為上、中、下游過程。上、中游過 程是運用生物技術生產目標產物，下游過程是指對含有目標產物的物料進 行處理、分

2、離、純化、加工目標產物。本文主要綜和近年來國內外的研究 結果，介紹了蛋白質的最新分離純化技術。2.蛋白質的分離純化方法：2.1濁點萃取法(CPE):2.1.1概念及原理：濁點萃取法(cloud point extraction , CPE)1是近年來出現的一種新興的 液一液萃取技術，它不使用揮發(fā)性有機溶劑，不影響環(huán)境。它以中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點現象為基礎，改變實驗參數引發(fā)相分離，將疏水性物質與親水性物質分離。目前該法已成功地應用于金屬螯合 物、生物大分子的分離與純化及環(huán)境樣品的前處理中2-5。CPE法除了利用增溶作用外，還利用了表面活性劑另一個重要性質 一一濁 點現象。溶液靜置

3、一段時間（或離心）后會形成兩個透明的液相：一為表面 活性劑相（約占總體積的5%）;另一為水相（膠束濃度等于CMC）。夕卜界條 件（如溫度）向相反方向變化，兩相便消失，再次成為均一溶液。溶解在溶 液中的疏水性物質如膜蛋白，與表面活性劑的疏水基團結合，被萃取進表 面活性劑相，親水性物質留在水相，這種利用濁點現象使樣品中疏水性物 質與親水性物質分離的萃取方法就是濁點萃取。圖1顯示了由溫度變化引發(fā)的這種相分離現象。溫度的改變，引起水化層的破壞，增強了表面活性 劑的疏水性。2.1.2蛋白質分離純化中的應用：CPE法可用于分離膜蛋白、酶、動物、植物和細菌的受體，還可以替代一 些分離方法如硫酸鉉分級法作為純

4、化蛋白的第一步，與色譜方法聯(lián)用。另 外，CPE法分離純化蛋白質已經可以實現大規(guī)模操作。Minuth等人成功地進行了膽固醇氧化酶濁點萃取的中試研究。雖然使用離心分離器可以使 CPE大規(guī)模連續(xù)進行，但商品離心分離器用于CPE的效率和容量仍需進一步研究。而且，他們發(fā)現相分離操作受細胞培養(yǎng)時產生的表面活性物質影響較大，體系兩相間密度差較小，表面張力較小，含產物的表面活性劑 相的流變學行為較復雜， 操作較難。表1列出了 CPE法近幾年來在蛋白質 分離純化中的應用。(1) CPE法用于分離純化膜蛋白膜蛋白(內嵌膜蛋白、外圍膜蛋白)硫水性強、難溶于水，抽提內嵌膜蛋白 時，既要削弱它與膜脂的硫水性結合，又耍使

5、它保持硫水基在外的天然狀 態(tài)，較難分離純化。由于表面活性刑具有兩親性，它一直作為腹蛋白理想 的增溶劑。增溶時，膜蛋白琉水部分嵌入膠束的硫水核中而與膜脫離，又 保持了膜蛋白表面的廢水結構。 相分離后，膜蛋白與表面活性劑共同析出， 與親水性蛋白質分離。所以，CPE法在分離純化膜蛋白方面極有優(yōu)勢。(2) 與其它分析技術的聯(lián)用CPE可以作為高效液相色譜(HPLC)、流動注射分析(FIA)、毛細管電泳(C E)等儀器分析的樣品前處理方法，提高檢出靈敏度。表面活性別可以防止 樣品吸附在玻璃容器上，易于與FIA中的載液及HPLC中的有機流動相或 膠束流動相混合，可以直接進樣。但是在很多應用中需要除去表面活性

6、劑 后再與儀器聯(lián)用。將萃取物與表面活性劑分離的方法很多。對于CMC >1mM的表面活性劑如兩性離子表面活性劑可用透析法，但操作時間較長 (2 4h左右)。對于CMC較小的表面活性劑可通過色譜柱分離除去，如凝膠 柱、毛紉管柱等，分離出的表面活性劑可以再利用，也可以作焚燒處理。但CPE作為HPLC的樣品前處理方法有兩個缺點：第一，常用的表面活性劑在UV區(qū)域有很強的背景吸收。第二，操作時間較長，從色譜柱上需 用幾個小時洗脫表面活性劑。表面活性劑的洗脫可能會干擾分析物的測定3。2.2置換色譜法：2.2.1概念及分離機理：置換色譜(displacement chromatography)6作為一種

7、非線性色譜技術，是指樣品輸入色譜柱后，用一種與固定相作用力極強的置換劑(displacer)通人色譜柱，去替代結合在固定相表面的溶質分子。樣品在置換劑的推動 下沿色譜柱前進，使樣品中各組分按作用力強弱的次序，形成一系列前后 相鄰的譜帶，并在置換劑的推動下流出色譜柱7。置換色譜的分離行為與樣品組分和置換劑在實驗條件下的吸附等濕線有直接的聯(lián)系。置換色譜要 求樣品組分及置換劑的吸附等濕線應為Langmuir型，而且置換劑相對于被分離的各組分應有最強的吸附能力，其吸附等溫線位于所有組分的吸附 等溫線的上方7,見圖1(A)。根據物料平衡方程，置換劑在柱中的移動速 度uD有下列關系：式中uD為流動相的線速

8、，巾為相比，qD和cD分別為置換劑在固定相 和流動相中的濃度，qD/cD是直線OD的斜率，稱之為操作線(operating line) o當操作線的斜率小于被分離組分等溫線的起始斜率，樣品才能進行置換展開，最終形成如圖l(中的置換序列，這是在理想的情況下(假定無軸 向擴散及二次化學平衡)獲得的置換色譜圖。每一組分形成矩形的平臺 (Plateau說脫峰，相鄰各組分的平臺洗脫峰組成了一個臺階狀的色譜圖。此時，樣品中不同的組分以置換劑的速度前進，即達到等速狀態(tài)(isobathic conditions):uD = u2; u3= u4式中u2、u3、u4指被置換的三組分的速度2.2.2影響置換色譜分

9、離的因素：(1) 置換劑置換劑的選擇是置換色譜能否成功地分離和純化目標產物的關鍵因素之一7,8。對于蛋白質生物大分子的置換色譜來說，多離子型的置換劑與離子交換續(xù)料相結合是目前常用的分離方式。傳統(tǒng)觀點認為分子量相對大的聚電解質是較合適的置換劑，因為它們對固定相的結合比分離物更強，如短甲基葡聚糖(CMD)、硫酸葡聚糖、短甲基淀粉(CMS)9、硫酸魚精蛋、肝素、多硫酸戊聚糖(PPS)等。近期的研究表明，低分子量的化合物作為置換劑則更有優(yōu)勢，因為即使置換劑與蛋白質產物的峰有疊加，在后處理過程中，低分子量置換劑則較容易從目標產物中分離；同時，合成低分子量置換劑成本較低，色 譜柱再生過程也比分子量大的置換

10、劑快。(2) 固定相理想的固定相應具備以下條件：樣品及置換劑在固定相上應有較強的吸附作用，且吸附是可逆的；樣品及置換劑在固定相上的吸附等溫線應為Langmuir型；樣品各組分在固定相上的吸附能力應有較大差別，以保證置換 色譜帶的交疊部分盡可能小而獲得良好的產率；有較好的化學穩(wěn)定性，可 適用于不同pH值的緩沖液和有機溶劑；有較大的比表面及吸附容量；有 較好的機械強度，而且容易再生。置換色譜中的環(huán)境不同，置換效果也不 一樣，即使是選用同樣的硅膠，由于來源和制備方法上的差異也會影響置 換效率。反相色譜中使用的烷基硅膠柱常被應用于置換色譜。同其它硅膠固定相相比， 烷基硅膠柱由于柱容量低及非選擇性吸附等

11、缺點，很少被用于洗脫色譜， 但它卻可以用于置換色諾，并成功地分離了對映異構體。1、 問題：電滲純化蛋白質，結果幾乎沒得到蛋白，請問哪位有高見今夜純化蛋白，本以為唾手可得，結果卻大失所望.我用SDS-PAGE分離，KCL顯帶，割膠，而后電滲分離，測 OD值極低，請問哪位有這方面的經 驗或其它方法，望賜教。解決：多挖點膠，收集起來，放在 1.5離心管里， 用PBS搗爛，4度 過夜。然后離心，收集上清即可。最后，把上清凍成 干粉。2、問題：蛋白質提純的方法：SDS-PAGE and N-terminal amino acid sequence analysis. (dahuaidang) S DS

12、polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed in 1 2% acrylamide and 0.1% SDS with adiscontinuous Tris-glycine buffer sy stem. Purified enzyme was subjected to SDS-PAGE and electroblotted toI mmobilo- PSQ 0.45mpolyvinyl idene fluoride membrane (Millipore). After the membrane was staine

13、d withPonceau S (Sigma), the enzyme protein was cut out and washed with m ethanol. The membrane strip holding the protein was subjected to automa tic Edman degradation for sequencing of the N-terminal aminol acids usi ng anApplied Biosystems 477A protein sequencer (Parkin Elmer).3、問題：蛋白質純化，裝柱，過柱應注意事

14、項有哪些？ (dahuaidang)現在要進行蛋白質純化，有關裝柱和過柱的注意事項有哪些呀？還有，需要測序的蛋白質樣品，大概需要多少，樣品要求有哪些。柱子 sephadex-200,和DEAE-纖維互素。第一，手工裝柱一般只適宜于大量蛋白質的提取。分子篩柱一般在鹽析以 后用效率才高，因為它的分媛實汀R話閹葉莢死捎茫斜校蹋彌潁疲校蹋彌？Gelfitration column).如果手工裝柱，長度應是內徑的6 0 8 0倍， 一 般柱長應在1.2-2米，對于軟膠，走一次柱須1 2小時以上，對硬膠，也需5 6小時。第二，儀器檢測器靈敏度調整：最重要的是確定儀器工作正常，信號相應正常?？捎迷跈z測器出口

15、通氣泡和檢測器入口注射有色樣品的方法確認儀器正常和估計靈敏度。第三，均勻，無氣泡，平衡充分，分子篩要注意長度與直徑比。測序的蛋 白量我用的方法的量是 SDS-PAGE第四，如果是測序的話，跑SDS-PAGE，把染出的蛋白質帶，挖下來.，直接拿去做質譜，只要你有錢國家生物醫(yī)學分析中心。還有就是要保證挖的是一個蛋白質帶，不能含雜蛋白質的，不然，把雜蛋白質測了怎么辦。第五，測序跟質譜不是一回事兒的。做質譜可以做分子量和質譜圖，但是 未必是序列。序列是要單測的。北大有位老師可以做：180塊錢一個氨基酸。做質譜多得是：測分子量大約是450塊錢了，測圖譜的要一千多塊。4、問題：跑SDS-PAGE有好多帶，

16、而過柱時卻沒有峰，原因是什么？1、會不會是洗脫太快。2、查查有沒有斷層。3、SDS-PAGE分離能力強，而在柱子FRACTION 中幾個低峰依次串在一 起就不明顯了。4、上柱前樣品要濃縮，保證樣濃度不能太低。如沒濃縮，檢測儀的量程 又沒選好，可能看不出來。5、Sephadex是Amersham公司經典的層析填料，有很高的選擇性，不同 顆粒大小的填料有不同的分離范圍，主要用于凝膠層析（亦稱分子篩）。粗顆粒流速較快，細顆粒流速較慢，但分辨率較高。 Sephadex 200的分離 范圍（以球蛋白計）是5- 60kDa。這種填料的另一個優(yōu)點是較便宜。 （也 夠貴的） 現已被新一代Bioprocess填

17、料代替。DEAE-纖維素我沒用過，應該是用于離子交換吧。這是一種弱陰離子填料。以下情況都是正常的：1, 沒有峰的部位有帶。可能吸收低上樣量少或者檢測手段不對頭（最麻 煩，好像只好分部收集了，但是一般情況下，首先考慮的是找到更合適的 檢測手段）。2, 一個很好的峰的部位有很多帶。這個就沒有必要解釋了。3, 有峰的部位沒有帶。可能是有紫外吸收的小分之或者降解的短肽（這 個最可恨）或者在電泳中間分子量太小跑到頂端了等等。4, 同一個蛋白出現在不同的部位。在離子交換中可能是電荷分布不對稱。 上面的所有的還有一個可能就是柱子有問題，那我就不好說了。但是我用 到的都是世界上最好的公司的預裝柱，所以我就不考

18、慮了。還有的情況是 上面的1、4同時出現，那真是要把人氣死！ ！ ！至于說拖尾，刺峰等等 都很常見。而且首先大概就是考慮柱子效率下降了或者壞了。呵呵！ ！ ！5, 樣品濃度多少才不算低？0.8mg/ml的蛋白質濃度算不算低。我不太想 用透析袋濃縮，那樣會丟失好多樣品。想直接加樣，洗脫。還有，上樣體積問題？ 2.6*96cm柱子，上100ml的樣品怎么樣？最后一個問題，樣品 中含有少量edta會不會有影響？1、如果是離子交換，上樣濃度太大反而不好，這樣子動態(tài)載量會減??； 2、如果是凝膠層析，上樣濃度要盡量大些，道理和電泳一樣，樣品在跑的過程中不可避免地會被稀釋，變得 "broad&qu

19、ot;,雜質和目標蛋白的洗脫峰就有更多的部分重疊，影響純度。3、 關于凝膠層析的上樣量，通常是柱體積的2-5%,太多會影響分離效 果。你的上樣量顯然太大了。在現有條件下，可以通過連續(xù)批次上樣，即 不等前次樣品跑出柱子，就第二次上樣，通?？梢宰龅揭粋€柱體積上兩次樣，這樣子可以節(jié)省時間和試劑。但要具體摸索。4、至于量程的設定，我建議先用緩沖液回零，再用注射器或泵將樣品注入檢測器，調至滿刻度，應該差不多了。5、edta是常用的生物緩沖液的成分之一，它在某些情況下會影響層析， 具體情況具體分析。6、 什么叫連續(xù)批次上樣？具體我應該怎么fumble呀，我還從沒聽說過這 個詞呢。還望指教。一般情況下，上柱

20、的樣品跑出柱子后，根據紫外或電導或其他檢測器的情 況分部收集完成后，才開始第二次上樣，需要用至少一個柱體積的緩沖液。 這種情況下，絕大部分緩沖液是用于將樣品沖”出柱子，尤其是后半部分的緩沖液。有些浪費。這部分緩沖液的完全可以再上一次樣品，適當地調節(jié)兩次上樣的間隔，可以做到兩次樣品完全分開而不會重疊，從而一個柱 體積的洗脫中可以兩次上樣，節(jié)省試劑，縮短時間，即所謂 連續(xù)批次”。這是相對通常情況下而言的。7、例子：樣品是用10mMTris-Cl,pH7.4(含10mMEDTA)，而流洗緩沖是30mMTris-Cl,pH7.9,我自己認為這樣應該不會有太大影響吧，希望有知情者 告知。好讓我下次改正。

21、分析：根據你的描述，看來你是在用Sephadex 26/100做凝膠層析。1、凝膠層析主要用途有兩個，一個是在其分辨率范圍內根據分子大小進行分離，常用于蛋白質純化的最后一步，即精細純化(polishing),由于樣品體積明顯影響分離速度和分辨率，故很少用于粗提純。另一個用途是 脫鹽/緩沖液置換，即將蛋白或其他大分子量的組分與無機鹽等小分子組分 分開。常用于不同層析步驟之間的緩沖液置換，使得樣品與待使用的緩沖 液成分盡量一致。目前 Amersham公司的填料中Sephadex G25較常用于2、如果你的凝膠柱子用于蛋白質的分離純化，如我前所提，分辨率至關 重要。裝柱的效果直接影響分離效果。裝得不

22、好的柱子是對填料的浪費，尤其是用好的凝膠。不知道你是否測過這個柱子的柱效？合格的 Sephadex G100柱子的每米理論塔板數應在 3000- 6000之間。如果低于3000,最好重裝。3、平衡也很重要。柱子裝完后，要用和上樣緩沖液盡量相同的緩沖液平衡，流速也與上樣盡量一致，平衡至少5個柱體積，讓填料 喝飽”，即流出的液體和進的液體成分盡量一致，有時紫外檢測器的走線平穩(wěn)并不一定 意味著平衡完成即是如此。連續(xù)上樣過程中，也要適當進行平衡，比如 3 -5次上樣后平衡2個柱體積，對柱子的分離效果和壽命都有好處。8、 問題：823a型紫外檢測儀一一3057型便攜式記錄儀。我不明白這種組 裝是啥道理？

23、是通過什么信號使得記錄儀能夠記錄到，由檢測器檢測出的 信息。所以我在操作時，不知道怎么調節(jié)。那些按鈕之間的關系？1. 短接記錄儀，記錄筆應回到機械零位，否則調之；2. 接通檢測器，檢測器中充滿1mg/ml的蛋白質溶液(如Albumin),調節(jié)檢測器的信號輸出(通常是用電壓標識mv),使記錄筆接近100%滿刻度；3. 檢測器中充滿緩沖液，看記錄筆的位置，最好接近10%刻度的地方，這樣防止出現吸光度值低于緩沖液無法記錄的情況；如果筆位太高，應增 大檢測器信號輸出，重新按步驟2調節(jié)；反之降低信號輸出；有的記錄儀也可調節(jié)輸入信號的范圍，這樣子就更方便了。滿刻度的調節(jié)要視具體應用，不一定是1mg/ml的

24、蛋白濃度。9、about dimension of column: (davidzrock)"The choice of inner diameter may be based on the desired sample load or on considerations of the extradispersioneffects from the wall region,which extends 20 particle diameters away fr om the wall. . The length of the columnis primarily chosen acco

25、rding to the resolution that is required.""The dimensions may be chosen according to the application at hand, bu t most laboratory columns have a 4- to16-mm inner diameter(i.d.) and a length of 25 to 70 cm."From ,Protein Purification principles,High Resolution Methods,and Applications

26、? 2ed edited by J.C. Jansonand L.Ryden"The resolution of two separated zones in gel filtration increases as the sequare root of column length. Longcolumns should,therefore,be used to obtain the best resolution in analytica l fractionation. Bed heights of greaterthan 1m are seldom required. If a

27、 very long bed is judged to be necess ary ,the effective bed height can often beincreased simply by recycling or by using columns coupled in series."從amersham商品化提供的預裝柱能看到，沒有超過1m的。很長的柱子裝填難度極大。裝得好的柱子一根可以當兩根用。關于手工裝柱，取決于裝柱操作者的經驗，完全可以比預裝柱的效果好，而且可以根據試驗的具體情況改變柱子參數。但預裝柱的優(yōu)點是方便、省事，很適合對柱子和填料進行"scanin

28、g"。另外工業(yè)化的層析要求是重復性，對人是不信任的”，而不要求最好的效果，只要滿足要求即可。這時就要有裝柱設備(packingstation) 了?，F應用于工業(yè)生產的凝膠層析柱直徑已 超過1m。10、在室溫下的柱子，怎么保證其膠不發(fā)霉1.柱子裝填和使用過程中要注意減少微生物的污染，如對緩沖液和樣品等 進行澄清、除菌過濾。低溫并不能保證無菌生長。2.柱子在使用過程中，要定期進行在位清洗/消毒(SIP/CIP, sanitization/clean in place)。如1M NaOH處理1hr,可有效地減少微生物污染。具體使用哪種消毒劑以及消毒方法，請參閱凝膠及空柱使用說明書，避免損

29、害凝膠柱。如你沒有，我可幫你查。3. 柱子長期不用時，為防止微生物生長，建議在位保存。如用 10mM NaOH或20%乙醇將柱內的液體全部置換出來， 存放在建議溫度下（不一定是 低溫）。使用前再進行沖洗和平衡。 也可將凝膠取出，保存于上述溶液中。4. 如有微生物生長，應進行滅菌處理，如 1M NaOH或取出凝膠進行高溫 火菌，具體方法亦需事先參閱說明書。From AmershamAntimicrobial agents for chromatographyAqueous buffer solutions will often support growth of micro-organisms

30、c ommonly found in laboratories. Since it is difficult to clean columns that have become heavily contaminated with microorganisms, precautions sho uld be taken to avoid growth in the column or in buffer vessels. Always use fresh buffer solutions and cover the buffer vessels to keep out dust, spores

31、and other particles. If a column will not be used for more than a couple of days, it should be equilibrated with the bacteriostatic agent described in the manual supplied with the separation medium or prepack ed column. We recommend ethanol or sodium hydroxide for general use.These agents are effect

32、ive, inexpensive and do not cause disposal probl ems. Ethanol 20% Many chromatography media from Amersham Bioscie nces are supplied as a suspension containing 20% ethanol. Ethanol, 20%, can also be used as an alternative to NaOH for storing chromatography media under bacteriostaticconditions. It sho

33、uld not be used for columns packed with Sephadex G-types and other media based on Sephadex since the bed will shrink and spoil the packing. Sodium hydroxide Sodium hydroxide, 0.01 M, is an ef fective bacteriostatic agent. At higher concentrations (0.5-1.0 M) it is an effective sanitizing agent for contaminated colum