原位雜交技術(shù)

1、李成仁李成仁組織胚胎學(xué)教研室組織胚胎學(xué)教研室TelTel：752220752220，EmailEmail：中心法則中心法則免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)？核酸分子原位雜交核酸分子原位雜交一、核酸分子原位雜交的基本概念( (一一) )定義定義用已標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測核用已標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測核酸中的互補(bǔ)序列雜交酸中的互補(bǔ)序列雜交, , 從而對組織細(xì)胞中的核酸進(jìn)行從而對組織細(xì)胞中的核酸進(jìn)行定性、定位和相對定量分析定性、定位和相對定量分析。 簡稱原位雜交簡稱原位雜交( (二二) ) 基本原理基本原理堿基互補(bǔ)配對原理堿基互補(bǔ)配對原理加熱變性加熱變性雜交反應(yīng)雜交反應(yīng)酶標(biāo)記的

2、抗探針標(biāo)記物的抗體酶標(biāo)記的抗探針標(biāo)記物的抗體酶顯色反應(yīng)酶顯色反應(yīng)帶標(biāo)記物的探針帶標(biāo)記物的探針定義定義：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNADNA雙鏈解開雙鏈解開 成兩條單鏈的過程。成兩條單鏈的過程。方法：過量酸、堿、加熱、變性試劑如尿素、方法：過量酸、堿、加熱、變性試劑如尿素、 甲酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等甲酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等。( (三三)DNA)DNA變性變性( (denaturationdenaturation) )本質(zhì)本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂是雙鏈間氫鍵的斷裂解鏈解鏈曲線曲線熱變性熱變性變性變性是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范

3、度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，雙鏈圍內(nèi)，雙鏈DNADNA變性一半變性一半所需要的溫度稱為所需要的溫度稱為DNADNA的的解鏈溫度，又稱熔解溫度解鏈溫度，又稱熔解溫度, , Tm)Tm)。其大小與。其大小與G+CG+C含量成含量成正比。正比。熔解溫度熔解溫度(, (, Tm)Tm)Tm=Tm=（G+CG+C）%0.41+69.30.41+69.3 在在適當(dāng)條件下，變性適當(dāng)條件下，變性DNADNA的兩條互補(bǔ)鏈可的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)雙螺恢復(fù)雙螺旋旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。 熱熱變性的變性的DNADNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，又稱為退火。，又稱為退火。DNADNA復(fù)

4、性復(fù)性復(fù)性復(fù)性RNADNA( (一一) )定義定義：是含有互補(bǔ)順序的外源性被標(biāo)記的是含有互補(bǔ)順序的外源性被標(biāo)記的DNADNA或或RNARNA片段，是在原位雜交中用于檢測細(xì)胞片段，是在原位雜交中用于檢測細(xì)胞內(nèi)特定內(nèi)特定DNADNA或或RNARNA順序定位的特殊試劑，順序定位的特殊試劑，探針的堿基序列是已知的，只能與特定的探針的堿基序列是已知的，只能與特定的核酸分子結(jié)合上核酸分子結(jié)合上二、探針二、探針（probeprobe）( (二二) )探針的分類探針的分類根據(jù)探針的核酸性質(zhì)分為根據(jù)探針的核酸性質(zhì)分為 DNADNA探針、探針、RNARNA探針、探針、cDNAcDNA探針、探針、cRNAcRNA探

5、針、探針、寡核苷酸探針寡核苷酸探針 1. 1. cDNA(cDNA(complementary DNA)complementary DNA) 克隆于質(zhì)粒中，可以無限繁殖，克隆于質(zhì)粒中，可以無限繁殖，取之不盡取之不盡 較較不易不易被降解被降解 標(biāo)記方法可靠易行標(biāo)記方法可靠易行優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)互補(bǔ)于互補(bǔ)于mRNAmRNA的的DNADNA分子分子（長度為數(shù)百（長度為數(shù)百- -數(shù)千堿基對）數(shù)千堿基對）優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 雜交效率比雜交效率比DNADNA探針高探針高 在檢測在檢測mRNAmRNA時(shí)所形成的時(shí)所形成的RNA-mRNARNA-mRNA雜交體比雜交體比DNA-mRNADNA-mRNA雜交體穩(wěn)定雜交體穩(wěn)定 缺

6、點(diǎn)：缺點(diǎn)：容易受容易受RNARNA酶的污染而被降解酶的污染而被降解2. 2. RNARNARNARNA是單鏈分子（探針長度是單鏈分子（探針長度50-30050-300堿基對）堿基對） 根據(jù)靶分子而設(shè)計(jì)序列在根據(jù)靶分子而設(shè)計(jì)序列在DNADNA合成儀上合成合成儀上合成 優(yōu)點(diǎn)：形成雜交體快速優(yōu)點(diǎn)：形成雜交體快速( (序列短，雜交時(shí)易于穿透序列短，雜交時(shí)易于穿透) ) 缺點(diǎn)：特異性較低（短鏈和簡單）缺點(diǎn)：特異性較低（短鏈和簡單）3. 3. 寡核苷酸寡核苷酸短鏈探針短鏈探針( (長度長度10-5010-50個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸) )1. 1. 標(biāo)記物標(biāo)記物 3 3H H、3232P P、3535S S、12

7、5125I I等。等。 ( (三三) )探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記( (1 1) )放射性標(biāo)記物放射性標(biāo)記物特點(diǎn)：敏感性高特點(diǎn)：敏感性高 半衰期，放射性污染，成本高，耗時(shí)長半衰期，放射性污染，成本高，耗時(shí)長Vermot J. 2000. Endocrinology.Xie HR et al. 2007. PANS35S35S (2)(2)非放射性標(biāo)記物非放射性標(biāo)記物 生物素、熒光素、地高辛素、辣根過氧化酶、生物素、熒光素、地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。堿性磷酸酶等。 特點(diǎn)：性能穩(wěn)定，操作簡便，成本低、耗時(shí)特點(diǎn)：性能穩(wěn)定，操作簡便，成本低、耗時(shí)短，標(biāo)記探針可較長時(shí)間的保存和使用短，標(biāo)記探針可較

8、長時(shí)間的保存和使用特點(diǎn)：敏感性與放射性核素標(biāo)記的探針相似特點(diǎn)：敏感性與放射性核素標(biāo)記的探針相似 較放射性標(biāo)記系統(tǒng)安全，方便、省時(shí)間較放射性標(biāo)記系統(tǒng)安全，方便、省時(shí)間 定位準(zhǔn)確，雜交背景好定位準(zhǔn)確，雜交背景好地高辛（地高辛（DigoxigeninDigoxigenin 簡寫簡寫Dig-Dig-）類固醇半抗原分子類固醇半抗原分子人及多種動物體內(nèi)不存在類似的物質(zhì)，無交人及多種動物體內(nèi)不存在類似的物質(zhì)，無交叉反應(yīng)叉反應(yīng)地高辛標(biāo)記探針的顯色檢測地高辛標(biāo)記探針的顯色檢測 常用免疫酶學(xué)顯色檢測方法有兩類常用免疫酶學(xué)顯色檢測方法有兩類：Dig-HRPDig-HRP檢測檢測系統(tǒng)系統(tǒng) 以以DAB/HDAB/H2

9、2O O2 2為底物，結(jié)果為為底物，結(jié)果為棕色；棕色； 以以4- 4-氯氯-1-1-萘酚萘酚/ H/ H2 2O O2 2為底物，結(jié)果為藍(lán)色。為底物，結(jié)果為藍(lán)色。Dig-AKPDig-AKP檢測檢測體系體系 以以BCIP/NBTBCIP/NBT為底物，結(jié)果為藍(lán)紫色沉淀為底物，結(jié)果為藍(lán)紫色沉淀。 Diao HL. 2007. Fertil & Steril地高辛地高辛在植入在植入期子宮中的定位期子宮中的定位 2. 2. 標(biāo)記標(biāo)記方法方法(1)(1)DNADNA探針標(biāo)記探針標(biāo)記 切口移位法切口移位法 DNaseDNase I I在在DNADNA雙鏈上造成單鏈切口雙鏈上造成單鏈切口DNADN

10、A聚合酶聚合酶I I的的5 53 3 核酸外切酶活性在切核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從口處將舊鏈從5 5 末端逐步切除末端逐步切除在在DNADNA聚合酶聚合酶I I的的5 53 3 聚合酶催化下，將聚合酶催化下，將dNTPdNTP連接到切口的連接到切口的3 3 末端末端-OH-OH上，合成新上，合成新的的DNADNA鏈，同時(shí)將標(biāo)記的核苷酸摻入鏈，同時(shí)將標(biāo)記的核苷酸摻入隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法隨機(jī)引物能與各種單鏈隨機(jī)引物能與各種單鏈DNADNA模板結(jié)合模板結(jié)合DNADNA聚合酶按聚合酶按5 53 3 方向合成一新的方向合成一新的DNADNA鏈。鏈。帶標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的帶標(biāo)記的核苷酸摻入到新合

11、成的DNADNA分子中分子中(2)(2)RNARNA探針標(biāo)記探針標(biāo)記在體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)中與探針制備同時(shí)完成在體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)中與探針制備同時(shí)完成(3)(3)寡核苷酸探針標(biāo)記寡核苷酸探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移法末端轉(zhuǎn)移法CCCCC C取材、切片取材、切片雜交雜交觀察、照相觀察、照相三、原位雜交技術(shù)的基本步驟三、原位雜交技術(shù)的基本步驟顯色顯色原位雜交技術(shù)的基本步驟與原理原位雜交技術(shù)的基本步驟與原理原位雜交有很多種方法，但其基本實(shí)驗(yàn)程序相近的原位雜交有很多種方法，但其基本實(shí)驗(yàn)程序相近的包括：組織和器材的特殊處理包括：組織和器材的特殊處理 取材、固定、切片取材、固定、切片 雜交前處理雜交前處理 探針的制備和預(yù)雜交探針的

12、制備和預(yù)雜交 雜交反應(yīng)雜交反應(yīng) 雜交后處理雜交后處理 檢測雜交信號，進(jìn)行結(jié)果分析檢測雜交信號，進(jìn)行結(jié)果分析（一）器材（一）器材的特殊處理的特殊處理DNADNA：穩(wěn)定性較好，一般不需特殊處理。常規(guī)的：穩(wěn)定性較好，一般不需特殊處理。常規(guī)的石蠟或冷凍切片均適用于組織或細(xì)胞內(nèi)的石蠟或冷凍切片均適用于組織或細(xì)胞內(nèi)的DNADNA原位雜交原位雜交RNARNA：RNARNA酶幾乎無處不在，而且一般的消毒方酶幾乎無處不在，而且一般的消毒方法不能將其滅活。因此，當(dāng)檢測法不能將其滅活。因此，當(dāng)檢測RNARNA或用或用RNARNA作為探針時(shí)，從標(biāo)本準(zhǔn)備到雜交結(jié)束前，都要作為探針時(shí)，從標(biāo)本準(zhǔn)備到雜交結(jié)束前，都要注意預(yù)防

13、注意預(yù)防 1. 1. 物理物理方法：方法： 對耐高溫的器具如玻璃器皿、不銹鋼對耐高溫的器具如玻璃器皿、不銹鋼器具器具作高溫烘作高溫烘烤（烤（180-200180-200干烤干烤4-64-6小時(shí)）小時(shí)） 對溶液和耐熱塑料器具作高壓蒸氣對溶液和耐熱塑料器具作高壓蒸氣消毒消毒 2. 2. 化學(xué)化學(xué)方法：方法： 焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯( DEPC ) ( DEPC ) RNARNA酶抑制劑，有毒酶抑制劑，有毒去除或抑制去除或抑制RNARNA酶方法：酶方法：(1)(1)取材取材的器具用火焰灼燒的器具用火焰灼燒過或高溫消毒過或高溫消毒(2)(2)標(biāo)本標(biāo)本盡早固定，固定劑可滅活部分盡早固定，固定劑可滅活部

14、分RNARNA酶酶(3)(3)所所用玻璃用玻璃器皿均須器皿均須DEPCDEPC水浸泡水浸泡(37 (37 ，2h)2h)，蒸餾，蒸餾水清洗后高壓消毒，水清洗后高壓消毒，然后然后180180處理處理3h3h以上以上(4)(4)塑料塑料器材最好用滅菌的一次性器材最好用滅菌的一次性用品或用品或DEPCDEPC處理處理整個(gè)操作過程帶手套和口罩。整個(gè)操作過程帶手套和口罩。( (二二) )取取 材材目的：既要目的：既要充分保留被測核酸，（特別是充分保留被測核酸，（特別是RNARNA）不）不被降解，又要盡可能維持原有組織或細(xì)胞的形態(tài)被降解，又要盡可能維持原有組織或細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)?；九c基本與免疫組織化

15、學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)相似。相似。取材過程中避免手指、唾液和未經(jīng)取材過程中避免手指、唾液和未經(jīng)RNARNA酶抑制酶抑制 處理的器具接觸處理的器具接觸標(biāo)本標(biāo)本所所使用的容器、刀具等均經(jīng)高壓消毒或清潔后使用的容器、刀具等均經(jīng)高壓消毒或清潔后用用DEPCDEPC水水清洗。清洗。為防止為防止RNARNA迅速降解，標(biāo)本離迅速降解，標(biāo)本離體切小，迅速體切小，迅速投入投入4 4 多聚甲醛溶液內(nèi)，置多聚甲醛溶液內(nèi)，置4 4冰箱冰箱內(nèi)內(nèi)2-42-4小時(shí)小時(shí)。再再將組織移入將組織移入3030蔗糖蔗糖PBSPBS溶液內(nèi)，溶液內(nèi)，4 4冰箱冰箱內(nèi)過夜內(nèi)過夜。次日次日可將標(biāo)本儲存于可將標(biāo)本儲存于-80 -80 低溫冰箱

16、內(nèi)保存。低溫冰箱內(nèi)保存。標(biāo)本標(biāo)本的儲存的儲存組織制片組織制片冷凍切片以厚冷凍切片以厚530um530um最佳最佳。4040烤箱烤箱內(nèi)內(nèi)干燥干燥2 2小時(shí)后儲存在小時(shí)后儲存在-80-80超低溫超低溫冰箱冰箱在在-20-20可保存周，在可保存周，在-70-70可保存數(shù)月之久可保存數(shù)月之久石蠟切片，一般石蠟切片，一般不提倡浸入二甲苯不提倡浸入二甲苯溶液。溶液。( (三三) )雜交雜交預(yù)處理預(yù)處理 1. 1. 切片脫蠟及切片脫蠟及水水化化 脫蠟及脫蠟及水化過程水化過程與普通石蠟切片相同與普通石蠟切片相同 要求：脫蠟要徹底，否則影響探針對組織細(xì)胞要求：脫蠟要徹底，否則影響探針對組織細(xì)胞的穿透的穿透 RN

17、ARNA雜交雜交: : 需需DEPCDEPC水替代蒸餾水稀釋酒精水替代蒸餾水稀釋酒精 切片入切片入DEPCDEPC水浸泡水浸泡 2. 2.增強(qiáng)標(biāo)本通透性與核酸探針穿透性增強(qiáng)標(biāo)本通透性與核酸探針穿透性 常用方法：蛋白酶消化、去污劑處理、酸酐常用方法：蛋白酶消化、去污劑處理、酸酐處理和稀酸洗滌等處理和稀酸洗滌等 (1)(1)蛋白酶蛋白酶K K（甘氨酸）、胃蛋白酶（甘氨酸）、胃蛋白酶（4 4多聚多聚甲醛后固定）甲醛后固定） 酶的濃度和孵育時(shí)間應(yīng)視標(biāo)本種類、固定酶的濃度和孵育時(shí)間應(yīng)視標(biāo)本種類、固定劑種類、切片厚度等而確定劑種類、切片厚度等而確定 (2) (2)去污劑處理去污劑處理 Triton X-1

18、00Triton X-100最常用最常用 注意：去污劑處理不當(dāng)，會引起靶核苷酸的丟注意：去污劑處理不當(dāng)，會引起靶核苷酸的丟失，影響標(biāo)本的形態(tài)結(jié)構(gòu)失，影響標(biāo)本的形態(tài)結(jié)構(gòu) (3)(3)酸酐處理和稀酸洗滌酸酐處理和稀酸洗滌 防止探針與標(biāo)本內(nèi)的堿性蛋白發(fā)生靜電效應(yīng)，防止探針與標(biāo)本內(nèi)的堿性蛋白發(fā)生靜電效應(yīng)，減少雜交反應(yīng)的背景色減少雜交反應(yīng)的背景色3. 3. 預(yù)雜交預(yù)雜交 雜交之前使用不含核苷酸探針的雜交液在雜交之前使用不含核苷酸探針的雜交液在雜交溫度下預(yù)先孵育切片，以達(dá)到封閉或雜交溫度下預(yù)先孵育切片，以達(dá)到封閉或阻斷與核苷酸探針產(chǎn)生非特異性雜交點(diǎn)，阻斷與核苷酸探針產(chǎn)生非特異性雜交點(diǎn)，降低背景著色的目的。

19、降低背景著色的目的。 標(biāo)記的探針與檢測標(biāo)本上的靶序列結(jié)合而形成雜標(biāo)記的探針與檢測標(biāo)本上的靶序列結(jié)合而形成雜交體的過程。交體的過程。 這是原位雜交技術(shù)的關(guān)鍵步驟。這是原位雜交技術(shù)的關(guān)鍵步驟。包括：探針的準(zhǔn)備包括：探針的準(zhǔn)備 雙鏈核酸的變性雙鏈核酸的變性 雜交反應(yīng)雜交反應(yīng)( (四四) )雜交雜交反應(yīng)反應(yīng)探針長度：探針長度：5050100100個(gè)堿個(gè)堿基最佳基最佳探針標(biāo)記物：地高辛（探針標(biāo)記物：地高辛（DIGDIG）探針濃度：探針濃度：0.50.55.0g/ml;5.0g/ml;雜交液的量要適當(dāng)，以雜交液的量要適當(dāng)，以101020l/20l/每張切片為宜每張切片為宜 1. 1. 探針探針準(zhǔn)備準(zhǔn)備理論

20、熱變性溫度：理論熱變性溫度：909095 95 甲酰胺法甲酰胺法：常規(guī)：常規(guī)的加入的加入303050%50%甲酰胺于雜交液甲酰胺于雜交液中中 每每增加增加1 1%，TmTm值降低值降低0.720.72，降至，降至37-40 37-40 為宜為宜注意注意：在每次變性后，都需要將樣品用冰迅速冷：在每次變性后，都需要將樣品用冰迅速冷卻，以保持變性后單鏈狀態(tài)。卻，以保持變性后單鏈狀態(tài)。當(dāng)靶核酸或探針為當(dāng)靶核酸或探針為DNADNA時(shí)，雜交前時(shí)，雜交前需要變性為需要變性為單鏈單鏈2. 2. 探針探針和靶核酸變性和靶核酸變性探針探針預(yù)變性的探針預(yù)變性的探針高濃度高濃度鹽類鹽類( (檸檬酸鈉檸檬酸鈉)增加雜交

21、體的增加雜交體的穩(wěn)定性穩(wěn)定性甲酰胺甲酰胺可可降低解鏈溫度降低解鏈溫度硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖對對DNADNA有濃縮作用，可提高雜交有濃縮作用，可提高雜交的反應(yīng)速度的反應(yīng)速度1010倍以上，但不影響探針的洗脫倍以上，但不影響探針的洗脫強(qiáng)度強(qiáng)度牛血清白蛋白和鮭魚精牛血清白蛋白和鮭魚精DNADNA或或RNARNA用于用于阻止阻止探針與非特異位點(diǎn)或非目標(biāo)探針與非特異位點(diǎn)或非目標(biāo)DNADNA雜交。雜交。3. 3. 雜交雜交液的組成液的組成方法方法：雜交：雜交液滴于液滴于切片上切片上，加蓋硅化的，加蓋硅化的蓋玻片。蓋玻片。雜交雜交的的溫度：在溫度：在Tm-25Tm-25左右左右，大約，大約在在30306060

22、之間之間時(shí)間：時(shí)間：16162020小時(shí)，一般小時(shí)，一般過夜。過夜。PHPH：6.56.57.5 7.5 含含50%50%甲酰胺、鹽濃度甲酰胺、鹽濃度0.75mol/L0.75mol/L左右時(shí)，雜交溫度：左右時(shí)，雜交溫度： DNA DNA探針是探針是4242 RNA RNA探針是探針是50-5550-55 寡核苷酸探針寡核苷酸探針是是37374. 4. 溫度溫度、時(shí)間和、時(shí)間和PHPH目的：盡可能洗去未雜交或非特異性吸附的探針。目的：盡可能洗去未雜交或非特異性吸附的探針。方法：系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗方法：系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。 RNA RNA探針雜交后漂洗液中的可

23、加入探針雜交后漂洗液中的可加入RNARNA酶酶原則原則：是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到：是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高高( (五五) )雜交雜交后處理后處理( (六六) )雜交體的檢測雜交體的檢測 生物素標(biāo)記的探針生物素標(biāo)記的探針 地高辛標(biāo)記的探針地高辛標(biāo)記的探針 酶標(biāo)記卵白抗生物素抗體酶標(biāo)記卵白抗生物素抗體酶標(biāo)記鏈霉抗生物素抗體連接酶標(biāo)記鏈霉抗生物素抗體連接酶標(biāo)記抗地高辛抗體酶標(biāo)記抗地高辛抗體標(biāo)記酶：標(biāo)記酶：HRPHRP、AlPAlP( (七七) )原位雜交詳細(xì)步驟原位雜交詳細(xì)步驟1 1、二甲苯、二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。脫蠟，梯度酒精水化。DEPCDEPC水洗水洗2 2次，次， DE

24、PC-PBSDEPC-PBS洗洗2 2次，次，5 5分鐘分鐘2 2、DEPC-PBSDEPC-PBS處理的處理的Triton-X100Triton-X100處理處理1515分鐘分鐘3 3、DEPC-PBSDEPC-PBS洗洗2 2次，次，5 5分鐘分鐘4 4、TETE緩沖液稀釋的蛋白酶緩沖液稀釋的蛋白酶K K（5-205-20g/mg/m l l）3737孵育孵育15152020minmin 5 5、用用0.10.1mol/Lmol/L的甘氨酸溶液的甘氨酸溶液( (在在PBSPBS中中) )清洗清洗1 1minmin終止蛋白酶終止蛋白酶K K的消化，的消化，DEPC-PBSDEPC-PBS洗洗

25、2 2次，次，5 5分鐘分鐘6 6、DEPC-PBS-DEPC-PBS-4%4%多聚甲醛后固定多聚甲醛后固定 10-15 10-15分鐘分鐘7 7、DEPC-PBSDEPC-PBS洗洗2 2次，次，5 5分鐘分鐘8 8、2 2SSCSSC洗洗5 5分鐘分鐘9 9、不含探針的雜交液中、不含探針的雜交液中3737孵育孵育2 2h h1010、2 2SSCSSC洗洗5 5分鐘分鐘1111、含探針雜交液中含探針雜交液中3737(42-55(42-55) )孵育孵育1818h h1212、1 1SSCSSC在室溫下速洗，在室溫下速洗， 1 1SSCSSC在在55 55 水水浴搖洗，浴搖洗，2 21515

26、minmin，0.5 0.5 SSCSSC在在55 55 水浴搖洗水浴搖洗2 21515minmin， 0.5 0.5 SSCSSC在室溫下洗在室溫下洗1010minmin1313、放射自顯影或酶顯、放射自顯影或酶顯目的：保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性目的：保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性標(biāo)本對照、探針對照、雜交體對照、檢測系統(tǒng)對照標(biāo)本對照、探針對照、雜交體對照、檢測系統(tǒng)對照陰性對照：排除非特異性雜交等因素造成的假陽性陰性對照：排除非特異性雜交等因素造成的假陽性陽性對照：證明雜交步驟及試劑可靠性陽性對照：證明雜交步驟及試劑可靠性對照實(shí)驗(yàn)設(shè)置愈多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性就愈大。對照實(shí)驗(yàn)設(shè)置愈多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可

27、靠性就愈大。注意：每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)有陽性對照和陰性對照注意：每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)有陽性對照和陰性對照四四. . 對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置 常用的實(shí)驗(yàn)常用的實(shí)驗(yàn)對照對照(1)(1)標(biāo)本對照：選用已知為標(biāo)本對照：選用已知為陽性或陰性的陽性或陰性的組織組織(2)(2)空白實(shí)驗(yàn)空白實(shí)驗(yàn): : 無無探針的雜交液探針的雜交液進(jìn)行雜交進(jìn)行雜交(3)(3)選用選用其他生物學(xué)方法進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)其他生物學(xué)方法進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn) 提取提取標(biāo)本標(biāo)本DNADNA和和RNARNA進(jìn)行進(jìn)行SouthernSouthern和和NorthernNorthern印記印記雜交、雜交、qPCRqPCR、RT-PCRRT-PCR等等。（4 4）RNA

28、RNA酶或酶或DNADNA酶預(yù)先處理標(biāo)本后雜交反應(yīng)酶預(yù)先處理標(biāo)本后雜交反應(yīng)（5 5）選用標(biāo)記的非特異性（載體）序列或不相關(guān)）選用標(biāo)記的非特異性（載體）序列或不相關(guān)的核酸探針進(jìn)行雜交。的核酸探針進(jìn)行雜交。（6 6）探針孵育后的檢測系統(tǒng)對照）探針孵育后的檢測系統(tǒng)對照1. 1. 標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)不佳標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)不佳 取材的標(biāo)本不新鮮，核酸有不同程度的降解取材的標(biāo)本不新鮮，核酸有不同程度的降解 雜交預(yù)處理中蛋白酶消化不當(dāng)所致雜交預(yù)處理中蛋白酶消化不當(dāng)所致 雜交溫度較高、孵育時(shí)間長易造成切片的飄浮雜交溫度較高、孵育時(shí)間長易造成切片的飄浮或脫片或脫片五五. . 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能的問題和原因?qū)嶒?yàn)結(jié)果可能的問題和原因

29、2. 2. 雜交信號弱雜交信號弱 探針鏈太長不易深入細(xì)胞探針鏈太長不易深入細(xì)胞 探針的標(biāo)記不好探針的標(biāo)記不好 靶序列暴露程度不佳靶序列暴露程度不佳 探針和（或）靶序列的變性條件欠佳探針和（或）靶序列的變性條件欠佳 3. 3. 無雜交信號無雜交信號 標(biāo)本內(nèi)無靶序列的存在標(biāo)本內(nèi)無靶序列的存在 標(biāo)本內(nèi)存在靶序列，因?qū)嶒?yàn)?zāi)硞€(gè)環(huán)節(jié)的失標(biāo)本內(nèi)存在靶序列，因?qū)嶒?yàn)?zāi)硞€(gè)環(huán)節(jié)的失誤導(dǎo)致后者可能降解誤導(dǎo)致后者可能降解4. 4. 非特異性著色非特異性著色 探針特異性探針特異性 組織細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性酶組織細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性酶 組織細(xì)胞內(nèi)的某些成分與檢測系統(tǒng)的抗體組織細(xì)胞內(nèi)的某些成分與檢測系統(tǒng)的抗體非特異性結(jié)合非特異性結(jié)合基本實(shí)驗(yàn)過程總結(jié)基本實(shí)驗(yàn)過程總結(jié)放射自顯影放射自顯影免疫細(xì)胞化學(xué)免疫細(xì)胞化學(xué)樣品制備樣品制備 切片切片探針制備、標(biāo)記探針制備、標(biāo)記 純化純化通透處理通透處理變性變性 原位雜交原位雜交 雜交體探測：雜交體探測：小結(jié)Thank you！常用試劑1 14%4%多聚甲醛（多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFAParaformaldehyde,PFA） 配法：稱取配法：稱取4040g PFAg PFA溶于裝有溶于裝有500500ml DEPCml DEPC水的玻璃容水的玻璃容器（燒杯或燒瓶）中，持續(xù)加熱磁力攪拌至器（燒杯或燒瓶）中，持續(xù)加熱磁力攪拌