熒光光譜分析法-課件

1、122008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 下村修現(xiàn)年80歲的下村修1928年出生于日本京都府，1960年獲得名古屋大學(xué)理學(xué)博士學(xué)位后赴美，先后在美國普林斯頓大學(xué)、波士頓大學(xué)和伍茲霍爾海洋生物實(shí)驗(yàn)所工作。他1962年從一種水母中發(fā)現(xiàn)了熒光蛋白，被譽(yù)為生物發(fā)光研究第一人。 馬丁沙爾菲馬丁沙爾菲出生于1947年，現(xiàn)年61歲，是美國哥倫比亞大學(xué)生物學(xué)教授。他獲獎(jiǎng)的主要貢獻(xiàn)在于向人們展示了綠色熒光蛋白作為發(fā)光的遺傳標(biāo)簽的作用，這一技術(shù)被廣泛運(yùn)用于生理學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。 瑞典皇家科學(xué)院8日宣布，美籍華裔科學(xué)家錢永健、美國生物學(xué)家馬丁沙爾菲和日本有機(jī)化學(xué)家兼海洋生物學(xué)家下村修共同獲得2008年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，將均分1000

2、萬瑞典克朗（約合140萬美元）獎(jiǎng)金。幫助他們獲獎(jiǎng)的是綠色熒光蛋白。這種蛋白為生物與醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)帶來革命，它發(fā)出的熒光像一盞明燈，幫助研究人員照亮生命體在分子層面和細(xì)胞層面的諸多反應(yīng)。 由于綠色熒光蛋白用紫外線一照就發(fā)出鮮艷綠光，研究人員將綠色熒光蛋白基因插入動(dòng)物、細(xì)菌或其他細(xì)胞的遺傳信息之中，讓其隨著這些需要跟蹤的細(xì)胞復(fù)制，可“照亮”不斷長大的癌癥腫瘤、跟蹤阿爾茨海默氏癥對(duì)大腦造成的損害、觀察有害細(xì)菌的生長，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何產(chǎn)生分泌胰島素的細(xì)胞。 34用熒光抗體染色之用熒光抗體染色之原生動(dòng)物原生動(dòng)物澳大利亞科學(xué)家最新發(fā)現(xiàn)澳大利亞科學(xué)家最新發(fā)現(xiàn)，一種叫，一種叫“螳螂蝦螳螂蝦”的海的海里動(dòng)

3、物通過發(fā)出色彩鮮艷里動(dòng)物通過發(fā)出色彩鮮艷的熒光來恐嚇警告敵對(duì)者的熒光來恐嚇警告敵對(duì)者或者吸引性配偶，或者吸引性配偶，5K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 23061 nmgreen-fluorescent protein (GFP)6第五章第五章 熒光熒光分析法分析法第一節(jié)第一節(jié) 第二節(jié)第二節(jié) 熒光定量分析方法熒光定量分析方法第三節(jié)第三節(jié) 熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)7 某些物質(zhì)受到光照射，除吸收某種波長的光之外，發(fā)射出某些物質(zhì)受到光照射，除吸收某種波長的光之外，發(fā)射出比原來所吸收光的波長更長的光比原來所吸收光的波長更長的光光致發(fā)光光致發(fā)光（二級(jí)光）。（二級(jí)光）。光

4、致發(fā)光光致發(fā)光熒光熒光 fluorescence 磷光磷光 phosphorescence 熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線的位置熒光譜線的位置及其及其強(qiáng)度強(qiáng)度進(jìn)進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的儀器方法。行物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的儀器方法。 8分子熒光分析的特點(diǎn)：分子熒光分析的特點(diǎn)：1. 靈敏度靈敏度高：高：一般紫外一可見分光光度法的檢出一般紫外一可見分光光度法的檢出限約為限約為10-7g/ml，而熒光分析法的檢出限可達(dá)到而熒光分析法的檢出限可達(dá)到10-10甚至甚至10-12 g/ml。2. 選擇性選擇性好好3. 線性范圍線性范圍寬寬4. 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍窄窄91. 分子熒光的產(chǎn)生分子

5、熒光的產(chǎn)生一、分子熒光一、分子熒光 molecular fluorescence分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜在在分子體系中，分子體系中，每個(gè)電子能級(jí)上都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)每個(gè)電子能級(jí)上都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)室溫下大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動(dòng)能層室溫下大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動(dòng)能層在基態(tài)時(shí)，含有偶數(shù)個(gè)電子的分子，電子的在基態(tài)時(shí)，含有偶數(shù)個(gè)電子的分子，電子的ms為為+1/2和和-1/2, s=0，M=1。則該分子所處的電子能態(tài)稱為則該分子所處的電子能態(tài)稱為基態(tài)單重態(tài)基態(tài)單重態(tài),用符號(hào)用符號(hào)S0表示表示10分子吸收輻射后分子吸收輻射后電子被激發(fā)且不發(fā)生自旋方向的改變電子被激發(fā)且不發(fā)生

6、自旋方向的改變ms為為+1/2和和-1/2, s=0，M=1。則該分子所處的電子能態(tài)稱為則該分子所處的電子能態(tài)稱為激發(fā)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài),用符號(hào)用符號(hào)S表示。表示。 （S1 S2 S3）電子被激發(fā)且伴隨著自旋方向的改變電子被激發(fā)且伴隨著自旋方向的改變ms為為+1/2和和+1/2, s=1，M=3。則該分子所處的電子能態(tài)稱為則該分子所處的電子能態(tài)稱為激發(fā)三重態(tài)激發(fā)三重態(tài),用符號(hào)用符號(hào)T表示。（表示。（T1 T2 T3）S011 小結(jié)：分子能級(jí)與躍遷小結(jié)：分子能級(jí)與躍遷 基態(tài)基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷 一次到位；一次到位； 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)

7、基態(tài)：多種途徑和方式基態(tài)：多種途徑和方式(見能級(jí)圖見能級(jí)圖)；速度最快、激；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)，發(fā)生的幾率大；發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)，發(fā)生的幾率大； 第一、第二、第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài)電子激發(fā)單重態(tài) S1 、S2 ； 第一、第二、第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài)電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2 ；電子能級(jí)的多重性電子能級(jí)的多重性 M=2S+1 平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定( (洪特規(guī)則洪特規(guī)則) )，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；單重態(tài)能級(jí)低； 大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)； 12S0S1、S2 允許躍遷；允許

8、躍遷；S0T1、T2 禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級(jí)圖見能級(jí)圖)；進(jìn)入的幾率?。贿M(jìn)入的幾率??； 小結(jié)：激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的不同小結(jié)：激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的不同 激發(fā)單重態(tài)分子中沒有凈電子自旋，因而具有反磁性；激發(fā)單重態(tài)分子中沒有凈電子自旋，因而具有反磁性；激發(fā)三重態(tài)有激發(fā)三重態(tài)有2個(gè)自旋平行電子，是順磁性的個(gè)自旋平行電子，是順磁性的 激發(fā)單重態(tài)分子平均壽命短（激發(fā)單重態(tài)分子平均壽命短（10-810-6s），），而激發(fā)三重態(tài)而激發(fā)三重態(tài)的長（的長（10-410s） 基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)，不涉及電子自旋方向的基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)，不涉及電子自旋方

9、向的改變而容易發(fā)生，屬于允許躍遷；而到激發(fā)三重態(tài)屬于禁阻改變而容易發(fā)生，屬于允許躍遷；而到激發(fā)三重態(tài)屬于禁阻躍遷躍遷S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l l 2l l 1l l 4 外轉(zhuǎn)換l l 3 3T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫14激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑基態(tài)的能量傳遞途徑 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷躍遷( (發(fā)光發(fā)光) )和無輻射躍遷等方式失去能量；和無輻射躍遷等方式失去能量；熒光延遲熒光磷光輻射躍遷輻射躍遷無輻射躍遷無輻射躍遷傳遞途徑傳遞途徑內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫熒

10、光熒光：10-710-9s，第一激發(fā)第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)基態(tài)磷光磷光：10-410s； 第一激發(fā)第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)基態(tài)15輻射和輻射和非輻射能量傳遞過程非輻射能量傳遞過程振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫：同一同一電子能級(jí)中，以電子能級(jí)中，以熱能量交換形式由高振動(dòng)能熱能量交換形式由高振動(dòng)能層至低相鄰振動(dòng)能層間的躍遷層至低相鄰振動(dòng)能層間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間1010-12-12s s內(nèi)轉(zhuǎn)換：內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的電子能級(jí)間的相同多重態(tài)的電子能級(jí)間的等能級(jí)的無輻射躍遷等能級(jí)的無輻射躍遷。 通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子

11、躍回第一激通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的時(shí)間發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的時(shí)間10-13s。熒光發(fā)射：熒光發(fā)射：電子由電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能層第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能層基態(tài)基態(tài)( 熒光多為熒光多為 S1 S0躍遷躍遷)，發(fā)射波長為發(fā)射波長為 l l3的熒光，的熒光，10-710-9s 。 發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長：發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長： l l3 l l 2 l l 1 ；系間跨越：系間跨越：激發(fā)態(tài)的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)激發(fā)態(tài)的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的生

12、變化的非輻射躍遷非輻射躍遷。 禁阻躍遷，但當(dāng)能層有較大重疊時(shí)禁阻躍遷，但當(dāng)能層有較大重疊時(shí)S1T1 就可發(fā)生系間就可發(fā)生系間跨越，通過自旋跨越，通過自旋軌道耦合進(jìn)行。軌道耦合進(jìn)行。 10-6s 外轉(zhuǎn)換：外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子之間碰撞引起的激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子之間碰撞引起的轉(zhuǎn)移能量的轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷非輻射躍遷。常發(fā)生在。常發(fā)生在S1或或 T1 S0 外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅猝滅”。 磷光發(fā)射：磷光發(fā)射：電子電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)基態(tài)(T1 S0躍遷躍遷)；發(fā)光速度很發(fā)光速度很慢慢： 10-4

13、100s、磷光的磷光的能量比熒光小能量比熒光小 電子由電子由S0進(jìn)入進(jìn)入T1的過程：（的過程：（ S0 T1禁阻躍遷）禁阻躍遷） S0激發(fā)激發(fā)振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移內(nèi)轉(zhuǎn)移系間跨越系間跨越振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫 T1 光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間172. 熒光的激發(fā)光譜與熒光光譜熒光的激發(fā)光譜與熒光光譜excitation spectrum and fluorescence spectrum（1 1）熒光的激發(fā)光譜熒光的激發(fā)光譜 激發(fā)光譜：激發(fā)光譜：表示表示不同激發(fā)波長不同激發(fā)波長下所引起物質(zhì)下所引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光發(fā)射某一波長熒光的的相對(duì)效率。相對(duì)效率。 繪制激發(fā)光譜：繪

14、制激發(fā)光譜：固定固定發(fā)射發(fā)射波長波長( (選最大發(fā)射波長選最大發(fā)射波長),),然后以不同波長的然后以不同波長的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，以入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，以熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度F對(duì)對(duì)激發(fā)波長激發(fā)波長l l作圖作圖，即為激發(fā)光譜。，即為激發(fā)光譜。熒光分子都具有兩個(gè)特征光譜：熒光分子都具有兩個(gè)特征光譜：激發(fā)光譜激發(fā)光譜和和發(fā)射光譜（熒光光發(fā)射光譜（熒光光譜）譜）。 激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大，稱為度最大，稱為最大激發(fā)波長最大激發(fā)波長 l lex（2）熒光的發(fā)射光譜（熒光光譜）熒光的發(fā)射光譜（熒光光譜） 熒光光譜表示在所發(fā)射的

15、熒光中各種波長組分的相對(duì)強(qiáng)熒光光譜表示在所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對(duì)強(qiáng)度。繪制發(fā)射光譜時(shí)，度。繪制發(fā)射光譜時(shí)， 使激發(fā)光波長使激發(fā)光波長固定在固定在l lex處處，然后對(duì)發(fā)，然后對(duì)發(fā)射光譜掃描，測(cè)定各種波長下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，射光譜掃描，測(cè)定各種波長下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，以以熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度F 對(duì)發(fā)射波長對(duì)發(fā)射波長l l作圖作圖，得發(fā)射光譜圖（即熒光光譜）。，得發(fā)射光譜圖（即熒光光譜）。發(fā)射光譜（熒光光譜）的位置？發(fā)射光譜（熒光光譜）的位置？磷光光譜的位置？磷光光譜的位置？200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜磷光光譜室溫下菲的乙

16、醇溶液熒（磷）光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜20激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系 a. Stokes位移位移 熒光光譜總是位于物質(zhì)熒光光譜總是位于物質(zhì)激發(fā)光譜的長波一側(cè)，即熒光波激發(fā)光譜的長波一側(cè)，即熒光波長大于激發(fā)光波長的現(xiàn)象。長大于激發(fā)光波長的現(xiàn)象。 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值： 振動(dòng)弛豫、外轉(zhuǎn)換等無輻射躍遷損失了部分能量。振動(dòng)弛豫、外轉(zhuǎn)換等無輻射躍遷損失了部分能量。 b. 熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) 電子可以躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長的能量電子可以躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長的能量(

17、如能級(jí)圖如能級(jí)圖l l 2 、l l 1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但熒光光譜卻只有一，產(chǎn)生不同吸收帶，但熒光光譜卻只有一個(gè)發(fā)射態(tài)，如個(gè)發(fā)射態(tài)，如l l 3 。 為什么？為什么？21c c. . 鏡像規(guī)則鏡像規(guī)則 由于電子基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布與激發(fā)態(tài)相似，由于電子基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布與激發(fā)態(tài)相似，故通常故通常熒光光譜與它的激發(fā)光譜成鏡像對(duì)稱關(guān)系。熒光光譜與它的激發(fā)光譜成鏡像對(duì)稱關(guān)系。各小峰波長各小峰波長遞減值與遞減值與振振動(dòng)能級(jí)差動(dòng)能級(jí)差有有關(guān)，各小峰關(guān)，各小峰的高度與的高度與躍躍遷幾率遷幾率有關(guān)。有關(guān)。 基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)振動(dòng)能級(jí)分布類似

18、能級(jí)分布類似； 基態(tài)上的某振動(dòng)能級(jí)若躍遷到第一激發(fā)態(tài)的某振動(dòng)能基態(tài)上的某振動(dòng)能級(jí)若躍遷到第一激發(fā)態(tài)的某振動(dòng)能級(jí)的幾率較大的話，級(jí)的幾率較大的話，相反躍遷也如此相反躍遷也如此。 23二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 relation between fluorescence and molecular structure 1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。 熒光量子產(chǎn)率（熒光量子產(chǎn)率（ ）：）：吸收的光量子數(shù)發(fā)射的光量子數(shù)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率范圍一般是多

19、少?如果一個(gè)分子將吸收的光子全部釋放，則其量子產(chǎn)率為如果一個(gè)分子將吸收的光子全部釋放，則其量子產(chǎn)率為100%100%。242.有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（1）躍遷類型：* 的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電子基，使熒光增強(qiáng)。（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。2526三、影響熒光強(qiáng)度的因素三、影響熒光強(qiáng)度的因素 relation between fluo

20、rescence and molecular structure 影響熒光強(qiáng)度的影響熒光強(qiáng)度的外部因素外部因素1.溶劑的影響溶劑的影響 同一物質(zhì)在不同溶劑中，其熒光光譜的形狀和強(qiáng)度都有差別。同一物質(zhì)在不同溶劑中，其熒光光譜的形狀和強(qiáng)度都有差別。一般情況下，熒光波長隨著溶劑極性的增大而長移，熒光強(qiáng)度也有一般情況下，熒光波長隨著溶劑極性的增大而長移，熒光強(qiáng)度也有所增強(qiáng)。這是因?yàn)樵跇O性溶劑中，所增強(qiáng)。這是因?yàn)樵跇O性溶劑中，*躍遷所需的能量差躍遷所需的能量差E小，小，而且躍遷幾率增加，從而使紫外吸收波長和熒光波長均長移，強(qiáng)度而且躍遷幾率增加，從而使紫外吸收波長和熒光波長均長移，強(qiáng)度也增強(qiáng)。也增強(qiáng)。 溶

21、劑溶劑粘度粘度減小時(shí)，可以增加分子間碰撞機(jī)會(huì)，使無輻射躍遷增減小時(shí)，可以增加分子間碰撞機(jī)會(huì)，使無輻射躍遷增加而熒光減弱。故熒光強(qiáng)度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對(duì)加而熒光減弱。故熒光強(qiáng)度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對(duì)溶劑的粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此溫度上溶劑的粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此溫度上升，熒光強(qiáng)度下降。升，熒光強(qiáng)度下降。272.溫度的影響溫度的影響 熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，分子運(yùn)動(dòng)速度加熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，分子間碰撞的幾率增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光快，分子間碰撞的幾率增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，

22、熒光效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液，在效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液，在0以下，溫度每降以下，溫度每降低低10， f增加增加3，在，在 80時(shí)，時(shí)， f為為1。28 當(dāng)熒光物質(zhì)本身是當(dāng)熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿弱酸或弱堿時(shí)，溶液的時(shí)，溶液的pH值對(duì)該熒光物質(zhì)的值對(duì)該熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度有較大影響，這主要是因?yàn)樵诓煌岫戎蟹肿雍碗x子間的熒光強(qiáng)度有較大影響，這主要是因?yàn)樵诓煌岫戎蟹肿雍碗x子間的平衡改變，離子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此熒光強(qiáng)度也有差異。每一種熒平衡改變，離子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此熒光強(qiáng)度也有差異。每一種熒光物質(zhì)都有它最適宜的發(fā)射熒光的存在形式，也就是有它最適宜的光物質(zhì)都有它最適宜的發(fā)射熒光的存

23、在形式，也就是有它最適宜的pH值范圍。例如苯胺在不同值范圍。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡關(guān)系：值下有下列平衡關(guān)系：苯胺在苯胺在pH712的溶液中主要以分子形式存在，由于的溶液中主要以分子形式存在，由于 NH2為為提高熒提高熒光效率光效率的取代基，故苯胺分子會(huì)發(fā)生藍(lán)色熒光。但在的取代基，故苯胺分子會(huì)發(fā)生藍(lán)色熒光。但在pH2和和pH13的溶液中均以苯胺離子形式存在，故不能發(fā)射熒光。的溶液中均以苯胺離子形式存在，故不能發(fā)射熒光。 3. 溶液溶液pH 對(duì)酸堿化合物，溶液對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；的影響較大，需要嚴(yán)格控制；294.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象 自吸現(xiàn)

24、象自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收 光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。 內(nèi)濾光作用內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā) 射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；305.熒光熄滅劑熒光熄滅劑 熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑熒光熄滅劑(quench

25、ing medium)。如如鹵素離子鹵素離子、重金屬離子重金屬離子、氧分子氧分子以及以及硝基化合物硝基化合物、重氮化合物重氮化合物、羰基羰基和和羧基化合羧基化合物物均為常見的熒光熄滅劑。均為常見的熒光熄滅劑。316、散射光、散射光 小部分光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生小部分光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同角度散射。改變而向不同角度散射。瑞利光：瑞利光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只是光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變。其波長與入射光波長相同。是光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變。其波長與入射光波長相同。拉曼光：拉曼光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈

26、性碰撞，發(fā)生能量交換，光子光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從而發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光。而發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光。散射光對(duì)熒光測(cè)定有干擾，散射光對(duì)熒光測(cè)定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光的拉曼光，與熒光波長接近，對(duì)測(cè)定的干擾大，必須采取，與熒光波長接近，對(duì)測(cè)定的干擾大，必須采取措施消除。措施消除。拉曼光的干擾主要來拉曼光的干擾主要來自溶劑自溶劑，當(dāng)溶劑的拉曼光，當(dāng)溶劑的拉曼光與被測(cè)物質(zhì)的熒光光譜相重疊時(shí)，應(yīng)更換溶劑或改變激發(fā)與被測(cè)物質(zhì)的熒

27、光光譜相重疊時(shí)，應(yīng)更換溶劑或改變激發(fā)光波長光波長32選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長可消除拉曼光的干擾選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長可消除拉曼光的干擾a:320nm或350nm為激發(fā)光，熒光峰總是在448nm。 b:將空白溶劑分別在320nm及350nm激發(fā)光照射下測(cè)定熒光，激發(fā)光波長為320nm時(shí)，拉曼光波長是360nm，360nm的拉曼光對(duì)熒光無影響；當(dāng)激發(fā)光波長為350nm時(shí)，拉曼光波長是400nm，400nm的拉曼光對(duì)熒光有干擾，因而影響測(cè)定結(jié)果。 硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光與散射光譜硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光與散射光譜 33四、四、熒光熒光試劑試劑 熒光試劑熒光試劑是一種可以使非熒光物質(zhì)或弱熒光物質(zhì)與

28、其反是一種可以使非熒光物質(zhì)或弱熒光物質(zhì)與其反應(yīng)之后，得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物的標(biāo)記物，從而可擴(kuò)大熒光分析應(yīng)之后，得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物的標(biāo)記物，從而可擴(kuò)大熒光分析法的使用范圍法的使用范圍1.1.有機(jī)化合物的熒光分析有機(jī)化合物的熒光分析 脂肪族化合物能產(chǎn)生熒光的為數(shù)不多。芳香族及具有芳香脂肪族化合物能產(chǎn)生熒光的為數(shù)不多。芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物，因存在共軛體系而容易吸收光能，在紫外光照結(jié)構(gòu)的化合物，因存在共軛體系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能發(fā)射熒光。有時(shí)為了提高測(cè)定的靈敏度和選擇性，射下很多能發(fā)射熒光。有時(shí)為了提高測(cè)定的靈敏度和選擇性，常使弱熒光性物質(zhì)與某些熒光試劑作用，以得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物常使弱熒

29、光性物質(zhì)與某些熒光試劑作用，以得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物( (衍生化衍生化) )。因此，熒光分析法在有機(jī)物測(cè)定方面的應(yīng)用很廣。因此，熒光分析法在有機(jī)物測(cè)定方面的應(yīng)用很廣。34 能用熒光分析法測(cè)定的有機(jī)物包括多環(huán)胺類、萘酚類、嘌呤類、能用熒光分析法測(cè)定的有機(jī)物包括多環(huán)胺類、萘酚類、嘌呤類、吲哚類、多環(huán)芳烴類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的吲哚類、多環(huán)芳烴類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸類及蛋白質(zhì)氨基酸類及蛋白質(zhì)等；藥物中的生物堿類如麥角堿、蛇根堿、麻黃堿、嗎啡、喹啉類等；藥物中的生物堿類如麥角堿、蛇根堿、麻黃堿、嗎啡、喹啉類及異喹啉類生物堿等；及異喹啉類生物堿等；甾體類如皮質(zhì)激素及雌醇等甾體類如皮質(zhì)激素及雌醇等；

30、抗生素類如青抗生素類如青霉素、四環(huán)素等霉素、四環(huán)素等；維生素類如維生素維生素類如維生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗抗壞血酸壞血酸、葉酸及煙酰胺等、葉酸及煙酰胺等。此外，。此外，中草藥中的許多有效成分中草藥中的許多有效成分，不少，不少是屬于芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類，都能產(chǎn)生熒光，可用熒光分析是屬于芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類，都能產(chǎn)生熒光，可用熒光分析法作初步鑒別及含量測(cè)定。熒光分析法的靈敏度高，選擇性較好，法作初步鑒別及含量測(cè)定。熒光分析法的靈敏度高，選擇性較好，取樣量少，方法快速，已成為醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域取樣量少，方法快速，已成為醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域進(jìn)行科學(xué)研究

31、工作的重要手段之一。以下是幾個(gè)重要的熒光試劑：進(jìn)行科學(xué)研究工作的重要手段之一。以下是幾個(gè)重要的熒光試劑： 1熒光胺熒光胺(fluorescamine)：能與脂肪族或芳香族伯胺類形成高度熒能與脂肪族或芳香族伯胺類形成高度熒光衍生物，典型反應(yīng)如下：光衍生物，典型反應(yīng)如下：熒光胺及其水解產(chǎn)物不顯熒光。熒光胺及其水解產(chǎn)物不顯熒光。100mg熒光胺溶于熒光胺溶于100ml無無水丙酮中，放置水丙酮中，放置24小時(shí)后即可使用。取相當(dāng)于小時(shí)后即可使用。取相當(dāng)于10mg藥物的甲醇或藥物的甲醇或水溶液水溶液0.lml，加適宜加適宜pH值的磷酸緩沖溶液值的磷酸緩沖溶液5ml，加熒光胺試劑加熒光胺試劑0.lml，混合

32、，放置混合，放置15分鐘后測(cè)定熒光強(qiáng)度。熒光條件為：分鐘后測(cè)定熒光強(qiáng)度。熒光條件為：ex=275、390nm，em=480nm。362鄰苯二甲醛鄰苯二甲醛(OPA) 在在2 巰基乙醇存在下，巰基乙醇存在下，pH910的緩沖溶液中的緩沖溶液中OPA能能與伯胺類、特別是除半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的與伯胺類、特別是除半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的a 氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。取氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。取OPA 500mg溶于溶于10ml乙醇乙醇中，加中，加200ml 2 巰基乙醇，將此混合液加至巰基乙醇，將此混合液加至1L 3的硼酸的硼酸溶液中，再用溶液中，再用KOH調(diào)節(jié)至調(diào)節(jié)至pH10，即為

33、常用試劑溶液。熒即為常用試劑溶液。熒光條件為：光條件為：ex=340nm，em=455nm。3731 二甲氨基二甲氨基 5 氯化磺酰萘氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯丹酰氯) 能與伯胺、仲胺及酚基的生物堿類反應(yīng)生成熒光性產(chǎn)物。能與伯胺、仲胺及酚基的生物堿類反應(yīng)生成熒光性產(chǎn)物。取取50mg或或100mg試劑，溶解于試劑，溶解于500ml無水丙酮中即可使用。無水丙酮中即可使用。與丹酰氯類似的一個(gè)試劑是丹酰肼與丹酰氯類似的一個(gè)試劑是丹酰肼(DansylNHNH2)，它能它能與可的松的羰基縮合，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。熒光條件為：與可的松的羰基縮合，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。熒光條件為：ex=365nm，em=500

34、nm左右。左右。 丹酰氯試劑不穩(wěn)定，其水解產(chǎn)物丹酰氯試劑不穩(wěn)定，其水解產(chǎn)物Dansyl OH呈藍(lán)色熒光呈藍(lán)色熒光，必須，必須暗處保存暗處保存，每周重，每周重新配新配制。制。382.2.生物與有機(jī)化合物的分析生物與有機(jī)化合物的分析39 無機(jī)離子一般不顯熒光，無機(jī)離子一般不顯熒光，與有機(jī)試劑形與有機(jī)試劑形成有熒光的成有熒光的配配合物后合物后，可測(cè)量約可測(cè)量約6060種元素種元素及離子及離子 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土采用熒光分析法采用熒光分析法 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定采用熒光熄滅法測(cè)定 銅、鐵、鈷、鋨及過氧化氫銅、鐵、鈷、鋨及過

35、氧化氫采用催化熒光法測(cè)定采用催化熒光法測(cè)定 鉻、鈮、鈾、碲鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定采用低溫?zé)晒夥y(cè)定 鈰、銪、銻、釩、鈾鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定采用固體熒光法測(cè)定2.無機(jī)化合物的分析無機(jī)化合物的分析40第第二二節(jié)節(jié) 熒光熒光定量分析方法定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系 當(dāng)一束強(qiáng)度為當(dāng)一束強(qiáng)度為I0的紫外的紫外/可見光照射一濃度為可見光照射一濃度為c、液層厚液層厚度為度為d的液槽時(shí)，可在溶液的的液槽時(shí)，可在溶液的各個(gè)方向各個(gè)方向觀察到熒光，其觀察到熒光，其 由于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)占被分析物的數(shù)量相當(dāng)有限，由于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)占被分析物的數(shù)量相

36、當(dāng)有限，且就這少量的熒光物質(zhì)幾乎在同一波長段產(chǎn)生光致發(fā)光，且就這少量的熒光物質(zhì)幾乎在同一波長段產(chǎn)生光致發(fā)光，所以熒光法所以熒光法很少用來定性分析很少用來定性分析 吸收光強(qiáng)度為吸收光強(qiáng)度為Ia透過光強(qiáng)度為透過光強(qiáng)度為It熒光強(qiáng)度為熒光強(qiáng)度為FI0It IaF垂直方向垂直方向（= I0 - It ）熒光強(qiáng)度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強(qiáng)度IaF = K(I0 It) K K ：取決于熒光效率取決于熒光效率 f f根據(jù)根據(jù)Beer Law=10- clItI0F = K(I0 - I0 10- c l ) = KI0(1- 10- c l ) = KI0(1- e2.

37、303 c l )由于由于 ex =1+x+x2/2!+x3/3!+xn/n!所以所以 e-2.3 c l =1 - 2.3 cl + (-2.3 cl) 2/2!+ (-2.3 cl) 3/3!+e-2.3 c l =1 - 2.3 cl e-2.3 cl =1 - 2.3 cl 代入代入 F = KI0(1- e2.303 cl )F = KI0(1- 1+2.3 c l ) =2.3 K I0 l c 當(dāng)熒光效率當(dāng)熒光效率 f f 、入射光強(qiáng)度、入射光強(qiáng)度I0、物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù) 、液層厚度液層厚度b 均固定不變時(shí)，均固定不變時(shí)，熒光強(qiáng)度正比于該溶液的濃度熒光強(qiáng)度正比于

38、該溶液的濃度F = K c 熒光定量分熒光定量分析的依據(jù)析的依據(jù) 熒光強(qiáng)度可以在很弱的背景下被檢測(cè)，熒光強(qiáng)度可以在很弱的背景下被檢測(cè)，這完全取決于檢測(cè)器的靈敏度，也是熒光分這完全取決于檢測(cè)器的靈敏度，也是熒光分析方法靈敏度高的原因析方法靈敏度高的原因43二、定量分析方法二、定量分析方法1.1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣，測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣，測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制F-c的標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在準(zhǔn)校正曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣的濃度2. 比較法比較法 在線性范圍內(nèi)，

39、測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較之在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較之空白調(diào)空白調(diào)0，標(biāo)品調(diào)，標(biāo)品調(diào)100%或或50%44第第三三節(jié)節(jié) 熒光熒光分光光度計(jì)分光光度計(jì)四個(gè)部分四個(gè)部分激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器特殊點(diǎn)特殊點(diǎn)有有兩個(gè)單色器兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成，光源與檢測(cè)器通常成直角直角單色器單色器：選擇激發(fā)光波長的選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光第一單色器和選擇發(fā)射光( (測(cè)測(cè)量量) )波長的第二單色器波長的第二單色器光源光源：氙燈、氙燈、高壓汞燈高壓汞燈、激激光器光器( (可見與紫外區(qū)可見與紫外區(qū)) )檢測(cè)器檢測(cè)器：光電倍增

40、管光電倍增管45熒光光譜（熒光光譜（fluorecence spectrum）：）：固定激發(fā)固定激發(fā)光波長為最大激發(fā)波長光波長為最大激發(fā)波長，而讓熒光物質(zhì)發(fā)射的，而讓熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光通過發(fā)射單色器分光掃描并檢測(cè)不同波長熒光通過發(fā)射單色器分光掃描并檢測(cè)不同波長下的熒光強(qiáng)度，以發(fā)射波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)下的熒光強(qiáng)度，以發(fā)射波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，得到物質(zhì)的熒光光譜。度為縱坐標(biāo)作圖，得到物質(zhì)的熒光光譜。熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長（熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長（l lex）和最大）和最大發(fā)射波長發(fā)射波長（l lem）是鑒定物質(zhì)的根據(jù)；也是定是鑒定物質(zhì)的根據(jù)；也是定量測(cè)定最為靈敏的條件。量測(cè)定最為靈敏

41、的條件。4647熒光光譜的普遍特性熒光光譜的普遍特性1.斯托克斯位移斯托克斯位移(Stokes shift): 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值；熒光發(fā)；熒光發(fā)射波長總是大于激發(fā)光譜波長。射波長總是大于激發(fā)光譜波長。室溫下菲的乙醇溶液熒光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒光光譜482.熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，從而熒光重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)

42、，從而熒光發(fā)射光譜只有一個(gè)發(fā)射帶，而且熒光光譜的形狀發(fā)射光譜只有一個(gè)發(fā)射帶，而且熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。與激發(fā)波長無關(guān)。3.熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系熒光光譜的普遍特性熒光光譜的普遍特性激發(fā)光譜與熒光光譜成對(duì)稱鏡像關(guān)系。激發(fā)光譜與熒光光譜成對(duì)稱鏡像關(guān)系。49nm200280360440520020406080100Fab4b3b2b1b0c0c1c2c3c4蒽的激發(fā)光譜（虛線）蒽的激發(fā)光譜（虛線）熒光光譜（實(shí)線）熒光光譜（實(shí)線）蒽的能級(jí)躍遷蒽的能級(jí)躍遷V=0V=1V=2V=3V=4V=0V=1V=2V=3V=4b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4E4E3

43、E2E1E4E3E2E10S 1S50KtteFF 0fKeFeF 00/fKee /11 fKfK1 KtteFF /0fttFF 0ln二、熒光與分子結(jié)構(gòu)二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率（一）熒光壽命和熒光效率熒光壽命熒光壽命(fluorescence lift time)：當(dāng)除去激發(fā)光當(dāng)除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間，用所需的時(shí)間，用f表示。表示。以以tFF0ln對(duì)對(duì)t t作圖，斜率即為作圖，斜率即為f151吸收激發(fā)光的光子數(shù)發(fā)射熒光的光子數(shù) f熒光效率熒光效率（fluorescence efficie

44、ncy):指激發(fā)態(tài)指激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的分子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)分子發(fā)射熒光的分子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的光子數(shù)之比，常用光的光子數(shù)之比，常用f表示。表示。熒光效率與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和所處的化學(xué)環(huán)境熒光效率與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和所處的化學(xué)環(huán)境條件有關(guān)。條件有關(guān)。52（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系物質(zhì)產(chǎn)生熒光必須具備的條件：物質(zhì)產(chǎn)生熒光必須具備的條件：（1）物質(zhì)的）物質(zhì)的分子必須具有能夠吸收紫外和較短分子必須具有能夠吸收紫外和較短波長可見光的結(jié)構(gòu)波長可見光的結(jié)構(gòu)（2）物質(zhì)）物質(zhì)必須具有較大的熒光效率必須具有較大的熒光效率531.1.長共軛結(jié)構(gòu)（芳香族化合物）長

45、共軛結(jié)構(gòu)（芳香族化合物） 共軛度越大，熒光效率越大，熒光波長長移共軛度越大，熒光效率越大，熒光波長長移emlf205nm278nm286nm321nm356nm404nm0.110.290.36exl542.2.分子的剛性分子的剛性分子剛性越強(qiáng)，分子振動(dòng)少，與其它分子碰分子剛性越強(qiáng)，分子振動(dòng)少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高，熒撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高，熒光長移。光長移。2 . 0 f0 . 1 f553.3.取代基取代基給電子基團(tuán)使熒光增強(qiáng)；熒光波長長移。給電子基團(tuán)使熒光增強(qiáng)；熒光波長長移。吸電子基團(tuán)會(huì)減弱甚至破壞熒光。吸電子基團(tuán)會(huì)減弱甚至破壞熒光。同同 電子體系相

46、互作用小的取代基對(duì)熒光影響電子體系相互作用小的取代基對(duì)熒光影響不明顯。不明顯。56（三）熒光試劑（三）熒光試劑1.1.熒光胺熒光胺nm390275、 exlnmem455 lnm340 exl2.2.鄰苯二甲醛鄰苯二甲醛( (OPA) )nmem480 lnm365 exlnmem500 l3.1-3.1-二甲氨基二甲氨基5 5氯化磺酰萘氯化磺酰萘4.4.測(cè)定無機(jī)離子的熒光試劑測(cè)定無機(jī)離子的熒光試劑57三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素溫度增加，熒光效率和熒光強(qiáng)度下降。溫度增加，熒光效率和熒光強(qiáng)度下降。1.溫度溫度2.溶劑溶劑*躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)，熒光波長也躍遷幾率

47、增加，熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)，熒光波長也發(fā)生紅移；溶劑粘度降低，熒光強(qiáng)度降低。發(fā)生紅移；溶劑粘度降低，熒光強(qiáng)度降低。583.酸度酸度NH3+OH-H+NH2NH-OH-H+pH 34pH 6759熒光猝滅：熒光猝滅：熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。象稱為熒光猝滅。熒光熄滅劑：熒光熄滅劑：能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)。4.熒光熄滅劑熒光熄滅劑碰撞猝滅碰撞猝滅 M+hvM*,M*+Q M+熱熱靜態(tài)猝滅靜態(tài)猝滅 M+Q MQ 非熒光物質(zhì)非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅轉(zhuǎn)入三重態(tài)

48、的猝滅 三重態(tài)三重態(tài)熒光物質(zhì)的自猝滅熒光物質(zhì)的自猝滅 熒光物質(zhì)濃度較高熒光物質(zhì)濃度較高導(dǎo)致熒光熄滅的原因：導(dǎo)致熒光熄滅的原因：60熒光熄滅法熒光熄滅法: : 熒光物質(zhì)加入某些猝滅劑后，其熒熒光物質(zhì)加入某些猝滅劑后，其熒光強(qiáng)度的減少與熒光猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系，光強(qiáng)度的減少與熒光猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系，可用于測(cè)定猝滅劑的含量，這種方法稱為熒光熄可用于測(cè)定猝滅劑的含量，這種方法稱為熒光熄滅法。滅法。5.5.散射光散射光瑞利光：瑞利光：光子與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生光子與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，運(yùn)動(dòng)方向改變；能量交換，運(yùn)動(dòng)方向改變；瑞利光瑞利光入射光入射光拉曼光：拉曼光：光子與物質(zhì)

49、分子發(fā)生非彈性碰撞，發(fā)光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，發(fā)生生能量交換，運(yùn)動(dòng)方向改變；能量交換，運(yùn)動(dòng)方向改變；拉曼光拉曼光入射光入射光61320360448激發(fā)激發(fā) 320nm硫酸奎寧硫酸奎寧350448激發(fā)激發(fā) 350nm硫酸奎寧硫酸奎寧320360激發(fā)激發(fā) 320nm0.1mol/L硫酸硫酸350400激發(fā)激發(fā) 350nm0.1mol/L硫酸硫酸a.強(qiáng)度強(qiáng)度b.強(qiáng)度強(qiáng)度硫酸奎寧在不同激發(fā)波長下的熒光（硫酸奎寧在不同激發(fā)波長下的熒光（a）與拉曼光譜（）與拉曼光譜（b）62溶劑溶劑激發(fā)光激發(fā)光(nm) 248 313 365 405 436水水乙乙 醇醇環(huán)己烷環(huán)己烷CCl4CHCl3271 350

50、 416 469 511267 344 409 459 500267 344 408 458 499 320 375 418 450 346 410 461 502在不同波長激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長在不同波長激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長( (nm) )63第二節(jié)第二節(jié) 熒光定量分析方法熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系I0IF)(0IIKFEClII100)1 ()101 (3 . 200EClECleIKIKF)! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(! 1)3 . 2(1 (1 320 EClEClEClIKF! 3)3 . 2(! 2)3 . 2

51、(3 . 2320EClEClEClIKKCEClIKFECl03 . 2,05. 0時(shí)當(dāng)64KCF ( (熒光定量分析法的依據(jù)熒光定量分析法的依據(jù)) )結(jié)論：結(jié)論：熒光強(qiáng)度和溶液濃度呈線性關(guān)系，只限熒光強(qiáng)度和溶液濃度呈線性關(guān)系，只限于極稀的溶液于極稀的溶液)。對(duì)于較濃溶液，會(huì)產(chǎn)。對(duì)于較濃溶液，會(huì)產(chǎn)生自熄滅現(xiàn)象。生自熄滅現(xiàn)象。65二、定量分析方法二、定量分析方法 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 1.靈敏度高靈敏度高 比紫外比紫外-可見分光光度法高可見分光光度法高24個(gè)數(shù)量級(jí)；個(gè)數(shù)量級(jí)； 檢測(cè)下限：檢測(cè)下限：0.10.001 g/mL 2.選擇性強(qiáng)選擇性強(qiáng) 既可依據(jù)發(fā)射光譜特征，又可根據(jù)激發(fā)光譜特征；既可依據(jù)發(fā)射光譜

52、特征，又可根據(jù)激發(fā)光譜特征； 3.試樣量少和方法簡(jiǎn)單試樣量少和方法簡(jiǎn)單 缺點(diǎn)缺點(diǎn)應(yīng)用范圍小應(yīng)用范圍小661.1.校正曲線法校正曲線法CF校正曲線校正曲線CXFX步驟：步驟：1.1.配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液2.2.做做F FC C關(guān)系曲線關(guān)系曲線3.3.求得濃度求得濃度注意：固定儀器和測(cè)定條件；注意：固定儀器和測(cè)定條件； 試樣濃度在線性范圍內(nèi)試樣濃度在線性范圍內(nèi)672.2.比例法比例法XSXSCCFFFF 00注意：樣品與標(biāo)樣溶液濃度接近，在線性范圍內(nèi)注意：樣品與標(biāo)樣溶液濃度接近，在線性范圍內(nèi)步驟：步驟：1.1.配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液2.2.測(cè)測(cè)F F3

53、.3.求濃度求濃度683.3.聯(lián)立方程式法聯(lián)立方程式法兩組分的熒光峰相互不干擾兩組分的熒光峰相互不干擾, ,可直接測(cè)定可直接測(cè)定 分別在各自的分別在各自的l l熒熒波長處測(cè)定波長處測(cè)定, ,求出它們的含量求出它們的含量兩組分的熒光峰相互干擾兩組分的熒光峰相互干擾, ,但激發(fā)光譜有顯著區(qū)但激發(fā)光譜有顯著區(qū) 別別, ,在某一激發(fā)光下一個(gè)組分產(chǎn)生熒光峰在某一激發(fā)光下一個(gè)組分產(chǎn)生熒光峰, ,另一組分另一組分不產(chǎn)生熒光不產(chǎn)生熒光; ;選用不同的激發(fā)光進(jìn)行測(cè)定選用不同的激發(fā)光進(jìn)行測(cè)定如果兩組分的熒光光譜和激發(fā)光譜相互干擾如果兩組分的熒光光譜和激發(fā)光譜相互干擾利用熒光強(qiáng)度的加和性（利用熒光強(qiáng)度的加和性（F

54、F= =F F1 1+ +F F2 2+ +F F3 3+ + ），在），在適宜的熒光波長處測(cè)定，用聯(lián)立方程來求解適宜的熒光波長處測(cè)定，用聯(lián)立方程來求解69第三節(jié)第三節(jié) 熒光分光光度計(jì)和其他熒光分析技術(shù)熒光分光光度計(jì)和其他熒光分析技術(shù)用于測(cè)量熒光強(qiáng)度的儀器有：用于測(cè)量熒光強(qiáng)度的儀器有：1.1.濾光片熒光計(jì)濾光片熒光計(jì)2.2.濾光片單色器熒光計(jì)濾光片單色器熒光計(jì)3.3.熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)70一、熒光分光光度計(jì)一、熒光分光光度計(jì)1.1.熒光分光光度計(jì)的主要部件：熒光分光光度計(jì)的主要部件：光源、激發(fā)單色光源、激發(fā)單色器、發(fā)射單色器、樣品池、檢測(cè)系統(tǒng)器、發(fā)射單色器、樣品池、檢測(cè)系統(tǒng)光源光源激

55、發(fā)單色器激發(fā)單色器樣品池樣品池發(fā)射單色器發(fā)射單色器檢測(cè)器檢測(cè)器放大器放大器指示器指示器記錄器記錄器7172SK-2003A型熒光光譜儀型熒光光譜儀(國內(nèi)首創(chuàng)）國內(nèi)首創(chuàng)）73RF-5400熒光光度計(jì)熒光光度計(jì)74Hitachi(日立日立)F-2500熒光分光光度熒光分光光度75熒光分光光度計(jì)澳大利亞熒光分光光度計(jì)澳大利亞762.2.儀器的校正儀器的校正靈敏度的校正靈敏度的校正 在選定波長及狹縫寬度的條件下，用一種穩(wěn)在選定波長及狹縫寬度的條件下，用一種穩(wěn)定的熒光物質(zhì)，配成濃度一致的對(duì)照品對(duì)儀器定的熒光物質(zhì)，配成濃度一致的對(duì)照品對(duì)儀器進(jìn)行校正，使每次測(cè)得的熒光強(qiáng)度調(diào)節(jié)到相同進(jìn)行校正，使每次測(cè)得的熒光

56、強(qiáng)度調(diào)節(jié)到相同數(shù)值（數(shù)值（5050或或100100）。）。 波長校正波長校正 汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線對(duì)單色器波長刻度校正。汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線對(duì)單色器波長刻度校正。77激發(fā)光譜和熒光光譜的校正激發(fā)光譜和熒光光譜的校正1.單光束熒光光度計(jì)，可用儀器上附有的校正單光束熒光光度計(jì)，可用儀器上附有的校正裝置將每一波長的光源強(qiáng)度調(diào)整到一致，然后裝置將每一波長的光源強(qiáng)度調(diào)整到一致，然后以表觀光譜上每一波長的強(qiáng)度除以檢測(cè)器對(duì)每以表觀光譜上每一波長的強(qiáng)度除以檢測(cè)器對(duì)每一波長的感應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行校正。一波長的感應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行校正。2.雙光束熒光光度計(jì)，可用參比光束抵消光學(xué)雙光束熒光光度計(jì)，可用參比光束抵消光學(xué)誤差。誤差。78二、其他熒

57、光分析技術(shù)簡(jiǎn)介二、其他熒光分析技術(shù)簡(jiǎn)介1.激光熒光分析激光熒光分析特點(diǎn)：激光作光源，一個(gè)單色器，用于分析超特點(diǎn)：激光作光源，一個(gè)單色器，用于分析超低濃度物質(zhì)。低濃度物質(zhì)。2.時(shí)間分辨熒光分析時(shí)間分辨熒光分析特點(diǎn)：利用不同物質(zhì)的熒光壽命不同，在激發(fā)和檢特點(diǎn)：利用不同物質(zhì)的熒光壽命不同，在激發(fā)和檢測(cè)之間延緩的時(shí)間不同，實(shí)現(xiàn)分別檢測(cè)的目的。測(cè)之間延緩的時(shí)間不同，實(shí)現(xiàn)分別檢測(cè)的目的。793.同步熒光分析同步熒光分析特點(diǎn)特點(diǎn):選擇適宜的選擇適宜的, ,同時(shí)掃描激發(fā)波長和發(fā)射同時(shí)掃描激發(fā)波長和發(fā)射波長，得到同步熒光光譜；減少光譜重疊，提高波長，得到同步熒光光譜；減少光譜重疊，提高分辨率；用于定量分析。分辨

58、率；用于定量分析。804.4.膠束增敏熒光分析膠束增敏熒光分析特點(diǎn)：采用化學(xué)方法提高熒光效率；膠束溶特點(diǎn)：采用化學(xué)方法提高熒光效率；膠束溶液對(duì)熒光物質(zhì)有增溶、增敏和增穩(wěn)的作用。液對(duì)熒光物質(zhì)有增溶、增敏和增穩(wěn)的作用。81無機(jī)物的熒光分析無機(jī)物的熒光分析很多金屬或非金屬無機(jī)離子與一些有機(jī)化合物形成很多金屬或非金屬無機(jī)離子與一些有機(jī)化合物形成有熒光的配合物，測(cè)定熒光強(qiáng)度可以進(jìn)行定量分析。有熒光的配合物，測(cè)定熒光強(qiáng)度可以進(jìn)行定量分析。常用的試劑：常用的試劑：1. 8羥基喹啉及其衍生物：羥基喹啉及其衍生物：用于用于Al、Ga、In、Sc、La、Mg、Zn、Cd等元素的熒光測(cè)定。等元素的熒光測(cè)定。2.2.

59、黃酮類試劑：黃酮類試劑：桑色素、黃烷醇、槲皮素桑色素、黃烷醇、槲皮素用于用于、族元素的熒光測(cè)定族元素的熒光測(cè)定3.3.二氨基化合物：二氨基化合物：用于測(cè)定用于測(cè)定Se82Al的測(cè)定方法：的測(cè)定方法：將大約將大約40 mL不含硝酸根的弱酸性試液，加入不含硝酸根的弱酸性試液，加入10mL 8羥基喹啉溶液振蕩羥基喹啉溶液振蕩2min，加入氨水調(diào)節(jié)，加入氨水調(diào)節(jié)到到pH811，再用力振蕩，再用力振蕩30s，水相以每次，水相以每次4mL氯氯仿洗滌二次。合并萃取液并以氯仿稀釋至仿洗滌二次。合并萃取液并以氯仿稀釋至20mL, ,再加入再加入Na2SO4。然后在熒光分光光度計(jì)上測(cè)定，。然后在熒光分光光度計(jì)上測(cè)

60、定，激發(fā)波長激發(fā)波長365nm、發(fā)射波長、發(fā)射波長560nm。83有機(jī)物的熒光分析有機(jī)物的熒光分析芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物在紫外光照芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物在紫外光照射下大多數(shù)能產(chǎn)生熒光，某些弱熒光物質(zhì)可與熒光射下大多數(shù)能產(chǎn)生熒光，某些弱熒光物質(zhì)可與熒光劑作用生成強(qiáng)熒光物質(zhì)。劑作用生成強(qiáng)熒光物質(zhì)。1.1.油脂苯并（油脂苯并（a a）芘測(cè)定：）芘測(cè)定：油樣經(jīng)提取、濃縮、純化后進(jìn)行熒光測(cè)定，油樣經(jīng)提取、濃縮、純化后進(jìn)行熒光測(cè)定，l lex 386nm、l lem406nm。2.2.尿中尿中N N1 1甲基尼克酰胺的測(cè)定：甲基尼克酰胺的測(cè)定：尿液經(jīng)純化、堿處理和酮縮合成為帶有黃色熒光