翻譯起始因子

1、分子機(jī)制研究套路（三）翻譯起始因子課題：受體A蛋白與真核翻譯起始因子 B相互作用的分子機(jī)制及功能研究1 .概念介紹：眾所周知，蛋白質(zhì)是具有內(nèi)在結(jié)構(gòu)并能夠發(fā)揮眾多功能的一類生物大分子。蛋白質(zhì)通常由二十種氨基酸通過(guò)不同的搭配組成，每一個(gè)蛋白質(zhì)都是由一條或多條氨基酸分子形成的膚鏈組成。而多膚鏈中的氨基酸是由其對(duì)應(yīng)的信使RNA（messengerRNA,mRNA）分子中的核酸基序決定的。mRNA分子要將自身攜帶的信息轉(zhuǎn)化為不同功能的蛋白質(zhì)，就必須通過(guò)翻譯過(guò)程。整個(gè)翻譯過(guò)程分為三步：翻譯起始，翻譯延伸和翻譯終止。每一步過(guò)程都需要有許多蛋白質(zhì)的參與，其中翻譯的起始是整個(gè)過(guò)程的開(kāi)端，意義重大。翻譯起始過(guò)程可

2、被分為三步：首先，40S小亞基與翻譯起始因子結(jié)合，在翻譯起始因子的幫助下與mRNA模板結(jié)合；然后，在翻譯起始因子和 GTP的幫助下，Met-tRNA進(jìn)入小亞基， tRNA上的反密碼子與 mRNA上的起始密碼子配對(duì)；最后，由 tRNA , mRNA ,翻譯起始因 子組成的小亞基復(fù)合物與大亞基結(jié)合，伴隨著GTP的水解，并釋放出翻譯起始因子。真核翻譯起始因子（eukaryotic initiationfactor , eIF）,是指參與和幫助真核細(xì)胞翻譯起始這一過(guò)程的蛋白質(zhì)。與原核翻譯起始因子只有三種（IF1、IF2、IF3）相比，真核翻譯起始因子種類多且復(fù)雜。通過(guò)這些真核翻譯起始因子之間以及不同的

3、真核翻譯起始因子與其它細(xì)胞器或大分子（核糖體，mRNA,起始tRNA）之間的相互作用，來(lái)完成真核生物的翻譯起始。對(duì)于真 核生物來(lái)說(shuō)，其翻譯起始過(guò)程更多的依賴于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)與RNA之間的相互作用。除了參與真核翻譯起始進(jìn)程之外，大多數(shù)真核翻譯起始因子還有其他一些功能。比如參與細(xì) 胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的調(diào)控，與某些疾病的發(fā)生相關(guān)等。2 .示意圖：3 .研究思路：3.1 受體A與翻譯起始因子 B的相互作用 33.1.1 酵母雙雜交證實(shí)受體 A-ICD (intracellular domain )與翻譯起始因子 B相互作用 33.1.2 GST pull -down驗(yàn)證受體 A-ICD與翻譯起

4、始因子 B的相互作用 3一)GST-翻譯起始因子 B與HA-受體A-ICD 的相互作用 3二)GST-受體A-ICD與Myc-翻譯起始因子 B的相互作用 43.1.3 體外翻譯系統(tǒng)證實(shí)受體A-ICD與翻譯起始因子 B在體外能直接相互作用 43.1.4 免疫共沉淀(Co-IP)驗(yàn)證受體A-ICD與翻譯起始因子 B的相互作用 53.2 受體A-ICD與翻譯起始因子 B相互作用的定位 53.2.1 翻譯起始因子 B通過(guò)其N端與受體A-ICD相互作用 5GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)翻譯起始因子B通過(guò)其N端與受體 A-ICD相互作用：53.2.2 受體A-ICD通過(guò)TK結(jié)構(gòu)域與翻譯起始因子B相互作

5、用 6GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)受體 A-ICD通過(guò)TK結(jié)構(gòu)域與翻譯起始因子B相互作用： 63.3 受體A-ICD與翻譯起始因子 B在細(xì)胞內(nèi)的共定位 73.4 全長(zhǎng)受體A與翻譯起始因子 B的相互作用 73.4.1 GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)受體 A與翻譯起始因子 B能在體外結(jié)合 73.4.2 免疫共沉淀(Co-IP)驗(yàn)證受體A與翻譯起始因子 B的相互作用 83.5 受體A對(duì)5'端具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 pcDNA3.1(+)-SL-LUC 質(zhì)粒翻譯的影響 83.5.1 構(gòu)建 pcDNA3.1(+)-LUC 載體83.5.2 受體A對(duì)5'端具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 pcDNA3.1

6、(+)-SL-LUC 質(zhì)粒翻譯的影響 83.1 受體A與翻譯起始因子B的相互作用3.1.1 酵母雙雜交 證實(shí)受體A-ICD (intracellular domain)與翻譯起始因子 B相互作用受體A-ICD和翻譯起始因子B蛋白的自激活檢測(cè)：將質(zhì)粒pAS2-l-受體A-ICD與pACT2-翻譯起始因子B分別轉(zhuǎn)化酵母宿主菌 Y190 ,涂布于SD/-Trp/-His+3-AT和SD/-Leu/-His+3-AT 固體培養(yǎng)基上，7天后，未見(jiàn)有克隆生長(zhǎng)。結(jié)果表 明兩種載體表達(dá)的融合蛋白都不能自主激活報(bào)告基因。受體A-ICD與翻譯起始因子B在酵母體系中相互作用的驗(yàn)證：利用氯化未里轉(zhuǎn)化方法，將PAS2-

7、1-受體A-ICD與pACT2-翻譯起始因子B兩種載體同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母宿主菌 Y190,涂布于SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)固體培養(yǎng)基上，7天后有陽(yáng)性克隆出現(xiàn)，直徑大于 2 mm,呈白色，苗壯生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)接到新鮮的SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25 mM)固體培養(yǎng)基上，生長(zhǎng) 3-4天后，檢測(cè)3 -半乳糖甘酶活性。結(jié)果表明共轉(zhuǎn)PAS2-1-受體A-ICD和pACT2-翻譯起始因子B質(zhì)粒的酵母菌株以及陽(yáng)性對(duì)照菌株的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(酵母裂解產(chǎn)物變藍(lán))，對(duì)照組結(jié)果均為陰性，表明在 酵母體內(nèi)受體 A-ICD與翻譯起始因子B能夠相互 作用。3.1.2 GST pull -

8、down 驗(yàn)證受體A-ICD與翻譯起始因子 B的相互作用一)GST-翻譯起始因子 B與HA-受體A-ICD的相互作用重組蛋白GST-翻譯起始因子B在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化：將重組質(zhì)粒pGEX-6P-l-翻譯起始因子 B及空載體pGEX-6P-l各自轉(zhuǎn)化菌株 BL21 ,0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)16 h后，超聲破碎菌體，將誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的蛋白樣品以及經(jīng)GlutathioneSepharose 4B介質(zhì)純化的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色。含有重組質(zhì)粒pGEX-6P-l-翻譯起始因子 B的宿主菌經(jīng)超聲破碎的裂解液上清在 kDa位置略上處出現(xiàn) 誘導(dǎo)表達(dá)帶，與預(yù)期分

9、子量基本一致， 并且經(jīng)Glutathione Sepharose 4B介質(zhì)純化后，可得到 高純度的融合蛋白GST-翻譯起始因子B;而含pGEX-6P-l空載體的宿主菌裂解液上清中僅 出現(xiàn)一條約26 kDa的誘導(dǎo)表達(dá)條帶，經(jīng) Glutathione Sepharose 4B介質(zhì)純化后，也可得到高 純度的GST蛋白。GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí) 受體A-ICD與翻譯起始因子 B能在體外結(jié)合：使用IPTG誘導(dǎo)含有空載體 PGEX-6P-1或重組質(zhì)粒pGEX-6P-l-翻譯起始因子 B的大腸桿菌 BL21 ,表達(dá)GST蛋白和融合蛋白GST-翻譯起始因子 B,利用 Glutathione Seph

10、arose 4B親 和層析柱純化 GST和GST-翻譯起始因子 Bo將重組質(zhì)粒 pCMV-HA-受體AICD瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞，收集并裂解細(xì)胞，獲得含有 融合蛋白HA-受體AICD的細(xì)胞總蛋白。將經(jīng)過(guò)預(yù)清除的細(xì)胞總蛋白與結(jié)合有GST或GST-翻譯起始因子B蛋白的GlutathioneSepharose 4B于4°C溫育過(guò)夜。樣品處理后，進(jìn)彳f SDS-PAGE,而后進(jìn)行 Western Blot分析。 以anti-HA單抗卞測(cè)HA-受體A-ICD ,以考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化的GST和GST-翻譯起始因子B,上樣量為pull-down實(shí)驗(yàn)蛋白用量的 1/20。結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化的

11、GST-翻譯起始因子 B 泳道中有一條分子量為kDa左右的特異性條帶，其大小與HEK293T細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到的HA-受體A-ICD 一致，而在GST泳道中則無(wú)任何條帶，該結(jié)果表明純化的 GST-翻譯起始因子B能結(jié)合HA-受體A-ICD ,而純化的GST則不能結(jié)合HA-受體A-ICD ,由此表明受體 A-ICD與翻譯起始因子B在體外能進(jìn)行特異性結(jié)合。二）GST-受體A-ICD與Myc-翻譯起始因子 B的相互作用重組蛋白GST-受體A-ICD的誘導(dǎo)表達(dá)及純化GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí) 受體A-ICD與翻譯起始因子 B能在體外結(jié)合注釋：具體操作步驟同一），目的是為了雙向驗(yàn)證 2個(gè)蛋白可發(fā)生

12、相互作用。3.1.3 體外翻譯系統(tǒng) 證實(shí)受體A-ICD與翻譯起始因子B在體外能直接相互作用 使用 體外翻譯系統(tǒng) TNT Quick Coupled Transcription /Translation Systems 表達(dá) His-受體 A-ICD ;在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)GST和GST-翻譯起始因子 B,而后將結(jié)合有 GST或GST-翻譯起始因子B蛋白的Glutathione Sepharose 4B與His-受體A-ICD共同溫育。細(xì)胞裂解液洗滌 3 次后，加入2XSDS上樣緩沖液，沸水中加熱 5min,離心收集上清。進(jìn)行 SDS-PAGE,將蛋 白轉(zhuǎn)印到銷酸纖維素膜上進(jìn)行Western B

13、lot分析。以anti-受體A檢測(cè)His-受體A-ICD ,以考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化的GST和GST-翻譯起始因子 B,上樣量為pull-down實(shí)驗(yàn)蛋白用量的1/20。結(jié)果顯示：純化的GST-翻譯起始因子 B能結(jié)合His-受體A-ICD ,而純化的GST不 能結(jié)合His-受體A-ICD，由此表明受體A-ICD與翻譯起始因子B在體外能直接特異性結(jié)合。3.1.4 免疫共沉淀（Co-IP）驗(yàn)證受體A-ICD與翻譯起始因子 B的相互作用 為研究受體 A-ICD 與翻譯起始因子B在體內(nèi)的相互作，將 pCMV-HA-受體 A-ICD 和pCMV-Myc-翻譯起始因子 B共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，作為實(shí)驗(yàn)

14、組；同時(shí)將 pCMV-HA-受體 A-ICD和pCMV-Myc轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染 24 h后收獲細(xì)胞。將裂解后的 細(xì)胞總蛋白中加入 anti-c-Myc溫育后，protein G捕獲免疫復(fù)合物。SDS-PAGE電泳后，將蛋 白轉(zhuǎn)印到銷酸纖維素膜上進(jìn)行Western Blot分析。anti-HA雜交后，可以檢測(cè)到受體A-ICD的存在，而對(duì)照組則檢測(cè)不到。 反之，將裂解后的細(xì)胞總蛋白中加入anti-HA溫育，anti-c-Myc雜交同樣也可以檢測(cè)到 翻譯起始因子 B,而對(duì)照組則檢測(cè)不到。兩個(gè)方向的免疫共沉淀結(jié)果表明，在細(xì)胞內(nèi) 受體A-ICD與翻譯起始因子B可以相互作用。3.2

15、受體A-ICD與翻譯起始因子B相互作用的定位3.2.1 翻譯起始因子B通過(guò)其N端與受體A-ICD相互作用GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)翻譯起始因子 B通過(guò)其N端與受體A-ICD相互作用：表達(dá)GST蛋白、GST-翻譯起始因子B-NTD （ N端截短體）和翻譯起始因子 B-CTD （C端 截短體），利用 Glutathione Sepharose 4B親和層析柱純化 GST、GST-翻譯起始因子 B-NTD和GST-翻譯起始因子 B-CTD。將重組質(zhì)粒pCMV-HA-受體A-ICD瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,收集并裂解細(xì)胞，獲得含有融合蛋白HA-受體A-ICD的細(xì)胞總蛋白。將經(jīng)過(guò)預(yù)清除的細(xì)胞總

16、蛋白與結(jié)合有GST、GST-翻譯起始因子 B-NTD或GST-翻譯起始因子B-CTD蛋白的Glutathione Sepharose 4B于4°C溫育過(guò)夜，樣品處理后，進(jìn)彳W Western Blot 分析。以anti-HA單抗檢測(cè)HA-受體A-ICD ,以考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化的GST和GST-翻譯起始因子B-NTD或GST-翻譯起始因子 B-CTD ,上樣量為pull-down實(shí)驗(yàn)蛋白用量的1/20。 結(jié)果顯示只有 純化的GST-翻譯起始因子 B-NTD泳道中有一條分子量與HEK293T細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到的HA-受體A-ICD 一致的條帶，而在 GST和GST-翻譯起始因子 B-

17、CTD泳道中 則無(wú)任何條帶，所以該結(jié)果表明純化的GST-翻譯起始因子 B-NTD能結(jié)合HA-受體AICD ,而純化的GST和GST-翻譯起始因子 B-CTD則不能結(jié)合 HA-受體AICD ,由此表明翻譯起 始因子B通過(guò)其N端與受體A-ICD相互作用。3.2.2 受體A-ICD通過(guò)TK結(jié)構(gòu)域與翻譯起始因子 B相互作用GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)受體A-ICD通過(guò)TK結(jié)構(gòu)域與翻譯起始因子 B相互作用：大量表達(dá) GST、GST-JM、GST-ATP、GST-TK,利用 Glutathione Sepharose 4B 親和層析柱 進(jìn)行純化。將重組質(zhì)粒 pCMV-Myc-翻譯起始因子B瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H

18、EIC293T細(xì)胞，收集并裂解 細(xì)胞，獲得含有融合蛋白HA-受體A-ICD的細(xì)胞總蛋白。將經(jīng)過(guò)預(yù)清除的細(xì)胞總蛋白與結(jié)合有 GST、GST-JM、GST-ATP、GST-TK 蛋白的 Glutathione Sepharose 4B 于 4 C 溫育過(guò)夜， 樣品處理后，進(jìn)彳W Western Blot分析。以anti-c-Myc檢測(cè)Myc-翻譯起始因子 B,以考馬斯亮 藍(lán)染色檢測(cè)純化的 GST、GST-JM、GST-ATP、GST-TK ,上樣量為 pull-down實(shí)驗(yàn)蛋白用量 的1/20。結(jié)果顯示僅純化的 GST-TK泳道中有一條分子量與 HEK293T細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到 的Myc-翻譯起始

19、因子 B一致的條帶，而在 GST泳道、GST-JM泳道、GST-ATP泳道中，則 無(wú)任何條帶，所以該結(jié)果表明純化的 GST-TK能結(jié)合Myc-翻譯起始因子 B,而純化的GST、GST-JM、GST-ATP則不能結(jié)合 Myc-翻譯起始因子 B,由此表明受體 A-ICD通過(guò)TK結(jié)構(gòu)域 與翻譯起始因子 B相互作用。注釋：A-ICD 表達(dá)A的434-790氨基酸；JM 表達(dá)A的434-509氨基酸；ATP表達(dá)A的 434-538氨基酸；TK表達(dá)A的510-790氨基酸。3.3 受體A-ICD與翻譯起始因子B在細(xì)胞內(nèi)的共定位為了證實(shí)受體A-ICD與翻譯起始因子B在細(xì)胞內(nèi)能否共定位，構(gòu)建以下兩個(gè)真核表達(dá)載

20、體：pECFP-N1-受體 A-ICD 和pEYFP-N1-翻譯起始因子B。將 pECFP-N1-受體 A-ICD 和pEYFP-N1-翻譯起始因子 B共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，激光共聚焦顯微鏡下觀 察。受體A-ICD-CFP呈青色，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；翻譯起始因子B-YFP呈黃色，也在細(xì)胞質(zhì) 中表達(dá)，兩者在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)疊加呈綠色。說(shuō)明受體A-ICD與翻譯起始因子 B能在細(xì)胞中共定位。3.4 全長(zhǎng)受體A與翻譯起始因子B的相互作用3.4.1 GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí) 受體A與翻譯起始因子 B能在體外結(jié)合使用IPTG誘導(dǎo)含有空載體 PGEX-6P-1或重組質(zhì)粒pGEX-6P-l

21、-翻譯起始因子 B的大腸桿菌 BL21 ,表達(dá)GST蛋白和融合蛋白 GST-翻譯起始因子 B ,利用Glutathione Sepharose 4B親和 層析柱純化 GST和GST-翻譯起始因子 B。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-受體A轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，收集并裂解細(xì)胞，獲得含有 受體A的細(xì)胞總蛋白。將經(jīng)過(guò)預(yù)清除的細(xì)胞總蛋白與結(jié)合有 GST或GST-翻譯起始因子B蛋白的 GlutathioneSepharose4B于4°C溫育過(guò)夜。樣品處理后，進(jìn)行 SDS-PAGE,而后進(jìn)行 Western Blot分析。以anti-受體A抗體檢測(cè)受體A,以考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化的 GST

22、和GST-翻譯 起始因子B,上樣量為 GST pull-down實(shí)驗(yàn)蛋白用量的1/20。結(jié)果表明純化的 GST-翻譯起 始因子B泳道中有一條分子量與 HEK293T細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到的受體A一致的條帶，而在 GST泳道中則無(wú)任何條帶，所以該結(jié)果表明純化的GST-翻譯起始因子 B能結(jié)合受體A,而純化的GST 則不能結(jié)合受體A,由此表明受體A與翻譯起始因子B在體外能進(jìn)行特異性結(jié)合。3.4.2 免疫共沉淀(Co-IP)驗(yàn)證受體A與翻譯起始因子B的相互作用將pcDNA3.1(+)-受體A和pCMV-Myc-翻譯起始因子 B共轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞，作為實(shí)驗(yàn)組；同時(shí)將pcDNA3.1(+)和pCMV-Myc-翻譯起始因子 B轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染24 h后收獲細(xì)胞。將裂解后的細(xì)胞總蛋白中加入anti-c-Myc溫育后，protein A捕獲免疫復(fù)合物。SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)印到確酸纖維素膜上進(jìn)行Western Blot分析。anti-c-Myc雜