生化技術(shù)思考題

1、生化技術(shù)思考題1. *生物大分子制備的主要特點？與化學產(chǎn)品的分離相比較：1) 蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，分子差異大導致分離、純化和鑒定有難度和特殊性；核酸較之要簡單。2) 通常以復(fù)合物的形式存在，提取分離困難。3) 許多生物大分子離開了生物體環(huán)境就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，是生物大分子提取制備最困難之處。4) 許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。5) 生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物，方法的通用性較差。2. 影響抽提的主要因素有哪些？1) PH（堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性物質(zhì)）；2) 溶劑的極性和離子強度（極

2、性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑）；3) 水解酶（組織細胞破壞后均會釋放水解酶降解生物大分子，故需加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的PH等方法使水解酶失去活性）；4) 溫度（溫度升高，溶解度加大）；5) 攪拌（采用溫和的攪拌促使提取物的溶解）；6) 氧化（一般在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止蛋白質(zhì)中的巰基氧化）；7) 金屬離子；8) 抽提液與抽提物的比例（一般以5:1為宜）。3. *分離純化方法主要有哪幾類？1) 以分子大小和形態(tài)的差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等。2) 以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結(jié)晶等。3) 以電

3、荷差異為依據(jù)的方法：電泳、電滲析、等電點沉淀、吸附層析和離子交換層析等。4) 以生物學功能專一性為依據(jù)的方法：親和層析等。（1）沉淀法：鹽析，有機溶劑沉淀，選擇性沉淀；（2）層析技術(shù)：吸附層析，疏水層析，離子交換層析，親和層析，聚焦層析，凝膠層析；（3）快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳；（4）離心。4. 早期分離純化的特點和要求？1) 特點：a) 粗提取液中物質(zhì)成份十分復(fù)雜b) 欲制備的生物大分子濃度很稀c) 物理化學性質(zhì)相近的物質(zhì)很多d) 希望能除去大部分與目的產(chǎn)物物理化學性質(zhì)差異大的雜質(zhì)2) 要求：a) 要快速、粗放b) 能較大地縮小體積c) 分辨力不必太高d) 負荷能力要大5. *

4、鹽析法的優(yōu)點？鹽析的影響因素？1) 優(yōu)點：a) 成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。b) 操作簡單、安全。c) 對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。2) 影響因素（主要與鹽析常數(shù)Ks有關(guān)）：a) 蛋白質(zhì)的種類:蛋白質(zhì)的種類不同，Ks值會有所不同；分子量越大，沉淀所需鹽的量越少； 蛋白質(zhì)分子不對稱性越大，越容易沉淀。b) 蛋白質(zhì)的初始濃度:0.2%到2%較適宜。c) 無機鹽種類:陰離子鹽析作用順序：檸檬酸鹽>PO43>SO42>CH3COO>Cl>NO3>SCN陽離子鹽析作用順序（一價）：NH4+>K+>Nad) 溫度:（0到4）在高離子強度溶液中，升高溫度

5、有利于蛋白質(zhì)的失水，使之溶解度下降。在低離子強度溶液或純水中，蛋白質(zhì)的溶解度在一定溫度范圍內(nèi)一般隨溫度升高而增大。e) pH值:在接近蛋白質(zhì)等電點（PI）的溶液中進行鹽析有利于蛋白質(zhì)的沉淀。需要注意在高鹽溶液中蛋白質(zhì)的等電點會發(fā)生偏移。6. 影響帶點顆粒在電場中泳動速度的因子有哪些？（1）顆粒的理化性質(zhì)：電荷、直徑、形狀等；（2）電場強度：電場強度越大，帶點顆粒的泳動速度越快；（3）溶液性質(zhì)：PH、離子強度、溶液粘度等；（4）電滲；（5）焦耳熱；（6）篩孔：篩孔越大，泳動速度越快；7. 為什么不連續(xù)系統(tǒng)或連續(xù)系統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳分辨率高？瓊脂糖凝膠孔徑大，僅對少數(shù)蛋白質(zhì)有篩分效

6、應(yīng)；而不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，且孔徑大小可以調(diào)節(jié)。8. 配15%聚丙烯酰胺凝膠溶液10ml，問需要丙烯酰胺和雙丙烯酰胺各多少克？a：b=19:1，所以單體為1.425g，雙體為0.075g。9. 哪些因子影響聚丙烯酰胺凝膠的化學聚合速度？預(yù)電泳的目的是什么？預(yù)電泳時應(yīng)注意哪些因素？ 聚合影響因素：1.大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長的增加。在進行化學聚合前，在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。2.低溫會減慢聚合反應(yīng)速度。3.有些材料如聚丙烯酸甲酯有機玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應(yīng)。預(yù)電泳目的：除AP、未聚合丙烯酰胺、雜質(zhì)。（除AP以免它使某些欠穩(wěn)

7、定的樣品失活或產(chǎn)生意外的影響；另外，除去未聚合的丙烯酸以及能吸收紫外光的雜質(zhì)為確保電泳參數(shù)的恒定）注意事項：1.上下電極槽中均加入分離膠緩沖液，預(yù)電泳的電流為3mA/管，時間需30分鐘2小時。2.預(yù)電泳不能在制好濃縮膠后進行 3.不能用電極緩沖液進行，不然會破壞不連續(xù)系統(tǒng)，而使?jié)饪s效應(yīng)失效。10. 簡述瓊脂糖凝膠電泳、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、電聚焦、 SDS-PAGE的一般原理及方法。（1） 瓊脂糖凝膠電泳原理：借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，核酸片段因其分子量或分子形狀不同，電泳移動速度有差異而分離。方法：1.適合的電泳緩沖液；2.制備瓊脂糖凝膠；3.加樣；4.電泳的合適電壓和溫度

8、； 5.染色；6.凝膠成像.（二）不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）： 原理：（1）聚丙烯酰胺凝膠合成：1. 丙烯酰胺和雙丙烯酰胺含量的確定2. 丙烯酰胺的聚合 （2）分離效應(yīng)：濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng) 方法 擺好玻璃管 制備分離膠 預(yù)電泳：除AP、未聚合丙烯酰胺、雜質(zhì) 制備濃縮膠 加樣：濃縮膠緩沖液+樣本+蔗糖/甘油+指示劑 電泳：先低電流，樣品進膠后，調(diào)至所需電流 取膠 固定和譜帶檢測 遷移率測定 譜帶保存（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)原理：SDS是陰離子表面活性劑，能斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合形成SDS-蛋白復(fù)合物，

9、蛋白質(zhì)分子即帶大量的負電荷，并遠遠超過原來所帶的電荷，使天然蛋白質(zhì)分子之間的電荷差別降低，甚至可以忽略。因此，排除了蛋白質(zhì)的電荷和結(jié)構(gòu)差異，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時的泳動差異就由蛋白質(zhì)的分子量所決定。方法 凝膠的制備：用0.1% SDS-0.1mol/L磷酸鈉緩沖液配置 樣品制備：樣品溶于2% SDS- 0.1%巰基乙醇-0.01mol/L磷酸鈉緩沖液 電泳條件：電極液（0.1% SDS-0.1mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2） 固定與染色：考馬斯亮藍（四）電聚焦：原理：利用各種蛋白質(zhì)pI不同，以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體，兩性電解質(zhì)載體在電場作用下，按各自p

10、I形成從陽極到陰極逐漸增加的連續(xù)pH梯度。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其pI有差異，電泳時分別聚焦于支持物上pH等于各自pI的區(qū)域。方法：a.凝膠配制（不考慮分子篩效應(yīng)，同時加入一定PH范圍的載體兩性電解質(zhì)）；b加樣；c聚焦（陽極液酸性；陰極液堿性）；d固定與染色；e樣品PH的測定；f蛋白質(zhì)的洗脫、定量；gpI的測定。11. 幾種常見的蛋白電泳。常見的核酸電泳。蛋白質(zhì)電泳：1.聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）； 2SDS-PAGE：常用于蛋白質(zhì)分子量的測定； 3.等電聚焦電泳（IEF）：通過蛋白質(zhì)PI差異分離； 4.雙向電泳：蛋白質(zhì)組學研究的重要技術(shù)。核酸電泳：1.瓊脂糖凝膠電泳； 2.PAGE（分離只

11、有幾個bp差別的核酸）12. 轉(zhuǎn)移電泳有哪幾類?各有何用途？1.Southern blot 檢測DNA片段2.Northern blot 檢測RNA片段3.Western blot 蛋白質(zhì)印跡4.Eastern bolt 雙向蛋白質(zhì)印跡法13. 層析的分類？1) 根據(jù)固定相“床”的形式分類，層析可以分為柱層析、薄層層析、紙層析和薄膜層析。紙層析是指以濾紙作為基質(zhì)，點樣后用流動相展開，使各組分分離。薄層層析是將適當粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點樣后用流動相展開，使各組分分離。柱層析則是指將固定相填裝在管中形成柱形，在柱中進行層析。薄膜層析是將適當?shù)母叻肿佑袡C吸附劑制成薄膜，以類似紙層析的方法進

12、行物質(zhì)的分離。2) 根據(jù)流動相的形式分類，層析可以分為液相層析和氣相層析。氣相層析是指流動相為氣體的層析，而液相層析指流動相為液體的層析。3) 根據(jù)分離的原理不同分類，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。吸附層析是以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離目的的一種層析技術(shù)。分配層析是根據(jù)在一個有兩相同時存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達到分離目的的一種層析技術(shù)。凝膠過濾層析是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進行分離的一種層析技術(shù)。離子交換層析是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進行分離的一

13、種層析技術(shù)。親和層析是根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力(如酶和抑制劑、抗體和抗原、激素和受體等)，將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進行分離的一種層析技術(shù)。親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術(shù)，具有很高分辨率。14. 凝膠層析中分離系數(shù)與洗脫體積及分子的關(guān)系？對某物質(zhì)在凝膠柱內(nèi)洗脫體積Ve、Vo和Vi之間的關(guān)系可用下式表示： VeVoKd*Vi 可改寫為： （Ve-Vo） Kd = Vi當Kd0時，Ve=Vo，說明這種溶質(zhì)相對分子質(zhì)量大，完全不能進入凝膠顆粒微孔內(nèi)，被排阻于凝膠顆粒之外而最先洗脫下來；當Kd1時，即Ve小分子 VoVi= Vt ，說

14、明這種溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量小，完全向凝膠顆粒內(nèi)擴散，在洗脫過程中將最后流出柱外。當0Kdl時，意味著溶質(zhì)分子只有部分向凝膠顆粒內(nèi)擴散，Kd愈大，進入凝膠顆粒內(nèi)的程度愈大,分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。15. 不同原理層析中K值代表的含義？v 吸附層析中K值表示吸附平衡常數(shù)v 分配層析中K值表示分配系數(shù)v 離子交換層析中K表示交換常數(shù)v 親和層析中K表示親和常數(shù)16. K 值與那些因素有關(guān)，其大小代表的含義？ 被分離物質(zhì)本身的性質(zhì) 固定相和流動相的性質(zhì) 層析柱的溫度。v K值大表示其溶質(zhì)在固定相中濃度大，在洗脫過程中溶質(zhì)出現(xiàn)較晚v K值小表示某溶質(zhì)在流動相中濃度大，故在洗

15、脫液中出現(xiàn)較早v 有相似的K值，則表明兩組分層析峰會發(fā)生重疊，分離效果差17. 概述哪些因素影響離子交換劑的工作交換容量，為什么？工作交換容量，表示樹脂在某一定條件下的離子交換能力，它與樹脂種類和總交換容量，以及具體工作條件如溶液的組成、流速、溫度等因素有關(guān)。18. *影響凝膠過濾分離效果的有哪些因素，為什么？凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。影響凝膠過濾分離效果的因素：樣品體積和柱體積之間的比值、流速、柱子直徑、顆粒大

16、小及分布、裝柱密度、顆粒的孔洞以及流動相的粘性。（1）層析柱的選擇：層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對分辨率的要求來進行選擇。一般來講，主要是層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。（2）凝膠柱的鑒定：凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果,凝膠柱填裝后用肉眼觀察應(yīng)均勻、無紋路、無氣泡.（3）洗脫液的選擇：在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用，一般不依賴于流動相性質(zhì)和組成的改變來提高分辨率.凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴格,為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。（4）加樣量：要盡量快速

17、、均勻.加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實驗效率低。（5）洗脫速度：一般洗脫速度要恒定而且合適,洗脫速度過慢會造成樣品擴散加劇、區(qū)帶變寬，反而會降低分辨率，而且實驗時間會大大延長.提高分辨率的選擇應(yīng)主要包括：選擇包括各個待分離組分但分離范圍盡量小一些的凝膠，選擇顆粒小的凝膠，選擇分辨率高的凝膠類型，選擇較長、直徑較大的層析柱、減少加樣量、降低洗脫速度等等。19. *離子交換劑有哪幾部分組成？何謂陽離子和陰離子交換劑？離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團（或功能基團）和反離子構(gòu)成。將離子交換劑按活性基團分，可分為陽離子交換劑(cation exchang

18、e)（含酸性基團，具有陽離子交換功能）和陰離子交換劑(anion exchange)（含堿性基團，具有陰離子交換功能）。各類交換劑根據(jù)其解離性大小，具體又可以分為： 強、中、弱陽和強、中、弱陰。20. 實用的離子交換劑應(yīng)足那些要求？（1）有高度的不溶性，在各種溶劑中進行交換時，不發(fā)生溶解；（2）有疏松的多孔結(jié)構(gòu)或巨大的表面積，使交換離子能在交換劑中進行自由擴散和交換；（3）有較多的交換基團；（4）有穩(wěn)定的物理化學性質(zhì)，在使用過程中，不因物理或化學因子的變化而發(fā)生分解或變形等現(xiàn)象。1 空氣：空氣的影響主要是潮解、微生物污染和自動氧化。空氣中微生物的污染可使樣品腐敗變質(zhì)，樣品吸濕后會引起潮解變性，

19、同時也為微生物污染提供了有利的條件。某些樣品與空氣中的氧接觸會自發(fā)引起游離基鏈式反應(yīng)，還原性強的樣品易氧化變質(zhì)和失活，如維生素C、巰基酶等。溫度：每種生物大分子都有其穩(wěn)定的溫度范圍，溫度升高10，氧化反應(yīng)約加快數(shù)倍，酶促反應(yīng)增加13倍。因此通常絕大多數(shù)樣品都是低溫保存，以抑制氧化、水解等化學反應(yīng)和微生物的生成。水份：包括樣品本身所帶的水份和由空氣中吸收的水份。水可以參加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、離解和霉變。光線：某些生物大分子可以吸收一定波長的光，使分子活化不利于樣品保存，尤其日光中的紫外線能量大，對生物大分子制品影響最大，樣品受光催化的反應(yīng)有變色、氧化和分解等，通稱光化作用。因

20、此樣品通常都要避光保存。樣品的pH：保存液態(tài)樣品時注意其穩(wěn)定的pH范圍，通?？蓮奈墨I和手冊中查得或做實驗求得，因此正確選擇保存液態(tài)樣品的緩沖劑的種類和濃度就十分重要。時間：生化和分子生物學樣品不可能永久存活，不同的樣品有其不同的有效期，因此，保存的樣品必須寫明日期，定期檢查和處理。層析；根據(jù)待分離混合物中各組分理化性質(zhì)的差異，使各組分以不同程度分布在固定相和流動相中，由于各組分在流動相中的遷移速度不同，從而得到有效分離的一類物理分離方法分配系數(shù)；在一定條件下（如溫度、壓力）某種組分在固定相和流動相中含量的比值，分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)，常用K表示遷移率；在一定條件下，在相同的時間

21、內(nèi)某一組分在固定相中移動的距離與流動相本身移動距離的比值，常用Rf表示。親和層析；親和層析是一種吸附層析，抗原（或抗體）和相應(yīng)的抗體（或抗原）發(fā)生特異性結(jié)合，而這種結(jié)合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原（或抗體）固相化后，就可以使存在液相中的相應(yīng)抗體（或抗原）選擇性地結(jié)合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開，達到分離提純的目的內(nèi)水體積；凝膠顆粒中空穴的體積，凝膠層析中固定相的體積。柱床體積；凝膠柱所能容納的總體積排阻極限；不能進入凝膠顆?？昭▋?nèi)部的最小分子量交換容量；指離子交換劑與溶液中離子或離子化合物進行交換的能力。交換容量是表征樹脂交換能力的重要參數(shù)，其表示方法有質(zhì)量交換容量（mm

22、ol/g干樹脂）和體積交換容量（mmolmL樹脂）交聯(lián)度; 表示離子交換樹脂中交聯(lián)劑的含量。交聯(lián)度越大，凝膠的網(wǎng)結(jié)構(gòu)越緊密，吸水后膨脹越小，能分離的分子量越小，反之交聯(lián)度越小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)愈疏松，吸水后膨脹越大1、 層析的分類？根據(jù)固定相“床”的形式分類，層析可以分為柱層析、薄層層析、紙層析和薄膜層析。紙層析是指以濾紙作為基質(zhì)，點樣后用流動相展開，使各組分分離。薄層層析是將適當粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點樣后用流動相展開，使各組分分離。柱層析則是指將固定相填裝在管中形成柱形，在柱中進行層析。薄膜層析是將適當?shù)母叻肿佑袡C吸附劑制成薄膜，以類似紙層析的方法進行物質(zhì)的分離。根據(jù)流動相的形式

23、分類，層析可以分為液相層析和氣相層析。氣相層析是指流動相為氣體的層析，而液相層析指流動相為液體的層析。根據(jù)分離的原理不同分類，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。吸附層析是以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離目的的一種層析技術(shù)。分配層析是根據(jù)在一個有兩相同時存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達到分離目的的一種層析技術(shù)。凝膠過濾層析是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進行分離的一種層析技術(shù)。離子交換層析是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進行分離的一種層析技術(shù)。親和層析是根據(jù)生物大分子和配體

24、之間的特異性親和力(如酶和抑制劑、抗體和抗原、激素和受體等)，將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進行分離的一種層析技術(shù)。親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術(shù)，具有很高分辨率。2、 影響凝膠過濾分離效果的有哪些因素，為什么？凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。影響凝膠過濾分離效果的因素：樣品體積和柱體積之間的比值、流速、柱子直徑、顆粒大小及分布、裝柱密度、顆粒的孔洞以及流動相的粘性。（1）層析柱的選擇：層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對分辨率的要求來進行選擇。一般來講，主要是層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。（2）凝膠柱的鑒定：凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果,凝膠柱填裝后用肉眼觀察應(yīng)均勻、無紋路、無氣泡.（3）洗脫液的選擇：在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用，一般不依賴于流動相性質(zhì)和組成的改變來提高分辨率.凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴格,為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定