分子生物學(xué)技術(shù)原理應(yīng)用復(fù)習(xí)

1、分子生物學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用分子生物學(xué)：通過研究生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)）的結(jié)構(gòu)、功能和生物合成等方面來闡明各種生命現(xiàn)象的的本質(zhì)。*系統(tǒng)生物學(xué)：研究生物系統(tǒng)組成成分的構(gòu)成與相互關(guān)系的結(jié)構(gòu)、動態(tài)與發(fā)生，以系統(tǒng)論和實驗、計算方法整合研究為特征的生物學(xué)。*基因組學(xué)：是研究生物基因組的組成，組內(nèi)各基因的精確結(jié)構(gòu)、相互關(guān)系及表達(dá)調(diào)控的科學(xué)。*蛋白質(zhì)組學(xué)：指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動規(guī)律。*示蹤分子：用于標(biāo)記DNA或者蛋白質(zhì)的，使之可遺傳并被檢測出得物質(zhì)，

2、有放射性和非放射性*綠色熒光蛋白（GFP）：這種蛋白質(zhì)最早是在水母中發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量為26kDa，由238個氨基酸構(gòu)成，第6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團(tuán)，是主要發(fā)光的位置。在藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出綠色熒光，是常用的報道基因。*限制性內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列（一般具有雙重對稱的回文結(jié)構(gòu)），并以內(nèi)切的方式水解雙鏈DNA的核酸水解酶。PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)利用DNA聚合酶體外擴(kuò)增核酸片段的方法。*熒光定量PCR（real time PCR）:在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。D

3、NA文庫：DNA 或DNA的所有片斷隨機(jī)地連接到基因載體上,然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中,通過細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個片段的無性繁殖系(克隆),在制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部DNA都包含在內(nèi)的情況下,這一組克隆的總體就被稱為某種生物的基因文庫。*cDNA文庫：以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫。內(nèi)切酶: 內(nèi)切酶，即限制性核酸內(nèi)切酶。亦稱限制性核酸酶。是一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸順序,并以內(nèi)

4、切方式水解雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同于一般的脫氧核糖核酸酶（DNase）,它們的切點大多很嚴(yán)格，要求專一的核苷酸順序 識別順序。TAq酶：是一種耐熱的DNA聚合酶，可以耐受90C以上的高溫而不失活，常見于PCR技術(shù)，用于大量擴(kuò)增DNA片段。*Southern-blot: 是一種常用的 DNA 定量的分子生物學(xué)方法。其原理是將待測的 DNA 樣品固定在固相載體（硝酸纖維膜或尼龍膜）上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的固相 DNA 的位置上顯示出雜交信號，通過檢測信號的有無、強(qiáng)弱可以對樣品定性、定量，從而計算出轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù)*Northern-blot: 是一種通過檢測RNA的表

5、達(dá)水平來檢測基因表達(dá)的方法，通過northern blot的方法可以檢測到細(xì)胞在生長發(fā)育特定階段或者脅迫或病理環(huán)境下特定基因表達(dá)情況。原理類似southern-blot。*Western-blot：也稱為免疫印跡，是一種分析和鑒定特定蛋白質(zhì)的技術(shù)，用來檢測在不均一的蛋白質(zhì)樣品中是否存在目標(biāo)蛋白的一種方法。即將混雜的總蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至固相膜(如硝酸纖維素膜、尼龍膜和PVDF膜等)上，再用特定蛋白質(zhì)抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，顯色后，可顯示出該特定蛋白是否存在及其表達(dá)量。*探針：是一小段單鏈DNA或者RNA片段（大約是20到500bp）， 用于檢測與其互補(bǔ)的核酸序列。雙鏈DNA

6、加熱變性成為單鏈，隨后用放射性同位素（通常用磷-32）、熒光染料或者酶（如辣根過氧化物酶）標(biāo)記成為探針。*離子交換色譜：以離子交換樹脂作固定相，在流動相帶著試樣通過離子交換樹脂時，由于不同的離子與固定相具有不同的親合力而獲得分離的色譜法。*氣相色譜（GC）：GC主要是利用物質(zhì)的沸點、極性及吸附性質(zhì)的差異來實現(xiàn)混合物的分離。用于可揮發(fā)、熱穩(wěn)定、沸點不超過500的化合物。待分析樣品在汽化室汽化后被惰性氣體（即載氣，也叫流動相）帶入色譜柱，柱內(nèi)含有液體或固體固定相，由于樣品中各組分的沸點、極性或吸附性能不同，造成每種組分在流動相和固定相之間形成分配或吸附不同而分離的的一種技術(shù)。液相色譜：不受樣品揮發(fā)

7、度和穩(wěn)定性限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物高聚物的分析，分析對象為可以溶于水或有機(jī)溶劑的的各種物質(zhì)，大約占有機(jī)物70%-80%。*高效液相色譜（HPLC）：高效液相色譜是以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。*超高效液相色譜（UPLC）：在傳統(tǒng)的HPLC的基礎(chǔ)上通過運用粒徑低于2m的小顆粒來提高色譜柱的柱效，從而相對于傳統(tǒng)的液相色譜具有更高的分離度、速度和靈敏度。流動相：色譜過程中攜帶待測組分的向前移動的物質(zhì)成

8、為流動相，是與固定相處于平衡狀態(tài)、帶動樣品向前移動的另一相用作流動相的油氣體、液體、超臨界流體。固定相：是色譜柱內(nèi)不移動的惰性物質(zhì)稱為固定相，是色譜分析中的關(guān)鍵，混合物組分的分離，主要取決于固定相的選擇。*激光掃描共聚焦顯微鏡：利用激光點作為熒光的激發(fā)光并通過掃描裝置對標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)掃描，并通過空間共軛光闌（針孔）阻擋離焦平面光線而成像的一種顯微鏡。是當(dāng)今世界最先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器。*二維電泳（2-DE）：是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進(jìn)行SDS-PAGE（按照分子大?。?jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質(zhì)圖。二維電泳是分離分析蛋白質(zhì)

9、最有效的一種電泳手段。NCBI：(美國國立生物技術(shù)信息中心)它的目的是建立關(guān)于分子生物學(xué)，生物化學(xué)，和遺傳學(xué)知識的存儲和分析的自動系統(tǒng)。EMBL：（歐洲分子生物學(xué)實驗室）由歐洲30個成員國政府支持組成，目的在于促進(jìn)歐洲國家之間的合作來發(fā)展分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究和改進(jìn)儀器設(shè)備、教育工作等。分7個部分：結(jié)構(gòu)、分化、物理儀器、生化儀器、生物儀器、計算機(jī)和應(yīng)用數(shù)學(xué)。目前,在研究中已經(jīng)建立了先進(jìn)的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫。細(xì)菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC）是指一種以F質(zhì)粒（F-plasmid）為基礎(chǔ)建構(gòu)而成的細(xì)菌染色體克隆載體，常用來克隆150kb左右大小的D

10、NA片段，最多可保存300kb個堿基對。1. 基因克隆包括哪幾個步驟原理: 把來自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA,然后送入受體生物中表達(dá)，從而長生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。步驟：（1）外源基因的獲得，如酶切法、逆轉(zhuǎn)錄法、人工合成法。（2）選擇合適的克隆載體（如質(zhì)粒，噬菌體）并且和外源基因一起用限制性內(nèi)切酶處理。（3）將目的基因和克隆載體通過連接酶連接起來，形成重組載體。（4）將重組載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行擴(kuò)增。（5）對獲得重組載體分子的細(xì)胞進(jìn)行篩選。（6）重組子的大量培養(yǎng)，檢測外源基因是否表達(dá)。2. 氣相和液相及超高效液相色譜優(yōu)缺點比

11、較色譜法也稱色層法、層析法，是一類重要的分離分析方法。分離原理：當(dāng)流動相中所攜帶的混合物流過固定相時，就會和固定相發(fā)生作用（力的作用）。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小也有差異。因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相中的滯留時間有長有短，從而按先后次序從固定相中流出。氣相色譜：主要是利用物質(zhì)的沸點、極性及吸附性質(zhì)的差異來實現(xiàn)混合物的分離。用于可揮發(fā)、熱穩(wěn)定、沸點不超過500的化合物（20%-25%）優(yōu)點：1用毛細(xì)管柱色譜可得到很高的柱效 2有很靈敏的檢出器，如ECD和較靈敏的通用檢測器如TCDFID 3流動相為氣體，無毒，易于處理，固定相種類多 4運行和操作容

12、易 5儀器制造難度小缺點：1.只能分析揮發(fā)性的物質(zhì)，只能分析20%的化合物； 2.不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析。液相色譜：不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，分析對象為可以溶于水或有機(jī)溶劑的各種物質(zhì)，大約占有機(jī)物的70%-80%優(yōu)點：1幾乎可以分析各種物質(zhì) 2可以用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析缺點：1色譜柱不能很長，柱效不會很高2沒有較靈敏的通用檢測器3流動相有毒，費用較高，固定相種類少4運行和操作比較難5儀器制造難度大超高效液相色譜：在傳統(tǒng)的HPLC的基礎(chǔ)上通過運用粒徑低于2m的小顆粒來提高色譜柱的柱效突破了傳統(tǒng)色譜的

13、技術(shù)瓶頸，使色譜分離的解析度達(dá)到新的高度。優(yōu)點：1高分離度2高速度3高靈敏度缺點：由于使用了小粒徑顆粒，且為了達(dá)到高效目的，使用時所產(chǎn)生的壓力也自然成倍增大。故液相色譜的輸液泵也相應(yīng)改變成超高壓的輸液泵。3. Western-blot又稱蛋白印跡，是一種分析和鑒定特定蛋白質(zhì)的技術(shù)，用來檢測在不均一的蛋白質(zhì)樣品中是否存在目標(biāo)蛋白的一種方法。即將混雜的總蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至固相膜(如硝酸纖維素膜、尼龍膜和PVDF膜等)上，再用特定蛋白質(zhì)抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，顯色后，可顯示出該特定蛋白是否存在及其表達(dá)量。 具體的實驗過程如下（以在PVDF膜上直接顯色為例）：(1)利用SDS-P

14、AGE方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，利用電泳方法將其進(jìn)行分離。為提高電轉(zhuǎn)移的效率，通常采用SDS/PAGE技術(shù)。分離實驗結(jié)束后，首先將樣品墻的上邊緣用小刀去除，然后在膠板的右上角切一個小口以便定位，小心放入轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。(2)利用電轉(zhuǎn)移的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或者尼龍膜。 準(zhǔn)備PVDF膜：根據(jù)膠的大小剪出一片PVDF膜，膜的大小應(yīng)略微小于膠的大小。將膜置于甲醇中浸泡1分鐘，再移至轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。 制作膠膜夾心：在一淺盤中打開轉(zhuǎn)移盒，將一個預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸泡過的海綿墊放在轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板上，在海綿墊的上方放置經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕的3MM紙，小心地將膠板放在3MM紙上

15、，并注意排除氣泡。將PVDF膜放在膠的上方同時注意排除氣泡，再在膜的上方放上一張同樣用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕過的3MM紙并趕出氣泡，放置另一張浸泡過的海綿墊，關(guān)閉轉(zhuǎn)移盒。將轉(zhuǎn)移盒按照正確的方向放入轉(zhuǎn)移槽中，轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的黑色端，轉(zhuǎn)移盒的白色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的白色端，填滿轉(zhuǎn)移緩沖溶液同時防止出現(xiàn)氣泡。 電轉(zhuǎn)移：連接電源,在4°C條件下維持恒壓100V，1小時。(3)免疫檢測：利用目的蛋白對應(yīng)的一抗進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，然后再利用酶標(biāo)的抗抗原（二抗）與一抗反應(yīng)。最后加入顯影劑進(jìn)行顯色反應(yīng)。 封閉：倒出TBS/PBS緩沖溶液,加入封閉緩沖溶液,輕輕搖動至少1小時。 清洗：倒掉封閉緩沖

16、溶液，并用TBS/PBS緩沖溶液清洗1-3次, 每次5-10分鐘。 一抗：倒掉TBS/PBS緩沖溶液，加入適量的一抗溶液，輕輕搖動1小時以上。 清洗：從容器中倒出一抗溶液，用TTBS/PBST緩沖溶液清洗3次，每次10分鐘。 二抗：倒出TTBS/PBST 緩沖溶液，加入適量的二抗溶液，輕輕搖動30分鐘左右。 清洗：從容器中倒出二抗溶液，用TTBS/PBST緩沖溶液清洗3次，每次10分鐘。 檢測：倒掉TTBS/PBST 緩沖溶液，并加入顯影劑，輕輕搖動PVDF膜，觀察顯影情況，當(dāng)能夠清晰的看到顯色帶時，用蒸餾水在30分鐘內(nèi)分三次清洗PVDF膜以終止顯色反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行。(4)實驗結(jié)果：檢查膜上顯色

17、結(jié)果，藍(lán)紫色帶所對應(yīng)的即是目標(biāo)蛋白的位置。4. 利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白質(zhì)優(yōu)點：積累了相對充分的研究工作，有多種表型的宿主菌和相應(yīng)的載體可供選擇應(yīng)用；易于進(jìn)行遺傳操作和高效表達(dá)；操作安全，致病能力低；生長速度快；培養(yǎng)基廉價，生產(chǎn)成本低；清楚宿主的遺傳背景；表達(dá)水平高。缺點：缺乏真核生物的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后加工機(jī)制，不宜表達(dá)真核生物的蛋白；缺乏表達(dá)蛋白復(fù)性系統(tǒng)，表達(dá)蛋白無特異性空間結(jié)構(gòu), 常形成不溶性包涵體 (inclusion body) ；表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，易被細(xì)菌蛋白酶降解；細(xì)菌的內(nèi)毒素（熱源）不易除去，會造成人畜發(fā)熱。外源蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)過程：1. 選擇合適的大腸桿菌表達(dá)載體

18、（如分泌型表達(dá)載體pET28a）。2. 將編碼目的蛋白的基因片段和載體通過連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。3. 將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主（如DE3）4. 大量培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)5. 對表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。5. 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）PCR技術(shù)的基本原理是特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模

19、板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。6. 熒光定量PCR和常規(guī)PCR的比較常規(guī)PCR技術(shù)：是一種體外擴(kuò)增核酸片段的一種方法可以對終產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，但是無法進(jìn)行定量分析。常規(guī)PCR特點：特異性強(qiáng)，靈敏度高，簡便、快速，對標(biāo)本的純度要求低。熒光定量PCR技術(shù)：

20、在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。特點：特異性強(qiáng)，靈敏度高，可直接對產(chǎn)物進(jìn)行定量，可解決PCR污染問題，自動化程度高，操作簡單。它們主要區(qū)別是：常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析，是終點定量。熒光定量PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，是起點定量。兩種熒光定量化學(xué)染料染色：SYBR®Green I是一種雙鏈DNA小溝結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合時才發(fā)光，游離時不發(fā)光。在傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料能特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，發(fā)射熒光信號，

21、而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，這樣就保證了熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。當(dāng)PCR循環(huán)復(fù)制時DNA雙鏈也成倍增長，同樣SYBR染料的熒光的信號也隨之增倍，通過實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程中熒光信號的積累，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比進(jìn)行定量分析。TaqMan原理：聚合鏈取代Taq酶的5 3外切活性聚合完成TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光

22、基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。再通過實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程熒光信號的積累，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比進(jìn)行定量分析。7. 激光共聚焦掃描顯微鏡與普通熒光顯微鏡一、熒光顯微鏡的成像原理熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學(xué)顯微鏡.基本原理: 基本原理:利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長的熒光，從而用于對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。二、激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理1）. 普通熒光顯微鏡的不足熒光標(biāo)本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上

23、方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛，原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)）。2）激光共聚焦掃描顯微鏡的成像原理：1. 采用點光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點；2. 該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器；3. 分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。4. 這樣，

24、來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。5. 以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應(yīng)光點的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。8. 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)和雙向電泳蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)方法：1.樣品制備（細(xì)胞裂解，除去雜質(zhì)，蛋白質(zhì)溶解）2.進(jìn)行二維電泳（2-DE）3.進(jìn)行差異分析，選擇感興趣的蛋白，胰蛋白酶處理4.對感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析5.對獲得的肽指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索分析6.進(jìn)行功能分析分析蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系：酵母雙雜交，噬菌體展示，親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，

25、免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)。酵母雙雜交的原理：典型的真核轉(zhuǎn)錄因子，含有二個不同的結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)。BD結(jié)構(gòu)域可識別DNA上的特異序列，并使AD結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)基因的上游。AD可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。BD結(jié)構(gòu)域和AD結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上可以分開，功能上相互獨立。當(dāng)BD結(jié)構(gòu)域和AD結(jié)構(gòu)域相互分開時，仍分別具有各自的功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄。只有當(dāng)被分開的BD結(jié)構(gòu)域和AD結(jié)構(gòu)域通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上相互接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，并激活基因表達(dá)。利用基因工程技術(shù)分別將兩個蛋白質(zhì)和AD結(jié)構(gòu)域和BD結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)。

26、若兩個蛋白質(zhì)之間存在相互作用二者互相靠近，就會導(dǎo)致AD結(jié)構(gòu)域和BD結(jié)構(gòu)域相互靠近，激活報告基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（宿主一般為營養(yǎng)缺陷型，而報告基因是指導(dǎo)合成該營養(yǎng)物質(zhì)的基因）。生物信息學(xué)方法：SWISS-MODEL6、研究蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)手段?1：蛋白質(zhì)分離技術(shù)(1):二維凝膠電泳（2D-SDS-PAGE）：第一向為等電聚焦（IEF），根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同而將其分離，第二向SDS-PAGE，根據(jù)其分子量的大小而將其分離。由于其具有大規(guī)?？焖俜治龊丸b定蛋白質(zhì)的能力以及有較好的可重復(fù)性和可比性，相對于蛋白質(zhì)微列矩陣把其稱為蛋白質(zhì)宏觀矩陣。(2):差異凝膠電泳(DIGE)(3):單向電泳(SDS-PAGE

27、)(4):毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis CE)2：蛋白質(zhì)鑒定技術(shù):（1）傳統(tǒng)方法：蛋白質(zhì)微量測序、氨基酸組成分析 新型方法:生物質(zhì)譜（MS）：從細(xì)胞、組織或生物體液中提取的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過二維凝膠電泳分離后，所分離的蛋白點用胰蛋白酶降解進(jìn)行質(zhì)譜分析就可以得到該蛋白的肽譜圖，根據(jù)肽譜圖對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，即可識別和鑒定所檢測的蛋白質(zhì)。基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異來分離并確定樣品的分子量。(離子源、質(zhì)量分析器和離子檢測器) (2) 聯(lián)合技術(shù)精確鑒定蛋白質(zhì) A:兩級飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）B:傅里葉轉(zhuǎn)換回旋共振

28、質(zhì)譜（FTMS） C:表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS） 3:蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)A:構(gòu)建和分析雙向凝膠電泳圖譜 B:數(shù)據(jù)庫的搜索與蛋白鑒定 常用數(shù)據(jù)庫1):瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。 2):目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫是NCBInr和MSDB數(shù)據(jù)庫。 蛋白鑒定的軟件 1):Mascot( 2):ProFound 3):ProteinProspector 4:蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)n 揭示蛋白質(zhì)組成員間的相互作用、相互協(xié)調(diào)的關(guān)系，并深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，以及基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系。 n 具體技術(shù)1

29、酵母雙雜交系統(tǒng)1989年Field 和Song等人在酵母細(xì)胞中設(shè)計的分析蛋白質(zhì)相互作用的方法。主要特點:最主要的應(yīng)用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。優(yōu)點 :（1）作用信號是在融合基因表達(dá)后，在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。(2)真實反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用情況(3)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時期材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。(4)敏感性高 缺點 ：(1).假陽性結(jié)果 某些蛋白表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域，能與其他蛋白形成穩(wěn)定 的復(fù)合體，從而

30、引起報告基因的表達(dá)，產(chǎn)生"假陽性"結(jié)果。 (2).限于核內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的相互作用 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助，這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。2. 噬菌體展示技術(shù):在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當(dāng)噬菌體生長時，表面就表達(dá)出相應(yīng)的單抗.將這種單克隆抗體做成親和柱，當(dāng)被分離的蛋白通過親和柱子時，所含有的目的蛋白就會和相應(yīng)的的抗體結(jié)合，而被特異分離。3. 親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù):將某

31、種蛋白質(zhì)以共價鍵固定在基質(zhì)（如瓊脂糖）上，含有與之相互作用的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解液過柱，先用低鹽溶液洗脫下未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后用高鹽溶液或SDS溶液洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白質(zhì)，最后用多維液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白4. 免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù):以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。 5. 蛋白質(zhì)芯片技術(shù):將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析。蛋白質(zhì)合成機(jī)制：1：氨基酸的激活 2：肽鏈合成的啟動

32、3：肽鏈的延長 4：肽鏈合成的終止和釋放 5：肽鏈額折疊和加工處理RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄作用過程可以分為三個階段：起始、延長及終止。1. 起始：RNA聚合酶的因子識別DNA啟動子的識別部位，RNA聚合酶核心酶則結(jié)合在啟動子的結(jié)合部位。轉(zhuǎn)錄作用開始時，根據(jù)DNA模板鏈上的核苷酸的序列，NTP根據(jù)堿基互補(bǔ)原則依次進(jìn)入反應(yīng)體系。在RNA聚合酶的催化下，起始點處相鄰的前兩個NTP以3、5一磷酸二酯鍵相連接。隨后，因子從模板及RNA聚合酶上脫落下來，于是RNA聚合酶的核心酶沿著模板向下游移動，轉(zhuǎn)錄作用進(jìn)入延長階段。脫落下的因子可以再次與核心酶結(jié)合而循環(huán)使用。2.延長:在RNA聚合酶的催化下，核苷酸之間以3、5

33、一磷酸二酯鍵相連接進(jìn)行著RNA的合成反應(yīng)，合成方向為53。在延長過程中，局部打開的DNA雙鏈、RNA聚合酶及新生成轉(zhuǎn)錄本RNA局部形成轉(zhuǎn)錄泡。隨RNA聚合酶的移動，轉(zhuǎn)錄泡也行進(jìn)，貫穿于延長始終。3.終止：在RNA延長進(jìn)程中，當(dāng)RNA聚合酶行進(jìn)到DNA模板的終止信號時，RNA聚合酶就不再繼續(xù)前進(jìn)，聚合作用也因此停止。由于終止信號中有由GC富集區(qū)組成的反向重復(fù)序列，在轉(zhuǎn)錄生成的mRNA中有相應(yīng)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。此發(fā)卡結(jié)構(gòu)可阻礙RNA聚合酶的行進(jìn)，由此而停止了RNA聚合作用。在終止信號中還有AT富集區(qū)，其轉(zhuǎn)錄生成的mRNA3末端有多個U殘基。8.層析技術(shù)層析技術(shù)是一種物理的分離方法，無論何種層析都是由互不

34、相溶的兩個相組成：一個是固定相，（固體或吸附在固體上的液體），一是流動相（液體或者氣體）。層析時利用混合物中各組分理化性質(zhì)（吸附力，分子形狀和大小，分子極性，分子親和力，溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩種相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速度移動而最終被分離。根據(jù)分離的原理的原理不同，可以分為1：吸附層析是以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離目的的一種分離技術(shù)。 基本原理：以吸附劑為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇榱鲃酉?。由于各種物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動相中的溶解度不同。層析時當(dāng)流動相從固定相上流過時，各組分也就不同程度地被溶解（解吸

35、），然后又被吸附，再溶解再吸附，從而以不同的速度隨著流動相向前移動。 反相層析在吸附層析中，高極性物質(zhì)在層析柱上吸附較牢，洗脫時發(fā)生拖尾現(xiàn)象和保留時間長的問題。如果在支持物上涂上一層高碳原子的疏水性強(qiáng)的烷烴類，洗脫液用極性 強(qiáng)的溶劑，如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強(qiáng)的物質(zhì)不被吸附，最先洗下來，得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反，故稱為反相 層析。2：凝膠層析是以網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的一種層析技術(shù)。 基本原理：凝膠層析是根據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，形

36、成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴(kuò)散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外面的空間內(nèi)隨著流動相向下流動，它們經(jīng)歷的流程短，流動的速度快，所以首先流出，而較小的分子則可以完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長，流動的速度慢，所以最后流出，而分子大小介于兩者之間的分子在流動中部分滲透，滲透的程度取決于分子的大小，所以它們流出的時間介于兩者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按照分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離

37、的目的。3:離子交換層析是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。 基本原理:離子交換層析是根據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的.離子交換層析的固定相是離子交換劑,(它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價結(jié)合在某種電荷基團(tuán)上形成的.)離子交換劑可以分為三個部分,高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。電荷基團(tuán)和高分子聚合物基質(zhì)共價結(jié)合，形成一個帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子(交換離子) 是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，它能與溶液中其他的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反

38、應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的粒子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑，平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑能與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。4：親和層析是根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力（如酶和抑制劑、抗體和抗原、激素和受體等），將某種配體連接在載體上作為固定相，而能對與配體特異性結(jié)合的生物大分子進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)，親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術(shù)，具有很高的分辨率。 基本原理：生物分子間存在很多特異性的相互作用，如我們熟悉抗體-抗原、酶-底物和抑制劑、激素-受體等等，它們之間都能夠?qū)Ｒ恍远赡娴慕Y(jié)合，這種結(jié)合力就稱為親和力，親和層析的分離原理簡單的說就

39、是通過將具有親和力的兩個分子中的一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進(jìn)行分離純化。被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體，配體與基質(zhì)是共價結(jié)合的，構(gòu)成親和層析的固定相，成為親和吸附劑。親和層析首先選擇與待分離的生物大分子有親和力的物質(zhì)作為配體。5:疏水作用層析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根據(jù)分子表面疏水性差別來分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團(tuán)，我們把這些疏水性基團(tuán)稱為疏水補(bǔ)丁，疏水補(bǔ)丁可以與疏水性層析介質(zhì)發(fā)生疏水性相互作用而結(jié)合。不同的分

40、子由于疏水性不同，它們與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水性作用力強(qiáng)弱不同，疏水作用層析就是依據(jù)這一原理分離純化蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的。疏水作用層析的基本原理如圖所示。L+HSLHS+WP：固相支持物L(fēng)：疏水性配體S：蛋白質(zhì)或多肽等生物大分子H：疏水補(bǔ)丁W：溶液中水分子P溶液中高離子強(qiáng)度可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水作用。利用這個性質(zhì)，在高離子強(qiáng)度下將待分離的樣品吸附在疏水性層析介質(zhì)上，然后線性或階段降低離子強(qiáng)度選擇性的將樣品解吸。疏水性弱的物質(zhì)，在較高離子強(qiáng)度的溶液時被洗脫下來，當(dāng)離子強(qiáng)度降低時，疏水性強(qiáng)的物質(zhì)才隨后被洗脫下來。五：簡述PET表達(dá)系統(tǒng)得工作原理，并設(shè)計一

41、個利用PET表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)C端含有HA-TAG目的蛋白質(zhì)（非分泌型）的試驗方案,PET HA-TAG序列為ATAGGTATACTACAAGGTCTAATACGT目的蛋白質(zhì)的c DNA 序列為 一：pET 系統(tǒng)是有史以來在E.coli 中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)。目的基因被克隆到pET質(zhì)粒載體上，受噬菌體T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯(可選擇)信號控制；表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7 RNA 聚合酶誘導(dǎo).PET表達(dá)系統(tǒng)組成包括（PET表達(dá)載體、以及噬菌體DE3的溶源菌宿菌） 1：PET表達(dá)載體的啟動子是T7噬菌體基因10啟動子（T7啟動子），T7 噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于T7 RNA聚合酶，2：T7

42、RNA聚合酶基因插入由大腸桿菌lacUV5啟動子控制、DE3溶原狀態(tài)下的大腸桿菌染色體上。3：在pET表達(dá)載體的T7啟動子的下游有一個lac操縱子序列，這個載體還有一個帶有常規(guī)啟動子以及編碼lac阻遏蛋白的序列（lac I）。T7啟動子、lac操縱子和lacI位置交錯。4：pET表達(dá)載體在DE3溶原狀態(tài)下的大腸桿菌中， lac阻遏蛋白可以作用于大腸桿菌染色體上，抑制宿主菌轉(zhuǎn)錄T7RNA聚合酶，也作用于T7啟動子、lac操縱子，以阻斷任何T7RNA聚合酶導(dǎo)致的目的基因轉(zhuǎn)錄。(保證表達(dá)質(zhì)粒在宿主菌中的穩(wěn)定)5：T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄機(jī)制十分有效并具有選擇性：充分誘導(dǎo)時，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目

43、的蛋白；在非誘導(dǎo)條件下，幾乎可以使目的基因完全處于沉默而不轉(zhuǎn)錄。二：(1) 首先要進(jìn)行通過設(shè)計引物進(jìn)行c DNA的單鏈PCR 從而在目的片斷的5端加上酶切位點和蛋白酶酶切位點，從而能連上T7 載體，和產(chǎn)生目的蛋白。3端加上HA-TAG、終止密碼子和酶切位點。引物設(shè)計如下正向引物 （選擇NCOI 酶切位點） 加了一個KAN 蛋白酶酶切位點 5CACACCATGG AAA AGA ATAAAATCTAACAAT . 3 （NCOI位點）（KEX蛋白酶酶切位點）反向引物5CATAGGATCC TTA ACGTATTAGACCTTGTAGTATACCTAT （Bam I 酶切位點）（終止密碼子） （H

44、A-TAG）AATGCCACTCATGAG.3 (2) 將PCR產(chǎn)物通過酶切與PET載體連接,導(dǎo)入到噬菌體DE3的溶源菌菌宿菌中進(jìn)行表達(dá).六：色譜分析中，用面積歸一法定量的優(yōu)缺點是什么?歸一化百分比法與面積和峰高百分比法類似但是要用校正的響應(yīng)值代替測量的響應(yīng)值優(yōu)點：1.對組分靈敏度差異進(jìn)行校正 2.進(jìn)樣量在一定范圍內(nèi)變化不影響結(jié)果缺點：1:必須經(jīng)過校準(zhǔn) 2:所有的峰都必須能被檢測 3:所有的峰都必須被鑒定和校準(zhǔn)七：熒光定量PCR和常規(guī)PCR的區(qū)別? 常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析 熒光定量PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量分析定量PCR的化學(xué)原理

45、兩種定量化學(xué)染料染色：SYBR®Green I是一種雙鏈DNA小溝結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合時才發(fā)光，游離時不發(fā)光。在傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料能特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，這樣就保證了熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。當(dāng)PCR循環(huán)復(fù)制時DNA雙鏈也成倍增長，同樣SYBR染料的熒光的信號也隨之增倍，通過實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程中熒光信號的積累，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比進(jìn)行定量分析。TaqMan原理：聚合鏈取代Taq酶的5 3外切活性聚合完成TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的

46、同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。再通過實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程熒光信號的積累，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比進(jìn)行定量分析。TaqManMGB原理：MGB探針能夠分辨1個堿基的差別；當(dāng)堿基完全配對，有信號；當(dāng)一個堿基不配對，就沒有了信號七、DNA測序技術(shù)：Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止DNA測序法Sanger 法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的