細(xì)胞培養(yǎng)常用器材與試劑

1、ieig器材與試劑干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素.純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器等 具體步驟1. 水：細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水2. PBS （ 也可用于其它 BSS ,如：Hanks , D-Hanks液的配制）：主要用于免疫組化染色時(shí)組織或細(xì)胞的漂洗溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g , KCl 0.2g , Na2HPO4H2O 1.56g, KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml ,搖勻即成新配制的 PBS溶液。用HCl或NaOH

2、 調(diào)PH到7.4。移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將 PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸熠水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。3. 胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在 pH為8.0、溫度為37 C時(shí)，胰 酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、 Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS ,如：D-Hanks 液。終

3、止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為 0.25 %,用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS （D-hanks ）液中。攪拌混勻，置于 4 C內(nèi)過夜。用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20 C保存以備使用。4. 0.05 %胰蛋白酶一0.02%EDTA 溶液稱取胰蛋白酶粉末（1 : 250 ） 0.05g , EDTA 0.02g ，加入PBSA 100ml, 0.22um 微孔濾膜過濾除菌，分裝，于20 C保存。5

4、. 青、鏈霉素溶液：所用純凈水（雙蒸水）需要 15磅高壓20分鐘滅菌。 具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是 80 萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是 100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升 各為20萬單位。分裝于20 C保存。使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml o6. RPMI1640 :溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中，并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次（沖洗液一并加入培養(yǎng)基中）,充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?，并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml,使青鏈霉素的濃度最終各為10

5、0單位/ml o然后用二氧化碳或碳酸氫鈉調(diào) PH到7.2左右。最后定容至1000ml,搖勻。安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸 下支架腿分別用布包好待消毒。抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過濾。分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4C冰箱內(nèi)待用。使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4 C時(shí)兩周有效）。7. 血清的滅活：細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在 56 C水浴中滅活30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。8. HEPES 溶液：HEPES 的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（

6、 M -a-hydroxythylpiperazine-M -ethanesulfanic acid ）。對(duì)細(xì)胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為 10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含 20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：準(zhǔn)確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至 1L。0.22um 微孔濾膜過濾除菌，分裝后4C保存。注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售 HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES 的終濃度仍然為 20m mol/L 。如：稱取 4.766 克H

7、EPES 溶于20ml 三蒸水中， 過濾除菌后可完全（20ml ）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。9. 谷氨酰胺：合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)， 谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于 谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4C下放置1周可分解50 %，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20 C冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4C冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1 4mmol/L 。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用

8、時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g 溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L 的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅^濾除菌，分裝小瓶，-20 C保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。10. 肝素溶液的配制：含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml o因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為？ C。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml （精確可加入0.9ml ） 即可。11. I型膠原酶：0.1 % I型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配

9、制和消毒滅菌。注意：因?yàn)镮型膠原酶分子顆粒比胰酶大， 不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入 10ml小瓶-20 C保存。12. 明膠溶液：因?yàn)槊髂z難于過濾，所以配制0.1 %明膠溶液必須用無菌的 PBS配制。所以制備過程中必須要注意 無菌操作。首要的問題是如何無菌準(zhǔn)確稱量 0.1克（配成100ml溶液）一即解決無菌分裝藥品的問題。 其次要注意即使是 01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌操作分裝入50ml小瓶中，4 C保存13. Hanks 液：稱取 KH2PO4 0.06g, Nacl 8.0g , NaHCO3 0.35g, KCl 0.4g ,葡萄糖 1.

10、0g ,Na2HPO4.H2O 0.06g ，加 H2O 至 1000ml注：Hanks 液可以高壓滅菌。分裝于 4 C下保存。14. D-hanks 液：1 液：NaCL:8.00g/L , KCL: 0.04g/L, Na2HPO4.2H2O:0.06g/L, KH2PO4:0.06g/L,配500毫升；2 液：NaHCO3 : 0.35g/L ，配 100 毫升；3液：酚紅：0.02g ，用數(shù)滴NaHCO3 溶解酚紅將2, 3液移入1液中。定容到1000毫升PH值是7.4左右。分裝于4C下保存。15. Giemsa 染液：稱Giemsa 粉末0.5克，加幾滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的

11、甘油總量為33ml ）。56 C中保溫90120 分鐘。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此為 Giemsa 原液。 使用時(shí)按要求用 PBS稀 釋。一般稀釋10倍。器材與試劑干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素.純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器等 具體步驟1. 水：細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水2. PBS （ 也可用于其它 BSS ,如：Hanks , D-Hanks 液的配制）：主要用于免疫組化染色時(shí)組織或細(xì)胞的漂洗溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g, KCl 0.2g , Na2HPO4H2O 1.56g, KH2PO4

12、0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml ,搖勻即成新配制的 PBS溶液。用HCl或NaOH 調(diào)PH到7.4。移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將 PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸熠水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。3. 胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在 pH為8.0、溫度為37 C時(shí)，胰 酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化

13、過度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、 Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS ,如：D-Hanks 液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為 0.25 %,用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS （D-hanks ）液中。攪拌混勻，置于 4 C內(nèi)過夜。用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20 C保存以備使用。4. 0.05 %胰蛋白酶一0.02%EDTA 溶液稱取胰

14、蛋白酶粉末（1 : 250 ） 0.05g , EDTA 0.02g ，加入PBSA 100ml, 0.22um 微孔濾膜過濾除菌，分裝，于20 C保存。5. 青、鏈霉素溶液：所用純凈水（雙蒸水）需要 15磅高壓20分鐘滅菌。 具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是 80 萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是 100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升 各為20萬單位。分裝于20 C保存。使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml c6. RPMI1640 :溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中，并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次（沖洗液一并

15、加入培養(yǎng)基中）,充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?，并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml,使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml o然后用二氧化碳或碳酸氫鈉調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml,搖勻。安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸 下支架腿分別用布包好待消毒。抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過濾。分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4C冰箱內(nèi)待用。使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4 C時(shí)兩周有效）。7. 血清的滅活：細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛

16、血清，新買來的血清要在 56 C水浴中滅活30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。8. HEPES 溶液：HEPES 的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（ M -a-hydroxythylpiperazine-M -ethanesulfanic acid ）。對(duì)細(xì)胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為 10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含 20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：準(zhǔn)確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。0.22um微孔濾膜過濾除菌，分裝后4C保存。注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售 HE

17、PES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES 的終濃度仍然為 20m mol/L 。如：稱取 4.766 克HEPES 溶于20ml 三蒸水中， 過濾除菌后可完全（20ml ）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。9. 谷氨酰胺：合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)， 谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于 谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4C下放置1周可分解50 %，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20 C冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)

18、液在4C冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1 4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g 溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過濾除菌，分裝小瓶，-20 C保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。10. 肝素溶液的配制:含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml o因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于 100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為？ C。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml （精確可加入0.9ml ） 即可。11. I型膠原酶：0.1 % I型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)镮型膠原酶分子顆粒比胰酶大， 不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20 C保存。12. 明