武義縣高中生物實驗技能提升培訓(xùn)(二)

1、 武義縣高中生物實驗技能提升培訓(xùn)（二） 組織單位：縣教研室 指導(dǎo)專家： 藍偉偵培訓(xùn)內(nèi)容：幾種植物染色體體核型分析 藍偉偵在作“染色體核型分析”講座 材料：表1 紫景天和四種龍葵的性狀比較種類果實顏色果實特征分布區(qū)紫景天黃果龍葵少花龍葵浙江龍葵蘇聯(lián)龍葵褐色黃綠色亮黑紫色黑色黑紫色果小 ，卵狀橢圓形粒細(xì)小，白中稍帶黃粒較小，白色稍泛綠粒較小,白色粒大,乳白色全國東北零星分布南方各省區(qū)浙江北部北方各省區(qū)紫景天、少花龍葵、浙江龍葵、黃果龍葵和蘇聯(lián)龍葵種子，由湖州師范學(xué)院張海洋教授提供，通過培養(yǎng)種子并獲得相應(yīng)的根尖。表2 各稻種的染色體數(shù)、基因組及地理分布稻種名稱Name of species染色體數(shù)目

2、Chromosomenumber基因組Genome分 布Distribution栽培稻(O. sativa L.)非洲栽培稻(O. glaberrima)疣粒野生稻(O. meyeriana)藥用野生稻(O. officinalis)寬葉野生稻(O. latifolia)高桿野生稻(O. alta)斑點野生稻(O. punctata) 栽培稻×藥用野生稻F1植株BC1植株(栽培稻回交)BC1植株(藥用野生稻回交)藥用野生稻單體附加系(MAAL 8)2424242448484824363625AAAAGGCCCCDDCCDDBBCCACAACACC AA+C全世界西非南亞、東南亞亞洲熱

3、帶、亞熱帶、澳大利亞熱帶拉丁美洲拉丁美洲非 洲材料由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)盧永根院士、武漢大學(xué)何光存教授和李剛博士提供。2 主要的化學(xué)藥品和試劑實驗中用到的主要實驗藥品見表3。表3 實驗中主要的化學(xué)藥品及試劑名稱純度來源乙醇冰醋酸鹽酸溶液果膠酶纖維素酶硫酸鐵銨氯化鈉顆粒檸檬酸鈉甘油甲醇磷酸二氫鈉磷酸二氫鉀氯化鉀檸檬酸Giemsa粉PI (碘化丙啶)DAPI生物素化dUTP地高辛化 dUTP分析純分析純分析純生物純生物純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純生物純生物純生物純生物純杭州長征化學(xué)試劑有限公司杭州化學(xué)試劑有限公司無錫市晨陽化工有限公司Fluka公司上海伯奧生物科技有限公司

4、湖州湖試化學(xué)試劑有限公司無錫市晨陽化工有限公司中國醫(yī)藥(集團)上?；び邢薰菊憬贾蓦p林化工試劑廠杭州蕭山化學(xué)試劑廠無錫市晨陽化工有限公司上海統(tǒng)亞化工科技發(fā)展有限公司寧波市化學(xué)試劑廠國藥集團化學(xué)試劑有限公司國藥集團化學(xué)試劑有限公司Sigma公司Roche公司華美生物工程公司Roche 公司3 主要儀器與設(shè)備主要儀器與設(shè)備見表4。表4實驗中用到的儀器與設(shè)備名稱型號制造商或產(chǎn)地光照培養(yǎng)箱SPX-250B-G上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠4與-20冰箱BCD-215K海爾集團恒溫水浴箱HH-4金壇市杰瑞爾電器有限公司架盤藥物天平HC-TP11-2上海精密科學(xué)儀器有限公司成像處理軟件Photosho

5、p CS 5.0美國定性濾紙GB/T1914-93杭州新華紙業(yè)有限公司干燥器-顯微鏡熒光顯微鏡XSP-2CAOLYMPUS BX61上海日本4 主要試劑的配制 卡諾固定液：酒精：冰醋酸=3：1（體積比）混合，置4冰箱保存?zhèn)溆?，作用是迅速殺死?xì)胞，使之在形態(tài)上和內(nèi)部結(jié)構(gòu)上保持生活時的完整和真實狀態(tài)，并且能將細(xì)胞在生活情況下不易觀察清楚的結(jié)構(gòu)清晰顯現(xiàn)。 對二氯苯飽和溶液：實驗室提供，作用是對根尖進行預(yù)處理，改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，抑制和破壞紡錘絲的形成，促使染色體縮短和分散，有利于對有絲分裂中染色體的觀察和計數(shù)。 1%鹽酸溶液：實驗室提供，調(diào)pH。 2%果膠酶和纖維素酶：將果膠酶與纖維素酶1：1混合，使

6、分生組織細(xì)胞間的果膠質(zhì)分解，細(xì)胞壁軟化或部分分解，使細(xì)胞和染色體容易分散壓平。 蘇木精染液：實驗室提供，使染色體染上較深的顏色，分色清晰，照像效果較好，利于標(biāo)本長期保存。 硫酸鐵銨：實驗室提供，在進行蘇木精染色前進行媒染，使蘇木精染色效果更好。 2SSC：Nacl粉末17.5g，檸檬酸鈉粉末8.8g，加入100mlddH2O，于燒杯中攪拌使氯化鈉，檸檬酸鈉完全溶解，并混勻，置試劑瓶中保存。 Giemsa染液：Giemsa粉0.5g，甘油22ml，將Giemsa粉置于研缽內(nèi)先用少量甘油與之充分混合，研磨至無顆粒，然后將剩余的甘油混在一起，56保溫2小時后，加入33ml純甲醇，保存于棕色瓶內(nèi)。 S

7、orense緩沖液：Na2HPO4（1/15M）50ml與 KH2PO4（1/15M）50ml混勻，并測pH（pH=7.0左右），作用在于平衡pH值。5 實驗方法5.1紫景天染色體制片及觀察（1）插穗：選擇當(dāng)年萌發(fā)枝，剪成67厘米長，帶頂芽，粗插穗（0.60.8cm）。 用光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)：溫度20，光照強度為2500lx(6時19時)，插床選用長方形72孔（6×12）黑色育苗盤，每個孔的長×寬×高為4.5cm×4.5cm×5cm，進行生根培養(yǎng)。 室溫培養(yǎng)：插床選用長方形72孔（6×12）黑色育苗盤，每個孔的長×寬×

8、高為4.5cm×4.5cm×5cm，在自然光和室溫下進行生根培養(yǎng)。 水里培養(yǎng)：放入裝有自來水的容器中，在自然光和室溫下進行生根培養(yǎng)。（2）取樣：選取生長狀況良好的根尖，切取0.5cm。 （3）預(yù)處理：為了有利于對有絲分裂中染色體的觀察和計數(shù)，在固定之前應(yīng)對剪下的根尖進行預(yù)處理，這樣可以改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，抑制和破壞紡錘絲的形成，促使染色體縮短和分散。預(yù)處理的方法有低溫預(yù)處理和藥物預(yù)處理。 低溫預(yù)處理：將剪取的根尖浸入盛有蒸餾水的燒杯內(nèi)，置于 4 的冰箱中進行低溫處理 24小時，此法效果很好，對染色體無破壞作用，染色體縮短均勻。 藥物預(yù)處理：常用藥物有秋水仙素溶液、對二氯苯溶液

9、、8-羥基喹啉等。 （4）根尖的低滲：低滲是為了使染色體更好的分散。在固定前用0.075mol/L KCl 室溫下處理30分鐘，酶解后用蒸餾水低滲1530分鐘，使染色體分散效果更好。（5）固定：新鮮3：1甲醇：冰乙酸的固定液固定23h或4過夜。（借助于物理方法或化學(xué)藥物的作用，迅速滲入組織和細(xì)胞將之殺死，使其形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物盡可能保持生活時的完整和真實狀態(tài)。固定時，將預(yù)處理過的根尖用蒸餾水沖洗兩次 ( 約 5 分鐘 )。然后移入卡諾氏固定液中，在 415 條件下固定 2024 小時后用 70 酒精沖洗 2 次轉(zhuǎn)入 70 酒精中。在 4 冰箱內(nèi)保存，保存時間最好不超過二個月。經(jīng)過較長時間保存的材

10、料，進行觀察前可以換用固定液再處理一次效果較好?；?qū)㈩A(yù)處理過的根尖放入 0.075mol/L KCl 溶液中低滲 20 分鐘，然后在蒸餾水中沖洗 23 次( 約 10分鐘 )待用。 （6）水洗：每隔5分鐘洗一次，洗凈。（7）解離：2%纖維素酶、2%果膠酶、1%解析酶混合（2：2：1），28下處理4小時。有酸解和酶解兩種方法： 酸解：將根尖從固定液中取出，用蒸餾水漂洗，然后放入已經(jīng)在 60 水浴鍋中預(yù)熱的 1 mol/L HCI 中，在 60 恒溫條件下解離 1015 分鐘，當(dāng)根尖透明呈米黃色時取出，用蒸餾水沖洗 23 次。 酶解：將根尖從固定液中取出，放在 0.1mol/L 醋酸鈉中漂洗，用刀

11、片切除根冠以及延長區(qū) (根尖較粗的蠶豆，可以把分生組織切成 23 片)，把根尖分生組織放到醋酸鈉配制的 2 的纖維素酶和2%果膠酶的等量混合液中，在 2528 條件下處理 45 小時。此時組織已被酶液浸透而呈淡褐色，質(zhì)地柔軟而仍可用鑷子夾起，用滴管將酶液吸掉，再滴上 0.1 mol/ L 醋酸鈉，使組織中的酶液漸漸滲出，再放入45 醋酸。（8）后低滲：將解離后的根尖放在蒸餾水中沖洗 23 次( 約 10 分鐘)。酶解后的根尖放入蒸餾水中浸泡 1015 分鐘，然后再沖洗 23 次。一定要沖洗干凈，否則影響染色。低滲后的根尖放入 70% 酒精后備用。洗載片的洗滌如下：1mol/L HCl中30分鐘

12、以上自來水（每片單獨漂洗），接著用雙蒸水洗95%酒精浸泡30分鐘以上（9）染色體制片：小心吸去酶液，水洗幾次，吸取12個根尖于干凈的干載玻片上，滴半滴固定液，用鑷子敲至漿狀，敲得越碎越好，滴至固定液使材料分散，迅速涂開，火焰干燥。在普通光學(xué)顯微鏡進行觀察，通過鏡檢初步篩選一批染色體分裂像較多的制片，并用記號筆做好標(biāo)記以便做熒光染色備用。（10）熒光染料DAPI復(fù)染配制一定濃度的熒光染料DAPI，在暗室里對紫景天染色體制片進行了熒光染色體。（11）熒光顯微鏡鏡檢及拍攝把復(fù)染的染色體制片利用熒光顯微鏡進行鏡檢，并且對染色體各時期分裂像都進行了一定量的拍照，并把拍攝好的照片在硬盤里備份保存。（12）

13、圖像的處理及分析我們把拍攝好的染色體照片進行分析，首先選取分散較好的前中期染色體進行統(tǒng)計，并利用Photoshop軟件進行圖片處理和核型分析，SPOT advanced 軟件測量染色體長度，同時利用excel表對相關(guān)的數(shù)據(jù)進行分析統(tǒng)計，并構(gòu)建其相應(yīng)的核型模式圖。5.2龍葵染色體制片及觀察5.2.1龍葵的生根培養(yǎng) 浸種：分別取兩種龍葵的適量的種子于燒杯中，室溫下浸種一天。 發(fā)芽：培養(yǎng)皿中墊濕濾紙一層，種子分散其上，留一些間隔，不能堆積，25-30下發(fā)芽，每天水洗1-2次，約3-4天可取根尖。（勤換水很重要，水不能過多，一般以不留流動水為宜，保證種子處在濕潤的條件下，水分過多易長芽但根長不好，水太

14、少則容易干死，得不到根尖。）5.2.2 種子培養(yǎng)過程觀察 除了勤換水，保證種子處在最佳培養(yǎng)條件下外，還應(yīng)及時取根尖。當(dāng)根長至1-1.5cm時，切取1cm左右的根尖（早上10：00-11：00取根尖可以得到更好的分裂相），根尖太短，所得分裂細(xì)胞數(shù)目太少，不利于染色體觀察，太長，不利于制片。5.2.3根尖染色體制片 預(yù)處理 為了有利于對有絲分裂中染色體的觀察和計數(shù)，在固定之前應(yīng)對剪下的根尖進行預(yù)處理，這樣可以改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，抑制和破壞紡錘絲的形成促使染色體縮短和分散。預(yù)處理的方法有低溫預(yù)處理和藥物預(yù)處理。 低溫預(yù)處理：將剪取的根尖浸入盛有蒸餾水的燒杯內(nèi)，置于 4 的冰箱中進行低溫處理 24小時。

15、此法效果很好。對染色體無破壞作用，染色體縮短均勻。 藥物預(yù)處理：常用藥物有秋水仙素溶液、對二氯苯溶液、8-羥基喹啉等。 根尖的低滲 低滲是為了使染色體更好的分散。在固定前用0.075mol/L KCl 室溫下處理30分鐘，酶解后用蒸餾水低滲15-30分鐘，使染色體分散效果更好。 固定與水洗 借助于物理方法或化學(xué)藥物的作用，迅速滲入組織和細(xì)胞將之殺死，使其形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物盡可能保持生活時的完整和真實狀態(tài)。固定時，將預(yù)處理過的根尖用蒸餾水沖洗兩次 ( 約 5 分鐘 ) 。然后移入卡諾氏固定液中，在 4-15 條件下固定 20-24 小時后用 70 酒精沖洗 2 次轉(zhuǎn)入 70 酒精中。在 4 冰箱內(nèi)

16、保存，保存時間最好不超過二個月。經(jīng)過較長時間保存的材料，進行觀察前可以換用固定液再處理一次效果較好。或?qū)㈩A(yù)處理過的根尖放入 0.075mol/L KCI 溶液中低滲 20 分鐘，然后在蒸餾水中沖洗 2-3 次 ( 約 10分鐘 )待用。 解離 使分生組織細(xì)胞間的果膠質(zhì)分解細(xì)胞壁軟化或部分分解使細(xì)胞和染色體容易分散壓平。解離有酸解和酶解兩種方法： 酸解：將根尖從固定液中取出，用蒸餾水漂洗然后放入已經(jīng)在 60 水浴鍋中預(yù)熱的 1 mol/L HCI 中，在 60 恒溫條件下解離 10-15 分鐘，當(dāng)根尖透明呈米黃色時取出，用蒸餾水沖洗 2-3 次。 酶解：將根尖從固定液中取出，放在 0.1mol/

17、L 醋酸鈉中漂洗，用刀片切除根冠以及延長區(qū) ( 根尖較粗的蠶豆，可以把分生組織切成 2-3 片 ) ，把根尖分生組織放到醋酸鈉配制的 2 的纖維素酶和2%果膠酶的等量混合液中,在 25-28 條件下處理 4-5 小時。此時組織已被酶液浸透而呈淡褐色，質(zhì)地柔軟而仍可用鑷子夾起，用滴管將酶液吸掉再滴上 0.1 mol / L 醋酸鈉，使組織中的酶液漸漸滲出，再放入 45 醋酸。 后低滲 將解離后的根尖放在蒸餾水中沖洗 2-3 次 ( 約 10 分鐘 ) 。酶解后的根尖放入蒸餾水中浸泡 10-15 分鐘，然后再沖洗 2-3 次。一定要沖洗干凈，否則影響染色。低滲后的根尖放入 70% 酒精后備用。 洗

18、載玻片 將載玻片置于1mol/L HCl中30 min以上。 用自來水（每片單獨漂洗）漂洗，然后用蒸餾水漂洗。 將漂洗后的載玻片置于95%酒精中浸泡30min以上。5.2.4染色體制片用火焰干燥法制片：小心吸去酶液，水洗幾次，吸取12個根尖于干凈的干載玻片上，滴半滴固定液，用鑷子敲至漿狀，敲得越碎越好，滴至固定液使材料分散，迅速涂開，火焰干燥。用光學(xué)顯微鏡初步鏡檢，篩選備用。5.2.5龍葵染色體制片染色及觀察Giemsa染色（1） 準(zhǔn)備染液 用pH為6.8-7.0的Sorense緩沖液，按Giemsa染液：Sorense緩沖液為1：20或1：40比例取Giemsa染液和Sorense緩沖液混合

19、配成染色液。染色液宜現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時間不超過48小時。緩沖液pH值要準(zhǔn)確，否則影響染色效果。（2）Giemsa染色 經(jīng)過2ssc處理后的片子在Giemsa染液中60下染色2-3小時。（3） 洗片 將經(jīng)Giemsa染色后的片子用自來水洗去玻片上多余的燃料，自然干燥。熒光染料DAPI復(fù)染配制一定濃度的熒光染料DAPI，在暗室里對紫景天染色體制片進行了熒光染色體。5.2.6 鏡檢及拍照晾干的片子在顯微鏡下鏡檢。每種類型隨機選取30個細(xì)胞進行染色體數(shù)目鑒定；每種類型選取染色體分散好的、形態(tài)清晰的5個細(xì)胞通過PhotoShop軟件和SPOT軟件結(jié)合G-帶帶型完成染色體核型分析。5.3 水稻染色體制片中期

20、染色體制片參照Song和Gustafson (1995)的方法并略作修改。切取生長旺盛的根尖(12 mm)，0.075 M KCl前低滲處理30 min，甲醇/冰醋酸(3:1)固定，雙蒸水充分清洗根尖，2%的果膠酶及纖維素酶1:1混合28oC下酶解34 h，雙蒸水后低滲30 min火焰干燥制片，-20oC貯存?zhèn)溆谩Ｋ幱靡吧緶p數(shù)分裂染色體制片參照Kurata等(1981) 程序稍加修改，在花粉母細(xì)胞處于減數(shù)分裂時期，以卡諾氏固定液固定幼穗后，從小穗中剝?nèi)』ǚ勰?，?% 果膠酶 (SERVA) 和 2% 纖維素酶 (SERVA) 1:1混合，在28oC下酶解1.52.5 h左右，吸去酶液，輕輕水

21、洗3次，火焰干燥法制片，亦可用滴片法制備粗線期染色體，即將酶解好的花粉囊，加雙蒸水輕輕吹打，使其細(xì)胞完全散開，后低滲15 min，30003600 rpm離心5 min，然后加固定液重新固定1015 min，換新鮮固定液，懸浮滴片，火焰干燥后-20oC保存?zhèn)溆谩?.4 染色體原位雜交及信號檢測5.4.1 原位雜交參照Gustafson 和Dille (1992)方法并略作修改。1) 染色體制片60烘片1 h。2) 37于RNaseA (10µg/ml，用2×SSC稀釋) 溶液中處理1 h。3) 4多聚甲醛(2×SSC)室溫下處理10 min。4) 2×S

22、SC，室溫下處理5 min。5) 2×SSC，室溫下處理10 min。6) 70% 甲酰胺70 處理3.5 min。7) 于-20 70%、95%、100% 乙醇中各處理5 min。8) 染色體制片在室溫下充分干燥。9) 雜交液90變性10 min后，迅速于冰上放置20 min。雜交液配方見表1。表5 FISH雜交液配方探針類型去離子甲酰胺硫酸葡萄糖探針量鮭精DNA (ssDNA)20×SSCSDS探針50%8%100 ng2 µg10%0.1%10) 加50 l雜交液至染色體制片上，蓋24×50 mm的蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡，80共變性1.53 mi

23、n (變性時間根據(jù)不同染色體制片而定)，染色體制片于37 保濕皿中孵育24h。2.3.7.2 信號檢測 對于中期、間期、粗線期染色體制片，雜交后的熒光檢出程序包括以下步驟：1）洗片：20甲酰胺，42洗10 min；2×SSC，42 10 min；0.2×SSC，42 10 min ；1×PBS室溫洗10 min。2）涼干片子每張片子加50 l鏈親和素-Cy3(streptavidin-Cy3) (0.4l 1 mg/ml的鏈親和素-Cy3用1% BSA/PBS稀釋成50 l) 或抗地高辛-FITC (anti- Digoxigenin-Fluorescein Fa

24、b Fragment) (3 l 200g/ml的抗地高辛-FITC用1% BSA/PBS稀釋成50 l)，37于保濕皿中溫育1 h。室溫1×PBS洗3次，每次5 min。3）涼干片子每張片子加50 l 生物素鏈親和素(Biotinylated Streptavidin) (0.4 l 1 mg/ml的生物素鏈親和素用1% BSA/PBS稀釋成50l)或兔抗羊-生物素偶聯(lián)物(rabbit anti-goat biotin conjugated) (3 l 200 g/ml的抗地高辛-FITC用1%BSA/PBS稀釋成50 l)，37于保濕皿中溫育1 h。室溫1×PBS洗3次

25、，每次5 min。4) 涼干片子每張片子加50 l鏈親和素-Cy3(streptavidin-Cy3) (0.4 l 1 mg/mL的鏈親和素-Cy3用1% BSA/PBS稀釋成50 l)，37于保濕皿中溫育1 h。室溫1×PBS洗3次，每次5 min。5） 每張制片加40 l 10 g/mLDAPI復(fù)染，OLYMPUS BX61 顯微鏡觀察，用Case Data Manager Expo 2.1.1 圖象系統(tǒng)控制的Cool-1300QS CCD (VDS，Germany)照相系統(tǒng)攝取圖片，F(xiàn)ISHView EXPO 2.0軟件圖片處理和核型分析。6 實驗結(jié)果相關(guān)的實驗結(jié)果，見培訓(xùn)課

26、件ppt。作者簡介：藍偉偵 性別：男 民族：畬族出生年月日：1980年12月13日，籍貫：浙江武義簡歷：1999.092003.07 本科 中南民族大學(xué) 生物技術(shù)專業(yè)2003.092006.07 碩士 中南民族大學(xué) 分析化學(xué)專業(yè)2006.082009.07 浙江湖州師范學(xué)院生科院2009.08至今 武義縣第三中學(xué)簡介：項目負(fù)責(zé)人近年來先后參加了多項科研項目，包括國家高技術(shù)發(fā)展計劃（863）（批準(zhǔn)號：2004AA227120），教育部留學(xué)回國人員啟動基金（批準(zhǔn)號：BZY04003），中國博士后科學(xué)基金（批準(zhǔn)號：20040350574），武漢市青年科技晨光計劃（批準(zhǔn)號：2004500607135）。負(fù)責(zé)人以第一作者發(fā)表或待發(fā)表文章：1. Lan W Z, Qin R, Li G, He G C. Comparative analysis of A, B, C and D genomes in the genus Oryza with C0t-1 DNA of C genome. Chinese Science Bulletin, 2006, 51 (14): 1710