分子生物學(xué)常用技術(shù)

1、PCR PCR 技術(shù)技術(shù) PCR(Polymerase Chain Reaction)Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.The PCR cycle 95C step to denature the duplex DNA, An annealing step of around 55C to allow the primers to bind, 72C polymerization step. Mg2+,dNTPs are required in addition to template,primers,buf

2、fer and enzyme歷史歷史60s-70s：基因的體外分離技術(shù)。Khorana（1971）：美國(guó)MIT教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主 “經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因”。核酸體外擴(kuò)增最早設(shè)想遺忘: 當(dāng)時(shí)很難進(jìn)行測(cè)序和合成寡核苷酸引物； 當(dāng)時(shí)(1970)Smith等發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切酶，體外克隆基因成為可能KaryKary Mullis(1985) Mullis(1985)發(fā)明過(guò)程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶鏈反應(yīng)”一文中寫到: “這種簡(jiǎn)單得令人驚奇，可以無(wú)限量地拷貝DNA片段的方法是在不可想象的情況下，即駕車行駛在月色下的

3、加利福尼亞山間公路上時(shí)想出來(lái)的”。發(fā)展過(guò)程： 開(kāi)始使用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段，該酶不耐熱，每次加熱變性DNA后都要重新補(bǔ)加。耗時(shí)、費(fèi)力、易出錯(cuò)。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得自動(dòng)化。專利官司專利官司1987年美國(guó)專利局專利授權(quán)1989年，DuPont異議，大小公司對(duì)簿公堂，將決定誰(shuí)將獲得諾貝爾獎(jiǎng)。DuPont理由是，1971年P(guān)CR的雛形已由Khorana一系列文章闡明，并公布于眾，應(yīng)當(dāng)是公共產(chǎn)權(quán)。斯坦福大學(xué)Kornberg（研究DNA聚合酶獲諾貝爾獎(jiǎng)）也認(rèn)為，任何具備生物技術(shù)知識(shí)的人都可以從Khorana等的文章中推知如何操作PCR。美國(guó)專利局駁回DuPont異議，地方法院判屬Ce

4、tusCetus獲勝后馬上反訴，指出DuPont已侵犯另一項(xiàng)與PCR有關(guān)的專利并要求對(duì)方賠償以及不再銷售與PCR有關(guān)試劑和儀器PCRPCR發(fā)展速度發(fā)展速度驚人，沒(méi)有一種技術(shù)能與之相比引用論文最多、應(yīng)用范圍十分廣泛1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)：Mullis，與開(kāi)創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變”加拿大籍英國(guó)科學(xué)家Michael Smith共獲 原理原理 類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種

5、循環(huán)的不斷重復(fù)。proceduresprocedures template(DNA or template(DNA or RNA),RNA), primers,primers, TaqTaq enzyme, enzyme, 1010PCR buffer,PCR buffer, MgMg+,+, 5mmol/L dNTPs5mmol/L dNTPs pre-denaturationpre-denaturation-denature completelydenature completely DenaturationDenaturation annealingannealing Elongatio

6、nElongation cycles:25-30cycles:25-30Primer designPrimer designMost imp.Most imp.(1)length: 2030bp(2)G+C contents:ATCG random distributed(3)primers : no complementary sequence(4)3end of the primer: no modification(5)5end of the primer:product length，can be modified(6) specificity:less than 70% homolo

7、gy with non-specific amplification sequence, or 8bpcontinuous complementary basePrimer designed with Primer designed with the help of computerthe help of computerDNA databaseconservative region comparisionprimers or blast PCR reaction components and their functionstemplate：ssDNA, dsDNA mRNA needed t

8、o be RT as cDNAsamples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques.DNA：very stableprimesIf the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique restriction enz

9、yme sites within the 5-ends of the primers.Can amplify fragments over 10kb in lengthStore:純化引物在25乙腈溶液中4；凍干引物于-20可保存1-2年，液體狀態(tài)于-20可保存6個(gè)月。不用時(shí)應(yīng)-20保存。buffer10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20)。Mg2+：for Taq polymerase activityconc.:Low:low activity high: non-specific amplificationdNTPs：貯備dNTP液：1 mol/L NaOH

10、 調(diào)pH至中性。貯備濃度為5-10mmol/L，終濃度為20-200umol/L，分裝-20保存。4種dNTP濃度應(yīng)相同。TaqTaq DNA polymerase DNA polymerase：from thermophilic bacteria. Taq polymerase from Thermus aquaticus.other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications.mineral oilSelection for DNA polymeraseSelection f

11、or DNA polymeraseKlenow酶早期采用該酶不耐熱，缺點(diǎn)有溫度要求低(37)，受熱即失活；產(chǎn)物特異性不高；積累大量的失活殘酶，使反應(yīng)產(chǎn)物純度大大降低；擴(kuò)增的最長(zhǎng)序列約400bp（Taq酶則能擴(kuò)增10kb）thermostable DNA polymerasesTaqTaq DNA polymeraseTthTth DNA polymerasefrom T.thermophilusVENTVENT DNA polymerasefrom T.litoralisSacSac polymerasepfupfu polymeraseTaq DNA聚合酶 分離:1969年，美國(guó)黃石國(guó)家公園

12、溫泉 分子量:94KDa 活性：在幾種水生棲熱菌中活性最高，200 000U/mgTaq DNA聚合酶離子需要：對(duì)Mg2+、單價(jià)離子性質(zhì)和濃度較 敏感。最適濃度為50mmol/L。忠實(shí)性:沒(méi)有校正單核苷酸錯(cuò)配功能-致命弱點(diǎn)。一般出錯(cuò)率為210-4核苷酸/每輪循環(huán)，利用PCR克隆、測(cè)序時(shí)尤應(yīng)注意。Taq DNA聚合酶抑制劑:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及許多其他化學(xué)藥劑。內(nèi)源DNA:不同來(lái)源的酶可能由于制備過(guò)程中殘留的原細(xì)菌DNA或PCR產(chǎn)物的污染而含有不明來(lái)源的DNA。在使用擴(kuò)增保守序列的通用引物時(shí)，會(huì)在無(wú)模板對(duì)照管出現(xiàn)擴(kuò)增帶。保存:在-20至少6個(gè)月。PCR optimiza

13、tion變性溫度和時(shí)間92-95，富含G和C的序列，可適當(dāng)提高，但過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性損失。退火溫度與時(shí)間引物中G、C含量高、長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。通常37-55、1-2分鐘。延伸溫度和時(shí)間溫度：72，接近Taq酶的最適75時(shí)間：過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對(duì)低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加時(shí)間。循環(huán)次數(shù)循環(huán)過(guò)多，非特異性產(chǎn)物大量增加PCR污染及其對(duì)策強(qiáng)大擴(kuò)增能力+檢測(cè)的敏感性極微量的污染便可導(dǎo)致假陽(yáng)性污染源的追蹤點(diǎn)樣器和加樣器;離心機(jī);微解剖刀;濃縮用具、真空瓶;電泳裝置;紫外燈箱;乙醇或水浴鍋;冰箱門把手、實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等污染的預(yù)防(1)隔離不同

14、操作區(qū) (2)分裝試劑 (3)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作 (4)專用加樣器(5)結(jié)果的重演PCRPCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用遺傳性疾病地中海貧血的基因診斷血友病苯丙酮尿癥傳染性疾病傳染性疾病肝炎性病腫瘤法醫(yī)學(xué)法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別、親子鑒定1985年，英國(guó)遺傳學(xué)家Jeffreys采用DNA指紋圖譜進(jìn)行個(gè)人識(shí)別和親子鑒定。有時(shí)犯罪物證量很少，不足以用來(lái)進(jìn)行DNA指紋分析，PCR有效解決這些問(wèn)題。對(duì)于犯罪現(xiàn)場(chǎng)中遺留的少量生物物證，如一根毛發(fā)、一滴血等都可用于分析，在法醫(yī)學(xué)上認(rèn)證罪犯、親子鑒定以及人的性別鑒定中PCR技術(shù)被普遍采用。植物遺傳育種構(gòu)建遺傳圖譜、分離目的基因、 基因定位分子標(biāo)記輔助育種了解不同品種間的親緣關(guān)系、

15、系統(tǒng)進(jìn)化畜 牧畜禽病診斷:豬偽狂犬病毒、豬口蹄疫病毒、豬瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹瀉病毒、免疫缺陷病毒等檢測(cè)性別鑒定：牛、綿羊Y染色體上特異 DNA片段構(gòu)建基因圖譜檢測(cè)基因整合與表達(dá)：轉(zhuǎn)基因魚其他考古學(xué)植物分類學(xué)群體生態(tài)學(xué) DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù)第一小節(jié)第一小節(jié) 概概 述述一、一、DNA芯片技術(shù)的概念芯片技術(shù)的概念 DNA芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成（芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成（in situ synthesis）寡核苷酸探針，或者直接將大量的）寡核苷酸探針，或者直接將大量的DNA探針以顯探針以顯微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜微打印的方式有序的固化于

16、支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析即可得出樣品的遺傳信息（基交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析即可得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）。由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持因序列及表達(dá)的信息）。由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱為物，所以稱為DNA芯片。芯片。DNA芯片又被稱為基因芯片（芯片又被稱為基因芯片（gene chips）、）、DNA陣列（陣列（DNA array）、）、cDNA芯片（芯片（cDNA chips）、寡核苷酸陣列（）、寡核苷酸陣列（oligonucleotide array）等。）等。二、二、DNA芯片的主要類型及其特點(diǎn)。芯片的主要類型及其特點(diǎn)

17、。 根據(jù)根據(jù)DNA芯片的制備方式可以將其分為兩大類：芯片的制備方式可以將其分為兩大類： 原位合成芯片（原位合成芯片（synthetic gene chip） 采用顯微光蝕刻等技術(shù)在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制采用顯微光蝕刻等技術(shù)在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片稱為原位合成芯片。這種芯片的集成度教高，可達(dá)成的芯片稱為原位合成芯片。這種芯片的集成度教高，可達(dá)10萬(wàn)萬(wàn)40萬(wàn)點(diǎn)陣萬(wàn)點(diǎn)陣/平方厘米。但合成的寡核苷酸探針長(zhǎng)度較短，一般為平方厘米。但合成的寡核苷酸探針長(zhǎng)度較短，一般為820個(gè)核苷酸殘基（個(gè)核苷酸殘基（nucleotide，nt），最長(zhǎng)為），最長(zhǎng)為50nt，因此需要使用多個(gè)，

18、因此需要使用多個(gè)相互重疊的探針片進(jìn)行檢測(cè)，才能對(duì)基因進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。相互重疊的探針片進(jìn)行檢測(cè)，才能對(duì)基因進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。 DNA微集芯片（微集芯片（DNA microchips） 將預(yù)先制備的將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片稱為面而制成的芯片稱為DNA微集芯片，又稱為微集芯片，又稱為DNA微集陳列（微集陳列（DNA microarray）。這類芯片集成度相對(duì)較低，可達(dá)）。這類芯片集成度相對(duì)較低，可達(dá)1萬(wàn)萬(wàn)10萬(wàn)點(diǎn)陣萬(wàn)點(diǎn)陣/平方平方厘米，但使用的探針組的來(lái)源比較靈活，可以是合成的寡核苷酸短片厘米，但使用的探針組的來(lái)源

19、比較靈活，可以是合成的寡核苷酸短片段，也可以是采用來(lái)自基因組的較長(zhǎng)的段，也可以是采用來(lái)自基因組的較長(zhǎng)的DNA片段；可以是雙鏈，也可片段；可以是雙鏈，也可以采用單鏈的以采用單鏈的DNA或或RNA片段，且技術(shù)實(shí)現(xiàn)未受到嚴(yán)格的專利控制，片段，且技術(shù)實(shí)現(xiàn)未受到嚴(yán)格的專利控制，因而近年來(lái)發(fā)展很快。探針的長(zhǎng)度可達(dá)因而近年來(lái)發(fā)展很快。探針的長(zhǎng)度可達(dá)100500nt。第二節(jié)第二節(jié) DNA芯片技術(shù)的基本原理與方法芯片技術(shù)的基本原理與方法一、芯片的制備一、芯片的制備 芯片制備的基本原理。芯片制備的基本原理。 芯片的制備包括支持物的預(yù)處理、原位合成芯片的準(zhǔn)備和芯片的制備包括支持物的預(yù)處理、原位合成芯片的準(zhǔn)備和DNA

20、微集微集陳列的制備三個(gè)方面。陳列的制備三個(gè)方面。 1.支持物的預(yù)處理支持物的預(yù)處理 目前用于目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分為兩類：實(shí)性材料和芯片制作的固相支持物大致可分為兩類：實(shí)性材料和膜性材料。膜性材料。實(shí)性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、實(shí)性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維素膜等。實(shí)性材料需要進(jìn)行預(yù)處理，使其表面衍生出尼龍膜、硝酸纖維素膜等。實(shí)性材料需要進(jìn)行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基等活性基團(tuán)。在合成寡核苷酸前，這些基因可與光敏材料的羥基、氨基等活性基團(tuán)。在合成寡核苷酸前，這些基因可與光敏材料的光敏保護(hù)基團(tuán)形成共價(jià)交聯(lián)而

21、被保護(hù)起來(lái)，合成時(shí)在光照下除去光敏保光敏保護(hù)基團(tuán)形成共價(jià)交聯(lián)而被保護(hù)起來(lái)，合成時(shí)在光照下除去光敏保護(hù)基團(tuán)，該活性基團(tuán)又可以和活化的單核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。另一方面，護(hù)基團(tuán)，該活性基團(tuán)又可以和活化的單核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。另一方面，這些活性基團(tuán)可與這些活性基團(tuán)可與DNA分子中的羥基等基團(tuán)形成共價(jià)結(jié)合而使打印在上分子中的羥基等基團(tuán)形成共價(jià)結(jié)合而使打印在上面的面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚賴氨酸等，使其帶上正電荷吸附帶負(fù)電荷的或多聚賴氨酸等，使其帶上正電荷吸附帶負(fù)電荷的DNA探針。探針。 2.原位合成芯片的制備

22、原位合成芯片的制備 原位合成芯片是采用顯微光蝕刻原位合成芯片是采用顯微光蝕刻（photolithography）技術(shù)或壓電打印技術(shù)或壓電打印（piezoelectric printing）技術(shù)，在芯片技術(shù)，在芯片的特定區(qū)域原位合成寡核苷酸而制成。的特定區(qū)域原位合成寡核苷酸而制成。顯微光蝕刻技術(shù)也顯微光蝕刻技術(shù)也稱為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（稱為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（light-directed synthesis），它），它不僅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。它不僅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。它是照相平板印刷技術(shù)（是照相平板印刷技術(shù)（photolithography）與傳統(tǒng)的核）與

23、傳統(tǒng)的核酸，多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，是原位合成芯片的酸，多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，是原位合成芯片的主要方法。壓電打印法的裝置與普通的彩色噴墨打印機(jī)相主要方法。壓電打印法的裝置與普通的彩色噴墨打印機(jī)相似，所用的技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。似，所用的技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。 3.DNA微集陳列的制備微集陳列的制備 DNA微集陳列的制備采用的是預(yù)先合成微集陳列的制備采用的是預(yù)先合成DNA或制備基或制備基因探針然后打印到芯片上的方式。因探針然后打印到芯片上的方式。二、樣品的準(zhǔn)備二、樣品的準(zhǔn)備 樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和標(biāo)記等過(guò)程。樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和標(biāo)記等過(guò)程。

24、 1樣品的分離純化樣品的分離純化 主要從活組織或血液中獲得主要從活組織或血液中獲得DNA或或mRNA，這個(gè)過(guò)程包括細(xì)胞分，這個(gè)過(guò)程包括細(xì)胞分離，破裂，去蛋白，提取及純化核酸的過(guò)程。離，破裂，去蛋白，提取及純化核酸的過(guò)程。 2樣品的擴(kuò)增樣品的擴(kuò)增 測(cè)定時(shí)往往需要較多的樣品分子，因此對(duì)于分離獲得的基因組測(cè)定時(shí)往往需要較多的樣品分子，因此對(duì)于分離獲得的基因組DNA通過(guò)通過(guò)PCR技術(shù)直接擴(kuò)增，對(duì)于技術(shù)直接擴(kuò)增，對(duì)于mRNA則需要逆轉(zhuǎn)錄，制備則需要逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。 3.樣品的標(biāo)記樣品的標(biāo)記 標(biāo)記物主要有熒光分子（標(biāo)記物主要有熒光分子（cy3、cy5）、生物素以及放射性同位素）、生物素以及放射性同位

25、素等。等。帶有標(biāo)記的帶有標(biāo)記的dNTP（cy3或或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素、生物素-dNTP）通過(guò)）通過(guò)DNA或或cDNA擴(kuò)增的過(guò)程，摻入靶分子序列。也可以在擴(kuò)增的過(guò)程，摻入靶分子序列。也可以在制備引物時(shí)，摻入標(biāo)記的核苷酸，擴(kuò)增靶序列后，使擴(kuò)增產(chǎn)物末端帶制備引物時(shí)，摻入標(biāo)記的核苷酸，擴(kuò)增靶序列后，使擴(kuò)增產(chǎn)物末端帶有標(biāo)記物。膜性載體可以用于檢測(cè)同位素標(biāo)記的樣品。有標(biāo)記物。膜性載體可以用于檢測(cè)同位素標(biāo)記的樣品。 樣品分子標(biāo)記的質(zhì)量影響芯片檢測(cè)的靈敏度，因此，核酸的提取，樣品分子標(biāo)記的質(zhì)量影響芯片檢測(cè)的靈敏度，因此，核酸的提取，反轉(zhuǎn)錄以及標(biāo)記等各環(huán)節(jié)要求嚴(yán)格操作。反轉(zhuǎn)錄以及標(biāo)記等各

26、環(huán)節(jié)要求嚴(yán)格操作。熒光標(biāo)記分辨率高于同位素?zé)晒鈽?biāo)記分辨率高于同位素標(biāo)記，而且可以采用雙色，如對(duì)照樣品標(biāo)紅色，待檢樣品標(biāo)綠色，有標(biāo)記，而且可以采用雙色，如對(duì)照樣品標(biāo)紅色，待檢樣品標(biāo)綠色，有助于結(jié)果分析與判斷。助于結(jié)果分析與判斷。 三、分子雜交三、分子雜交 芯片雜交是應(yīng)用標(biāo)記的待測(cè)樣品（靶序列）與固定在載體表面的芯片雜交是應(yīng)用標(biāo)記的待測(cè)樣品（靶序列）與固定在載體表面的探針進(jìn)行的復(fù)雜過(guò)程。探針進(jìn)行的復(fù)雜過(guò)程。 依據(jù)探針長(zhǎng)度、類型以及不同的目的，確定溫度、鹽濃度與反應(yīng)依據(jù)探針長(zhǎng)度、類型以及不同的目的，確定溫度、鹽濃度與反應(yīng)時(shí)間。通常采用的條件是：時(shí)間。通常采用的條件是：42，50%甲酰胺，甲酰胺，6S

27、SC，0.5%SDS，5Denhardt試劑。也可采用試劑。也可采用65，6SSC，0.5%SDS，5Denhardt試劑或者試劑或者65，10%SDS，7%PEG-800。 雜交過(guò)程類似雜交過(guò)程類似Northern或或Southern雜交，如封閉液預(yù)雜交、雜交、雜交，如封閉液預(yù)雜交、雜交、清洗、干燥與檢測(cè)。清洗、干燥與檢測(cè)。 四、檢測(cè)分析四、檢測(cè)分析 芯片雜交信號(hào)的檢測(cè)可應(yīng)用熒光檢測(cè)法、質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、芯片雜交信號(hào)的檢測(cè)可應(yīng)用熒光檢測(cè)法、質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法以及生物傳感器法。光導(dǎo)纖維法以及生物傳感器法。其中激光共聚焦熒光檢測(cè)法是最常應(yīng)其中激光共聚焦熒光檢測(cè)法是最常應(yīng)用的方法：激

28、光從芯片的背面切入，聚焦于芯片與靶溶液的相互作用用的方法：激光從芯片的背面切入，聚焦于芯片與靶溶液的相互作用面，與探針雜交的靶序列標(biāo)記物被激發(fā)產(chǎn)生熒光，經(jīng)過(guò)棱鏡聚焦而被面，與探針雜交的靶序列標(biāo)記物被激發(fā)產(chǎn)生熒光，經(jīng)過(guò)棱鏡聚焦而被檢測(cè)器檢測(cè)。樣品靶序列與探針嚴(yán)格配對(duì)雜交的分子發(fā)生強(qiáng)熒光信號(hào)，檢測(cè)器檢測(cè)。樣品靶序列與探針嚴(yán)格配對(duì)雜交的分子發(fā)生強(qiáng)熒光信號(hào)，不完全雜交顯示較弱的信號(hào)。不完全雜交顯示較弱的信號(hào)。第三節(jié)第三節(jié) DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用芯片技術(shù)的應(yīng)用 DNA芯片使用的基本流程。芯片使用的基本流程。 DNA芯片使用包括待測(cè)樣品準(zhǔn)備、分子雜交和檢測(cè)分析芯片使用包括待測(cè)樣品準(zhǔn)備、分子雜交和檢測(cè)分析3個(gè)

29、步驟。個(gè)步驟。 1.待測(cè)樣品的準(zhǔn)備待測(cè)樣品的準(zhǔn)備 樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和標(biāo)記。樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和標(biāo)記。 首先采用常規(guī)方法從組織細(xì)胞中分離純化樣品核酸、首先采用常規(guī)方法從組織細(xì)胞中分離純化樣品核酸、DNA或或mRNA，由于目，由于目前芯片檢測(cè)儀器的靈敏度有限，要求對(duì)樣品中靶序列進(jìn)行高效而特異地?cái)U(kuò)增。前芯片檢測(cè)儀器的靈敏度有限，要求對(duì)樣品中靶序列進(jìn)行高效而特異地?cái)U(kuò)增。樣品的標(biāo)記主要采用熒光法，也可以用生物素，放射性核素標(biāo)記法。樣品的標(biāo)記主要采用熒光法，也可以用生物素，放射性核素標(biāo)記法。 2.分子雜交分子雜交 待測(cè)樣品經(jīng)擴(kuò)增和標(biāo)記處理后，即可與待測(cè)樣品經(jīng)擴(kuò)增和標(biāo)記處理

30、后，即可與DNA芯片上的探針陳列進(jìn)行分子雜芯片上的探針陳列進(jìn)行分子雜交。交。芯片雜交與傳統(tǒng)的芯片雜交與傳統(tǒng)的Southern印跡等雜交方法類似，屬固印跡等雜交方法類似，屬固-液雜交。探針液雜交。探針?lè)肿庸潭ㄓ谛酒砻?，與位于液相的靶分子進(jìn)行反應(yīng)。芯片雜交的特點(diǎn)是探分子固定于芯片表面，與位于液相的靶分子進(jìn)行反應(yīng)。芯片雜交的特點(diǎn)是探針的量顯著大于靶基因片段，雜交動(dòng)力學(xué)呈線形關(guān)系。雜交信號(hào)的強(qiáng)弱與樣針的量顯著大于靶基因片段，雜交動(dòng)力學(xué)呈線形關(guān)系。雜交信號(hào)的強(qiáng)弱與樣品中靶基因的量成正相關(guān)。品中靶基因的量成正相關(guān)。 3.檢測(cè)分析檢測(cè)分析 芯片雜交及清洗后，未雜交分子被清除，帶有熒光標(biāo)記的靶芯片雜交及清洗

31、后，未雜交分子被清除，帶有熒光標(biāo)記的靶DNA（雜交分（雜交分子）與其互補(bǔ)的子）與其互補(bǔ)的DNA探針形成雜交體，在激光的激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光。探針形成雜交體，在激光的激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光。以掃描儀對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和分析，通過(guò)陳列上以掃描儀對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和分析，通過(guò)陳列上DNA探針的原始序列將靶探針的原始序列將靶DNA的信息反映出來(lái)。的信息反映出來(lái)。 DNA芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 DNA芯片用于基因診斷、芯片用于基因診斷、DNA序列測(cè)定、臨床藥物篩選、法醫(yī)鑒定、序列測(cè)定、臨床藥物篩選、法醫(yī)鑒定、 食食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極大的潛力。品工業(yè)和環(huán)境

32、監(jiān)測(cè)等方面。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極大的潛力。 1.基因診斷基因診斷 應(yīng)用應(yīng)用DNA芯片技術(shù)可以在芯片技術(shù)可以在DNA水平檢測(cè)與疾病相關(guān)的內(nèi)源性或外源性基水平檢測(cè)與疾病相關(guān)的內(nèi)源性或外源性基因；應(yīng)用表達(dá)芯片可以在因；應(yīng)用表達(dá)芯片可以在mRNA水平分析同一組織在不同的發(fā)育階段，正常水平分析同一組織在不同的發(fā)育階段，正常及病理狀態(tài)基因表達(dá)的差異，也可以分析不同組織同一基因在正常及病理狀及病理狀態(tài)基因表達(dá)的差異，也可以分析不同組織同一基因在正常及病理狀態(tài)下表達(dá)的差異，從而為疾病診斷與分類，病原微生物分型提供科學(xué)依據(jù)。態(tài)下表達(dá)的差異，從而為疾病診斷與分類，病原微生物分型提供科學(xué)依據(jù)。 2.DNA序列測(cè)定序列測(cè)

33、定 任何線狀的單鏈任何線狀的單鏈DNA或或RNA序列均可被分解成一系列堿基數(shù)固定、錯(cuò)落序列均可被分解成一系列堿基數(shù)固定、錯(cuò)落而且重疊的寡核苷酸，如而且重疊的寡核苷酸，如GTACTCGAATGC分解成分解成GTACTAGA、TACTCGAA、ACTCGAAT、CTCGAATG、TCGAATGC五個(gè)錯(cuò)開(kāi)五個(gè)錯(cuò)開(kāi)1個(gè)堿基個(gè)堿基但是可重疊但是可重疊7個(gè)堿基的個(gè)堿基的8體亞序列，當(dāng)然也可以分解成體亞序列，當(dāng)然也可以分解成7體，體，9體或其他整數(shù)體或其他整數(shù)（n體）亞序列。如果用某種方法將體）亞序列。如果用某種方法將5個(gè)亞序列全部測(cè)定出來(lái)，就可以重新組個(gè)亞序列全部測(cè)定出來(lái)，就可以重新組建原來(lái)的核苷酸排列順

34、序。應(yīng)用這一原理，可以合成或應(yīng)用已知序列的所有建原來(lái)的核苷酸排列順序。應(yīng)用這一原理，可以合成或應(yīng)用已知序列的所有可能的可能的n體寡核苷酸，并將其固定在芯片表面，然后與標(biāo)記的待測(cè)靶序列雜體寡核苷酸，并將其固定在芯片表面，然后與標(biāo)記的待測(cè)靶序列雜交，經(jīng)過(guò)重新組合，即可得到待測(cè)的交，經(jīng)過(guò)重新組合，即可得到待測(cè)的DNA序列。序列。 3.臨床藥物篩選臨床藥物篩選 臨床許多細(xì)菌對(duì)藥物具有抗藥性，但是不同的亞型對(duì)同一藥物的敏感性臨床許多細(xì)菌對(duì)藥物具有抗藥性，但是不同的亞型對(duì)同一藥物的敏感性不同。不同。DNA芯片技術(shù)已被用于鑒定結(jié)核菌及非典型分支桿菌的基因型與耐利芯片技術(shù)已被用于鑒定結(jié)核菌及非典型分支桿菌的基

35、因型與耐利福平的相關(guān)性以及福平的相關(guān)性以及HIV產(chǎn)生抗藥性與其逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因突變的相關(guān)性。產(chǎn)生抗藥性與其逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因突變的相關(guān)性。這為臨床選擇敏感藥物提供了有效手段。這為臨床選擇敏感藥物提供了有效手段。 4.其他領(lǐng)域其他領(lǐng)域 法醫(yī)鑒定、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面，法醫(yī)鑒定、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面，DNA芯片技術(shù)也將具有極大的潛芯片技術(shù)也將具有極大的潛力。力。核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 核酸分子雜交的基本原理核酸分子雜交的基本原理 具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下 按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。按堿基互補(bǔ)配對(duì)

36、原則退火形成雙鏈的過(guò)程。 雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列稱探針。核酸序列稱探針。 雜交有固一液相雜交和液相雜交。雜交有固一液相雜交和液相雜交。 DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子 一、一、DNA變性與復(fù)性變性與復(fù)性 （一）（一）DNA變性變性 1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^(guò)程，稱氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^(guò)程，稱DNA變性變性2、變性的方法：、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到）熱變性：溫度升高到90100時(shí)，雙鏈核酸時(shí)，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。分子鏈間的氫鍵完

37、全斷裂。 （2）酸堿變性：）酸堿變性：pH值低于值低于3或高于或高于10時(shí)，雙鏈核時(shí)，雙鏈核 酸分子鏈酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。間的氫鍵斷裂。 （3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。3、變性后的理化性質(zhì)變化：、變性后的理化性質(zhì)變化： 粘度降低粘度降低 密度增加密度增加 紫外吸收值增加紫外吸收值增加4、GC含量與含量與Tm值之間的關(guān)系值之間的關(guān)系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3（二）復(fù)性（二）復(fù)性 1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下、定義

38、：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過(guò)程，稱復(fù)按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過(guò)程，稱復(fù)性或雜交。性或雜交。具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成雙鏈：具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸和寡核苷酸/RNA。2、復(fù)性過(guò)程、復(fù)性過(guò)程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離）局部雙鏈周圍的堿基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對(duì)，則形成中心序列）局部雙鏈周圍的堿基如配對(duì)，則形成中心序列（4）

39、形成完整的雙鏈分子）形成完整的雙鏈分子 二、影響雜交的因素二、影響雜交的因素 1、核酸分子的濃度和長(zhǎng)度：、核酸分子的濃度和長(zhǎng)度： 濃度越大，復(fù)性速度越快濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在雙鏈探針，濃度控制在0.10.5g,濃度過(guò)高影響雜濃度過(guò)高影響雜 交效率交效率2、溫度：、溫度： （1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較雜交，適宜溫度較Tm值低值低2025 （2）RNA/DNA或或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低雜交，加甲酰胺降低 Tm值值 （3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度

40、較）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低值低5 3、離子強(qiáng)度：、離子強(qiáng)度： （1）低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜）低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加交率增加 （2）高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)）高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，必須維持雜交行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度 4、甲酰胺：、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸雜交的）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交值，能降低雜交液的溫度，低溫時(shí)探針與待測(cè)核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待液的

41、溫度，低溫時(shí)探針與待測(cè)核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測(cè)核酸與探針同源性不高時(shí)，加測(cè)核酸與探針同源性不高時(shí)，加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3542 雜交雜交 （2）如待測(cè)核酸序列與探針同源性高時(shí)，則用水溶）如待測(cè)核酸序列與探針同源性高時(shí)，則用水溶液在液在68雜交雜交 5、非特異性雜交反應(yīng)：、非特異性雜交反應(yīng)： （1）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對(duì)探針）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對(duì)探針的非特異性吸附的非特異性吸附 （2）常用的封閉物有兩類：即非特異性）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分和高分子化合物。如鮭精子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶

42、粉溶液或脫脂奶粉 第二節(jié)第二節(jié) 核酸分子雜交的方法核酸分子雜交的方法按待測(cè)核酸是否固定在固相支持物上分：按待測(cè)核酸是否固定在固相支持物上分： 固固-液相雜交液相雜交 膜上印跡雜交膜上印跡雜交 原位雜交原位雜交 液相雜交液相雜交 RNA酶保護(hù)分析法酶保護(hù)分析法 核酸酶核酸酶S1保護(hù)分析法保護(hù)分析法 一、一、Southern印跡雜交印跡雜交（一）待測(cè)核酸樣品的制備（一）待測(cè)核酸樣品的制備 1、裂解或破碎細(xì)胞、裂解或破碎細(xì)胞 2、抽取純化基因組、抽取純化基因組DNA 3、限制酶消化、限制酶消化DNA為大小不同的為大小不同的DNA片段片段（二）待測(cè)（二）待測(cè)DNA樣品的電泳分離樣品的電泳分離 1、瓊脂

43、糖濃度：分離大片段用低濃度膠、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠分離小片段用高濃度膠 2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動(dòng)慢泳動(dòng)慢,小分子小分子DNA泳動(dòng)快，泳動(dòng)快， 大小大小 相同的分子處于同一條帶相同的分子處于同一條帶 3、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)Hind消化的消化的DNA，雜交，雜交 所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記 （三）凝膠中核酸的變性（堿變化）（三）凝膠中核酸的變性（堿變化） 凝膠置于凝膠置于NaOH溶液中使溶液中使DNA變性斷裂為較短的變性斷裂為較短的 單鏈單鏈 DNA,中性緩沖液

44、中和凝膠中的緩沖液中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液 （四）（四）Southern印跡印跡 指將電泳分離的指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過(guò)程相支持物上的過(guò)程1、固相支持物的選擇、固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性 具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力 不影響與探針的雜交反應(yīng)不影響與探針的雜交反應(yīng) 與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 具有良好的機(jī)械性能具有良好的機(jī)械性能 非特異吸附少非特異吸附少（2）常用的固相支持物）常用的固相支持物 硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本硝酸纖維素膜：

45、優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本 底低。缺點(diǎn)是底低。缺點(diǎn)是DNA分子結(jié)合不牢固分子結(jié)合不牢固 尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸的能力比硝酸 纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高 化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同 大小的大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能 力較上述兩種膜低力較上述兩種膜低2、Southern印跡的常用方法印跡的常用方法 （1）毛細(xì)管虹吸印跡法）毛細(xì)管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作

46、用，將凝膠中的的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過(guò)濾酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過(guò)濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上片段移出凝膠而滯留在膜上（2）電轉(zhuǎn)法）電轉(zhuǎn)法利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相轉(zhuǎn)移到固相支持物上。支持物上

47、。（3）真空轉(zhuǎn)移法）真空轉(zhuǎn)移法 此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過(guò)凝膠和濾膜抽到下層真空室中，容器中通過(guò)凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上?；蛳跛崂w維素膜上。 （五）（五）Southern雜交雜交 1、預(yù)雜交：封閉膜上能與、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)結(jié)合的位點(diǎn) 預(yù)雜交液為不含預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜

48、交液探針的雜交液 2、雜交：液相中的、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測(cè)探針與膜上的待測(cè)DNA雜交雜交 雙鏈雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交探針需加熱變性為單鏈，再雜交 3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA （六）雜交結(jié)果檢測(cè)（六）雜交結(jié)果檢測(cè) 1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針 2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：適于非核素標(biāo)記的探針、比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：適于非核素標(biāo)記的探針（七）（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 1、酶切圖譜分析、酶切圖譜分析 2、特定基因定性和定

49、量、特定基因定性和定量 3、基因突變分析、基因突變分析 4、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分析、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分析二、二、Northern印跡雜交印跡雜交 1、基本原理和基本過(guò)程與、基本原理和基本過(guò)程與Southern blot基本相同基本相同 2、鑒別、鑒別RNA 3、探針可用、探針可用DNA或或RNA片段片段 4、待測(cè)樣品為總、待測(cè)樣品為總RNA或或mRNANorthern印跡與印跡與Southern 印跡的不同點(diǎn)印跡的不同點(diǎn) 1、變性：、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保 持持RNA處于變性狀態(tài)，處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳電泳前和電泳 中不

50、變性中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern 印跡時(shí)，印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理 3、靶核酸為、靶核酸為RNA三、斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交三、斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交 1、斑點(diǎn)印跡為圓形、斑點(diǎn)印跡為圓形 2、狹縫印跡為線狀、狹縫印跡為線狀 3、鑒別、鑒別DNA、RNA 4、簡(jiǎn)單、快速，同一張膜可檢測(cè)多個(gè)樣品、簡(jiǎn)單、快速，同一張膜可檢測(cè)多個(gè)樣品 5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量、特異性不高、不能鑒別核酸分子量四、原位雜交四、原位雜交 1、定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組、定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測(cè)物分織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測(cè)物分