菌種選育保藏與復(fù)壯

1、會(huì)計(jì)學(xué)1菌種選育保藏與復(fù)壯菌種選育保藏與復(fù)壯（二）放線菌（二）放線菌（actinomycesactinomyces）最大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于產(chǎn)生多種抗生素最大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于產(chǎn)生多種抗生素（antibioticantibiotic） 鏈霉菌（鏈霉菌（StreptomycesStreptomyces） 小單孢菌屬（小單孢菌屬（MicromonosporaMicromonospora） （三）霉菌（三）霉菌（mouldmould） 1.1.曲霉屬（曲霉屬（AspergillusAspergillus） 黑曲霉（黑曲霉（A. nigerA. niger） 米曲霉（米曲霉（A. oryzaeA. oryzae

2、） 黃曲霉（黃曲霉（A. flavusA. flavus） 2.2.青霉屬（青霉屬（PenicillumPenicillum） 桔青霉（桔青霉（P. citrinumP. citrinum）3. 3. 根霉屬（根霉屬（RhizopusRhizopus ） 米根霉（米根霉（R. oryzaeR. oryzae） 華根霉（華根霉（R. chinensisR. chinensis）4. 4. 紅曲霉屬（紅曲霉屬（MonascusMonascus）（四）酵母（四）酵母（yeastyeast）1.1.酵母屬（酵母屬（SaccharomycesSaccharomyces） 啤酒酵母（啤酒酵母（Saccha

3、romyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）2. 2. 假絲酵母屬（假絲酵母屬（CandidaCandida） 產(chǎn)朊假絲酵母（產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilisCandida utilis）3. 3. 畢赤酵母屬（畢赤酵母屬（PichiaPichia）（五）其它微生物（五）其它微生物1.1.擔(dān)子菌（擔(dān)子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）即菇類）即菇類（mushroommushroom）2. 2. 藻類（藻類（algaalga）幾幾種種菌菌落落 （六）噬菌體（六）噬菌體（phagephage） 危害以細(xì)菌和放線菌危害以

4、細(xì)菌和放線菌為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵工業(yè)。為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵工業(yè)。烈性噬菌體烈性噬菌體 引起寄主細(xì)胞迅速裂解。引起寄主細(xì)胞迅速裂解。 受感染的細(xì)菌稱受感染的細(xì)菌稱敏感性細(xì)菌敏感性細(xì)菌。溫和噬菌體溫和噬菌體 隨寄主細(xì)胞的繁殖而繁殖。隨寄主細(xì)胞的繁殖而繁殖。 含溫和噬菌體的細(xì)菌稱含溫和噬菌體的細(xì)菌稱溶原性細(xì)菌溶原性細(xì)菌。 二、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求二、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求1.1.原料廉價(jià)，生長(zhǎng)迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。原料廉價(jià)，生長(zhǎng)迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。2.2.易控制培養(yǎng)條件，發(fā)酵周期較短。易控制培養(yǎng)條件，發(fā)酵周期較短。3.3.抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)?？闺s菌和噬菌體的能力強(qiáng)。4.4.不易變異和退化，不產(chǎn)生任何

5、有害物質(zhì)和不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)和 毒素。毒素。 第二節(jié)第二節(jié) 工業(yè)微生物菌種的選育工業(yè)微生物菌種的選育一、自然選育一、自然選育 1.1.采樣采樣 2.2.增殖培養(yǎng)增殖培養(yǎng) 方法：方法： （1 1）控制培養(yǎng)基成分）控制培養(yǎng)基成分 （2 2）控制培養(yǎng)條件）控制培養(yǎng)條件 （3 3）抑制不需要的菌類）抑制不需要的菌類3. 3. 純種分離純種分離（1 1）劃線法：簡(jiǎn)單、快捷。）劃線法：簡(jiǎn)單、快捷。 （2 2）稀釋法：菌落單一均勻。）稀釋法：菌落單一均勻。是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過(guò)分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后生長(zhǎng)繁殖

6、成單菌落，通常把這種單菌落當(dāng)作待分離微生物的純種。有時(shí)這種單菌落并非都由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離目的的。接種針先以火焰滅菌法滅菌接種針先以火焰滅菌法滅菌 輕觸營(yíng)養(yǎng)平板上無(wú)菌的瓊脂處冷卻輕觸營(yíng)養(yǎng)平板上無(wú)菌的瓊脂處冷卻 以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。 更換一個(gè)新的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)平板更換一個(gè)新的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)平板 將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營(yíng)養(yǎng)平板將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營(yíng)養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū)上。此為第一菌區(qū) 。重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法重復(fù)第一步驟，將接

7、種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無(wú)菌處冷卻。滅菌，然后輕觸瓊脂無(wú)菌處冷卻。由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū)，如右上圖。區(qū)，如右上圖。重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。 重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后的營(yíng)養(yǎng)平板，如右上圖。的營(yíng)養(yǎng)平板，如右上圖。 在營(yíng)養(yǎng)平板上貼好標(biāo)在營(yíng)養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽，標(biāo)示好接種日期、操簽，標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌種學(xué)名以及作者姓名、

8、菌種學(xué)名以及培養(yǎng)基名稱。培養(yǎng)基名稱。需要使用的儀器需要使用的儀器震蕩機(jī)震蕩機(jī) 吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液吸取充分均勻后的菌液吸取充分均勻后的菌液 取含有取含有 9mL9mL無(wú)菌水之試管，將試管口過(guò)火滅菌。無(wú)菌水之試管，將試管口過(guò)火滅菌。將菌液置入，此時(shí)試管須做記號(hào)為第一次稀釋。將菌液置入，此時(shí)試管須做記號(hào)為第一次稀釋。將試管于震蕩機(jī)上，使菌液混合均勻?qū)⒃嚬苡谡鹗帣C(jī)上，使菌液混合均勻 取出試管中的第一次十倍稀釋菌液取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL1mL，加入另一個(gè)新的含加入另一個(gè)新的含9mL9mL無(wú)菌水的試管中。無(wú)菌水的試管中。重復(fù)此步驟直至所需要的稀釋濃度。重復(fù)此步驟直至

9、所需要的稀釋濃度。 從最后稀釋菌液中吸取從最后稀釋菌液中吸取 0.1mL0.1mL菌液，菌液，置入準(zhǔn)備好的無(wú)菌瓊脂內(nèi)。置入準(zhǔn)備好的無(wú)菌瓊脂內(nèi)。將三角玻璃棒浸于酒精中將三角玻璃棒浸于酒精中 將三角玻璃棒在火焰上燃燒將三角玻璃棒在火焰上燃燒（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒）（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒） 使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來(lái)，將培養(yǎng)皿置使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來(lái)，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。數(shù)推算出菌液濃度。 4. 4. 生產(chǎn)性能的測(cè)定生產(chǎn)性能的測(cè)定 一般采用兩步法：一

10、般采用兩步法： 初篩：以量為主初篩：以量為主 復(fù)篩：以質(zhì)為主復(fù)篩：以質(zhì)為主 二、誘變育種二、誘變育種 用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變。因突變。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)。誘變劑誘變劑物理：物理：紫外線紫外線，快中子，快中子化學(xué)：化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍硫酸二乙酯，亞硝基胍 誘變育種的主要環(huán)節(jié)誘變育種的主要環(huán)節(jié)（1 1）以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液）以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液 誘變誘變（2 2）用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株，）用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株， 選出性能優(yōu)良的正變異株選出性能優(yōu)良的正變異株篩選

11、篩選 第三節(jié)第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的改良生產(chǎn)菌種的改良 一、原生質(zhì)體融合（一、原生質(zhì)體融合（protoplast fusionprotoplast fusion） 1.1.標(biāo)記菌株的篩選標(biāo)記菌株的篩選 2.2.原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備 3.3.原生質(zhì)體的融合與再生原生質(zhì)體的融合與再生 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）脫水劑）脫水劑 助融劑助融劑 CaCa2+2+提高融合頻率提高融合頻率 4.4.融合子的選擇融合子的選擇原生質(zhì)體，它是細(xì)胞進(jìn)行各類原生質(zhì)體，它是細(xì)胞進(jìn)行各類代謝的主要場(chǎng)所，是細(xì)胞中重代謝的主要場(chǎng)所，是細(xì)胞中重要的部分。原生質(zhì)體可分為質(zhì)要的部分。原生質(zhì)體可分為質(zhì)膜、細(xì)胞器、膜、細(xì)胞器

12、、胞基質(zhì)胞基質(zhì)三部分三部分 二、二、DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)（DNA recombination technologyDNA recombination technology）1.1.目標(biāo)目標(biāo)DNADNA片斷的獲得片斷的獲得2.2.與載體與載體DNADNA分子的連接分子的連接3.3.重組重組DNADNA分子引入宿主細(xì)胞分子引入宿主細(xì)胞4.4.從中選出所需重組從中選出所需重組DNADNA分子的宿主細(xì)胞分子的宿主細(xì)胞 第四節(jié)第四節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯與保藏菌種的衰退、復(fù)壯與保藏一、菌種的衰退一、菌種的衰退 衰退的原因：衰退的原因：1.1.菌種保藏不當(dāng)菌種保藏不當(dāng)2.2.菌種生長(zhǎng)條件沒(méi)有得到滿足菌

13、種生長(zhǎng)條件沒(méi)有得到滿足二、二、 菌種的復(fù)壯菌種的復(fù)壯 1. 1. 純種分離純種分離 2. 2. 通過(guò)寄主體進(jìn)行復(fù)壯通過(guò)寄主體進(jìn)行復(fù)壯 3. 3. 淘汰已衰退的個(gè)體淘汰已衰退的個(gè)體三、菌種保藏三、菌種保藏 1.1.原理原理 低溫、干燥、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)低溫、干燥、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 2. 2. 方法方法 （1 1）斜面保藏法）斜面保藏法 （2 2）干燥保藏法）干燥保藏法 （3 3）懸液保藏法）懸液保藏法 （4 4）冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法 （5 5）低溫保藏法）低溫保藏法 第五節(jié)第五節(jié) 種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子的擴(kuò)大培養(yǎng)一、微生物的培養(yǎng)方法一、微生物的培養(yǎng)方法 1.1.表面培養(yǎng)表面培養(yǎng) 2.2.固體

14、培養(yǎng)固體培養(yǎng) 3.3.液體深層培養(yǎng)液體深層培養(yǎng)二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的：菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的： 為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。代謝旺盛的種子。 （一）種子制備的工藝流程（一）種子制備的工藝流程 搖瓶搖瓶保藏菌種保藏菌種 試管斜面活化試管斜面活化 茄瓶斜面茄瓶斜面 種子罐種子罐 固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基搖瓶搖瓶種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)（二）（二） 斜面菌種的培養(yǎng)斜面菌種的培養(yǎng) 1.1.不宜多次移種。不宜多次移種。 2.2.活化斜面中加活化斜面中加0.1%0.1%葡萄糖。葡萄糖。 培養(yǎng)基特點(diǎn)：原料較精細(xì)。培養(yǎng)基特點(diǎn)

15、：原料較精細(xì)。（三）一級(jí)種子培養(yǎng)（搖瓶）（三）一級(jí)種子培養(yǎng)（搖瓶）培養(yǎng)基特點(diǎn)培養(yǎng)基特點(diǎn)： 使用的原料基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。使用的原料基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。（四）二級(jí)種子培養(yǎng)（種子罐）（四）二級(jí)種子培養(yǎng)（種子罐）培養(yǎng)基的特點(diǎn)培養(yǎng)基的特點(diǎn)： 和一級(jí)種子相似，其中葡萄糖用和一級(jí)種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，水解糖代替，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。 大量地接入培養(yǎng)成熟菌種的優(yōu)點(diǎn)：大量地接入培養(yǎng)成熟菌種的優(yōu)點(diǎn)： 1.1.可以縮短生長(zhǎng)過(guò)程的延緩期，因而縮短了發(fā)酵可以縮短生長(zhǎng)過(guò)程的延緩期，因而縮短了發(fā)酵 周期，提高了設(shè)備利用率。周期，提高了設(shè)備利用率。 2.2.節(jié)約了發(fā)酵培養(yǎng)的動(dòng)力消耗。節(jié)約

16、了發(fā)酵培養(yǎng)的動(dòng)力消耗。 3.3.并有利于減少染菌機(jī)會(huì)。并有利于減少染菌機(jī)會(huì)。（四）酵母（四）酵母（yeastyeast）1.1.酵母屬（酵母屬（SaccharomycesSaccharomyces） 啤酒酵母（啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）2. 2. 假絲酵母屬（假絲酵母屬（CandidaCandida） 產(chǎn)朊假絲酵母（產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilisCandida utilis）3. 3. 畢赤酵母屬（畢赤酵母屬（PichiaPichia） （六）噬菌體（六）噬菌體（phagephage） 危害以細(xì)菌和放線菌危害以細(xì)菌和放線菌為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵工業(yè)。為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵工業(yè)。重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無(wú)菌處冷卻。滅菌，然后輕觸瓊脂無(wú)菌處冷卻。重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的重復(fù)第六以及第