青霉素類抗生素的生物制藥工藝研究

1、青霉素類抗生素的生物制藥工藝研究專業(yè)班級 生物工程 學(xué) 號 101454218 姓 名 汪 芳 俊 摘要：抗生素指由細菌、霉菌或其它微生物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類物質(zhì)。青霉素的使用使人類戰(zhàn)勝了因為各類感染所帶來的痛苦，由于抗生素的優(yōu)良抗菌抗病毒做用，抗生素的使用一直被密切研究，新型抗生素的研發(fā)和使用更是意義重大，并且有不可估量的經(jīng)濟效益。通過對抗生素生產(chǎn)工藝的不斷學(xué)習(xí)和研究，本文引以青霉素的生產(chǎn)工藝為例，從而對揭示各類抗生素的工業(yè)生產(chǎn)工藝，為抗生素的生產(chǎn)和研究提供指導(dǎo)。關(guān)鍵詞：抗生素；青霉素；生產(chǎn)工藝；提煉；abstract:, the discovery and us

2、e of antibiotics to human health are higher than ever before, because all mankind overcome the pain caused by infection, Since antibiotics do good antibacterial and antiviral use, antibiotic use has been closely studied the development and use of new antibiotics is of great significance, and have im

3、measurable economic benefits. The term antibiotic production process through the continuous study and research, the paper cited an example to penicillin production process, thus revealing all kinds of antibiotics in industrial production processes for antibiotic production and research guidance.key

4、words : Antibiotics; penicillin; production process; extraction;1 前言抗生素是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。是指“在低濃度下即可對某些生物的生命活動有特異抑制作用的化學(xué)物質(zhì)的總稱” 。它的作用大致有五點：抗細菌感染、治療腫瘤、 抗病原蟲、 免疫抑制劑、刺激植物生長?，F(xiàn)臨床常用的抗生素有微生物培養(yǎng)液液中提取物以及用化學(xué)方法合成或半合成的化合物。 抗生素的生產(chǎn)目前主要由微生物發(fā)酵法進行生物合成，還可將生物合成法制得的抗

5、生素用化學(xué)或生化方法進行分子結(jié)構(gòu)改造而制成各種衍生物，稱半合成抗生素?？股厥谴渭壌x產(chǎn)物，這些產(chǎn)物與微生物的生長繁殖無明顯的關(guān)系，物質(zhì)的構(gòu)造也因微生物種屬不同而異，但產(chǎn)生這些物質(zhì)的代謝過程基本相似。微生物生產(chǎn)抗生素的原理：控制發(fā)酵條件，使抗生素產(chǎn)生菌的代謝向合成抗生素的方向發(fā)展，從而有利于抗生素的產(chǎn)生。2 青霉素2.1 青霉素概述青霉素又被稱為青霉素G、盤尼西林、青霉素鈉、芐青霉素鈉。青霉素是抗菌素的一種，是指從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷、能破壞細菌的細胞壁并在細菌細胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素。青霉素類抗生素是-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱。但它不能耐受耐藥菌株所產(chǎn)生的酶，易

6、被其破壞，主要對革蘭氏陽性菌有效。2.2青霉素的理化性質(zhì)及應(yīng)用2.2.1 穩(wěn)定性 固體青霉素鹽的穩(wěn)定性與其含水量和純度有很大的關(guān)系；2.2.2溶解度青霉素游離酸在水中溶解度很小，易溶于有機溶劑如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和乙醚中，而其鉀鹽、鈉鹽易溶于水和甲醇，可溶于乙醇2.2.3降解反應(yīng)：青霉素是很不穩(wěn)定的化合物，遇酸堿或加熱易分解而失去活性，并發(fā)生分子重排。2.2.4紫外吸收 2.2.5過敏反應(yīng)2.3作用機制細胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽類似物競爭性與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯(lián)。生長中的細胞有效，靜止細胞無效2.4天然存在的青霉素青霉素是

7、一族抗生素的總稱，它們是由不同的菌種或扎起不同的培養(yǎng)條件所得的同一類化學(xué)物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)通式如圖1.圖1.青霉素的結(jié)構(gòu)通式3 發(fā)酵條件下的生長過程第1期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡。第2期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜堿性，類脂肪小顆粒。第3期：形成脂肪包涵體，機理貯藏物，沒有空泡，嗜堿性很強。第4期：脂肪包涵體形成小滴并減少，中小空泡，原生質(zhì)體嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性染色大顆粒，菌絲呈桶狀，脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高。第6期：出現(xiàn)個別自溶細胞，細胞內(nèi)無顆粒，仍然桶狀。釋放游離氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細胞壁。鏡檢：規(guī)定時間取樣，顯

8、微鏡觀察7個時期的形態(tài)變化，控制發(fā)酵。14期為菌絲生長期，3期的菌體適宜為種子。45期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強，通過工程措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前結(jié)束發(fā)酵。4 青霉素的發(fā)酵工藝及過程4.1 工藝流程圖2.青霉素的發(fā)酵工藝路線74.2 生物合成法生產(chǎn)青霉素的工藝過程4.2.1 生產(chǎn)菌種 1、菌種產(chǎn)黃青霉菌 2、方法誘變育種 得到高產(chǎn)的菌株生產(chǎn)菌種是抗生素生物合成的主要基礎(chǔ)，它必須具備產(chǎn)量高、性能穩(wěn)定和容易培養(yǎng)等特點。為了防止菌種衰退，生產(chǎn)菌種必須以休眠狀態(tài)保存在砂土管或冷凍干燥管中，并置于04恒溫冰箱，使用時可臨時取出，接種后仍須冷藏。生產(chǎn)菌種一般都嚴格規(guī)定其使用期，一般砂土管為1

9、 2年，生產(chǎn)菌種應(yīng)不斷純化，淘汰變異菌落，防止衰退。4.2.2 孢子制備這是發(fā)酵工序的開端，是一個重要環(huán)節(jié)。其方法將砂土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的培養(yǎng)基進行斜面培養(yǎng)，經(jīng)傳代活化。最適生長溫度在2526 ，培養(yǎng)68天，得單菌落，再傳斜面，培養(yǎng)7天，得斜面孢子。移植到優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長7天，25，制得小米孢子。每批孢子必需進行嚴格搖瓶試驗，測定效價及雜菌情況。4.2.3 種子制備及發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝這一過程是使孢子發(fā)芽繁殖、以獲得足夠數(shù)量的菌絲，以便接種到發(fā)酵罐。種子培養(yǎng)要求產(chǎn)生大量健壯的菌絲體，因此，培養(yǎng)基應(yīng)加入比較豐富的易利用的碳源和有機氮源。青霉素采用三級發(fā)酵：一級種子

10、發(fā)酵：發(fā)芽罐.小罐，接入小米孢子后，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基成分：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等?？諝饬髁?：3（體積比）；充分攪拌300350r/min；4050小時；pH自然，溫度27±1。二級發(fā)酵罐：繁殖罐.大量繁殖。玉米漿、葡萄糖等。空氣流量1：11.5；攪拌轉(zhuǎn)速250280r/min；pH自然，溫度25±1；時間1014h。三級發(fā)酵罐：生產(chǎn)罐?；ㄉ灧郏ǜ邷兀?，葡萄糖，尿素，硫酸銨,硫代硫酸鈉,苯乙酰胺,CaCO3等。接種量為1215%。青霉素的發(fā)酵對溶氧要求極高，通氣量偏大，通氣比控制0.71.8；150200r/min；要求高功率攪拌，100 m3

11、的發(fā)酵罐攪拌功率在200300 Kw，罐壓控制0.040.05 MPa，于2526 下培養(yǎng)，發(fā)酵周期在200h左右。前60h，pH5.76.3，后6.36.6；前60h為26，以后24?？股厣锖铣奢^為復(fù)雜，影響因素比較多需要各方面的密切配合和嚴格操作，把住各個環(huán)節(jié)。發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝圖4.3青霉素的提煉工藝過程化學(xué)提取和精制的目的:從發(fā)酵液中制取高純度的、合乎藥典的抗生素成品。發(fā)酵液中常見的雜質(zhì)有：菌絲、未用完的培養(yǎng)基、易污染雜菌、產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物、 預(yù)處理需要加入的雜質(zhì)燈。4.3.1青霉素的提取遵循下面四個原則：時間短，溫度低，pH適中，勤清洗消毒。4.3.2常用的提取方法有：溶媒萃取法、離

12、子交換法、沉淀法。青霉素提純工藝流程簡圖： 4.3.1預(yù)處理發(fā)酵液結(jié)束后，目標(biāo)產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，而且濃度較低，含有大量雜質(zhì)，它們影響后續(xù)工藝的有效提取，因此必須對其進行的預(yù)處理，目的在于濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過程。是進行分離純化的一個工序。4.3.2過濾發(fā)酵液在萃取之前需預(yù)處理，發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白，然后經(jīng)真空轉(zhuǎn)鼓過濾或板框過濾，除掉菌絲體及部分蛋白。青霉素易降解，發(fā)酵液及濾液應(yīng)冷至10 以下，過濾收率一般90%左右。（1）菌絲體粗長10µm，采用鼓式真空過濾機過濾，濾渣形成緊密餅狀，容易從濾布上刮下。濾液pH6.27-7.2

13、，蛋白質(zhì)含量0.05-0.2%。需要進一步除去蛋白質(zhì)。（2）改善過濾和除去蛋白質(zhì)的措施：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土為助濾劑。再通過板框式過濾機。濾液澄清透明，進行萃取。4.3.3萃取青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機溶媒中，調(diào)節(jié)pH，再轉(zhuǎn)入中性水相，反復(fù)幾次萃取，即可提純濃縮。4.3.4脫色萃取液中添加活性炭，除去色素、熱源，過濾，除去活性炭。4.3.5結(jié)晶抗生素精制常有結(jié)晶法來制得高純度成品。常有的幾種結(jié)晶方法有：改變溫度結(jié)晶:利用抗生素在溶劑中的溶解度隨溫度

14、變化而顯著變化的這一特性來進行結(jié)晶。利用等電點結(jié)晶:當(dāng)將某一抗生素溶液的pH調(diào)到等電點時，它在水溶液中溶解度最小，則沉淀析出。加成鹽劑結(jié)晶:在抗生素溶液中加成鹽劑使抗生素一鹽的形式從溶液中能夠沉淀結(jié)晶。4.4成品檢驗由于抗生素的生產(chǎn)一般采用生物合成法，雖經(jīng)提取和精制，但其純度仍不能達到百分之百，而且在生物合成過程中也會同時產(chǎn)生其它藥效和藥性不同的各種物質(zhì)，在制品和加工、貯藏過程中也還可能引起抗生素的變質(zhì)。因此，為了保證藥品質(zhì)量、用藥安全，對抗生素各種成品都必須進行檢驗?？股禺a(chǎn)品常規(guī)檢驗項目一般包括：性狀及鑒別試驗、安全試驗、降壓試驗、熱原試驗、無菌試驗、酸堿度測定、效價測定、水分測定、混濁度

15、測定、色澤顆粒細度測定等等。5 結(jié)論 抗生素作為20世紀的重大發(fā)現(xiàn)之一，它的發(fā)現(xiàn)和使用使人類健康得到空前提高，使人類戰(zhàn)勝了因為各類感染所帶來的痛苦，因而研究和使用抗生素具有重大的意義。本文通過對抗生素的介紹和研究，并對抗生素的經(jīng)典藥物青霉素生物制藥工藝進行了總結(jié)，這必將使得我們更好的對抗生素類藥物的生物制藥工藝作出理論指導(dǎo)。本文不足之處還請各位提出意見和建議。參考文獻1 胡國勤.抗生素質(zhì)控分析中HPLC分析方法的理論與實踐.北京：氣象出版社，20012 梁世中.生物制藥理論與實踐M，北京：高等教育出版社，2005.6（1）：2903 吳曉英.生物制藥工藝學(xué)M，北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.3（1）：158-1594 梁世中.生物制藥理論與實踐M，北京：高等教育出版社，2005.6（1）：3005 盛貽林.微生物制藥技術(shù)M,北京：中國農(nóng)民大學(xué)出版社，2008.8（1）：1316 吳曉英.生物制藥工藝學(xué)M，北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.3（1）：160 7 熊宗貴.1999.生物技術(shù)制藥.北京：高等教育出版社. 8陳立軍等.新型分離純化技術(shù)親和超濾及其應(yīng)用J.膜科學(xué)與技術(shù)，2006.9 張林生.生物制藥技術(shù).北京：科學(xué)出版社.10