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文檔簡介

1、熒光原位雜交(FISH)探針的制備及其應(yīng)用 概述1、克隆性染色體異常是腫瘤的特征2、染色體異常常見的類型3、染色體異常的檢測方法二、熒光原位雜交及其探針1、熒光原位雜交的原理2、熒光原位雜交的探針三、熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交(按試驗流程介紹)一、 概述1、克隆性染色體異常是腫瘤的特征1914年德國遺傳學(xué)家Boveri就提出染色體畸變與腫瘤起源相關(guān),然而這還僅僅只是一個假說;1960 年 Nowell 和 Hungerford 在 7 例慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia , CML) 的患者中發(fā)現(xiàn)后來被稱為費城染色體(Philadelphia chro

2、mosome )的微小染色體;1973年Rowley證實了 Ph染色體是9號和22號染色體易位所致,這是人們在腫瘤中認識到的第一 個染色體易位;目前,已經(jīng)有 11,500篇文獻報道了 55,600多種克隆性細胞遺傳學(xué)異常。這 些染色體畸變,尤其是染色體易位及其相應(yīng)的融合基因在腫瘤致病的起始階段有著重要的作 用,無不說明克隆性細胞遺傳學(xué)異常是腫瘤的特征,在腫瘤起源中起重要作用。60.0001Database last updated on November 04h 2008Total number of cases = 55.64850,000 -i40.000 -30.00020.000 i1

3、0,000 -1975198519901995200020052010YearFigure 11 The number of cytogenetically abnormal neoplasms reported in the Literature.下圖是各種疾病報告的克隆性染色體異常病例數(shù)The number of cases with clonal chromosome abnormalities in various diseases,Nat Rev Cancer, 2007, 7(4):233-245 AMI (n=12.124)a MDS (rr=4.008)E9 CML(n=2.9

4、99) CMD(n= 1.180) ALL (n-7.194)c (n=ZS04) T-ML (n=L094) HD (r=231) Respiratory system (n=7S9)口 Digestive system (n=I.B4) Breast (n=799) Female genital organs (n=790) MaI? genital organs n=297) Urinary tract (n=l,590) Endocrine system (n=lS0)口 Nervous system n= 1,416) Sktn (ns264) Booe(n=570) Soft ti

5、ssue (n= 1.169)2、染色體異常的常見類型染色體異常指數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常兩類:前者包括整條染色體數(shù)目的擴增和缺失;后者包括染色體易位、插入、倒置、區(qū)帶的缺失或擴增等。下圖是染色體數(shù)目異常染色體結(jié)構(gòu)異常duplicationunbalancedtranslocationbalancedtranslocationinsertiondeletion(pericentric)inversion3、染色體異常的檢測方法染色體異常的識別得益于二十世紀六十年代后發(fā)展起來的胰蛋白酶-姬姆薩染色和常規(guī)顯帶技術(shù),使得常規(guī)篩查全基因組染色體異常和檢測染色體核型改變成為可能。染色體顯帶是細胞遺傳學(xué)分析技術(shù)

6、中標準和常用的方法,但耗時且依賴于獲得良好的分裂相,還難于分析復(fù)雜和隱匿的異常。Figure 191 The Jevolirtion, of karyarypingTo the Iflft h the karyotype described by Tia and Levan, establishing the human chromosome number js 46r to the right 沼 a nornidl hurnan femile kc'yotype. out :in-d by binding technique.PCR或熒光原位雜交(FISH, fluorescent

7、 in situ hybridization )對染色體異常的檢出依賴于引物或探 針與模板的結(jié)合,因此較常規(guī)顯帶具有更高的特異性,是高通量檢測染色體異常的敏感和特異的方法。Detection of chromosome aberration:-0如建M aitufe-0 板 *u4» l*ufci*rhaaH一 bui . mown vMOh nw»Labour inloftfiv* wtih low IhroughputEx呻 sgFISH specific*6 jido. I 1 m&rrph,wr s.-rlli-PCR - speaFic* Rhmtv* D

8、na w Rna* Hjh Ihr-oughpul 命*Detection of specific genetic abnonnali熒光原位雜交及其探針1、熒光原位雜交的原理染色體熒光原位雜交始于傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)和DNA技術(shù)的結(jié)合,這種結(jié)合開創(chuàng)了一門新的學(xué)科一-分子細胞遺傳學(xué)。其基礎(chǔ)是 Southern blot原理,以半抗原如生物素、地高辛間接標記或以熒光素直 接標記的已知核酸分子為探針,探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交,互補的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA,通過熒光標記的親和素或抗地高辛抗體將半抗原顯示出來,通過熒光顯微鏡觀察雜交信號。FISH具有

9、快速靈敏、特異性好的特點,可同時分析分裂期和間期的多個細胞,并進行定量;可以檢測隱匿或微小的染色體畸變以及復(fù)雜核型;還可以使用多種熒光標記,顯示 DNA片段及基因之間的相對位置與方向,空間定位精確。2、熒光原位雜交探針的類型FISH技術(shù)種類甚多,發(fā)展迅速,其實現(xiàn)需要獲得能與靶序列互補結(jié)合的探針。常用的探針有以下三 類:1、染色體重復(fù)序列探針,主要是指著絲粒a-衛(wèi)星DNA重復(fù)序列探針和端粒重復(fù)序列探針,用以檢測染色體數(shù)目異常,同時由于 G顯帶時,端粒區(qū)是蒼白的,因此涉及此區(qū)的易位常難以檢測,而 應(yīng)用端粒探針則彌補了 G顯帶的不足;2、染色體涂染探針,包括通過流式分選或顯微切割獲得的全 染色體或染

10、色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針,用以檢測染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常; 3、染色體單一序 列探針,包括各類人工染色體探針,如酵母人工染色體(yeast artificial chromosome, YAC)、細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC )、P1 人工染色體(P1 artificial chromosome, PAC ) 探針,主要用以識別染色體的易位、缺失和擴增。a-衛(wèi)星DNA (alpha satellite DNA)是唯個存在于所有人類染色體著絲粒區(qū)域的著絲粒DNA(centromere DNA , CEN-DNA)家族,由171bp的

11、單體為單位組成的高度串聯(lián)重復(fù)片段,重復(fù)數(shù)百 次至數(shù)千次,跨越長達100kb的著絲粒DNA區(qū)域,其雜交將產(chǎn)生很強的雜交信號。因此常被選為著 絲粒探針的來源。Acentricheterochromatin J 1 klnetochore microtubules 一centromere/ 'i x/ x/ AB higher-order repeat (0.17 kt>)alphold monomer (171 bpt AT)Figure t. Srrucuirancl Organization ol tlw Kim mchor-!and Cemrotnenc DNAThe Well

12、come Trust Sanger Institute ( Hinxton, Cambridge )由 Wellcome Trust 和 British MedicalResearch Council聯(lián)合建立,是世界上較早開展人類基因組大規(guī)模測序并具有相當實力的測序中心。該中心利用能容納大片段人類基因組 DNA的高容量載體(如粘粒、BAC、PAC等)構(gòu)建了大片段人類 基因組DNA文庫,通過文庫中末端相互重疊的 DNA片段連接成疊連群(contig)并與鳥槍法相結(jié)合,加快了基因組測序,實現(xiàn)了人類基因組計劃(Human Genome Project, HGP)中人類基因組的物理作圖(physica

13、l mapping )和基因組測序相結(jié)合的目標。因此,這些克隆文庫為基因定位研究提供了 豐富的 DNA 序列資源,NCBI Clone Registry (/genome/clone/ )、Ensembl Genome Browser(/index.html )和 UCSC Genome Bioinformatics (/ ) 提供的網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)資源也記載了許多克隆基因組定位的詳細信息,為我們選擇相應(yīng)克隆為作為染色體單一序列和端粒探針的來源提供了便利。大片段

14、人類基因組 DNA文庫的構(gòu)建過程transfect E CeltFlquiM 21: From to BAC常用的BAC、PAC文庫Tabto 1 Sources of clones usedLibraryClonB& in cunerrt whole-genome mapTypeVOdorEnzymeAcrygfj riS£ir1曲xgRPChJ, S56BPACPCYPAC2iieRPCi ir272.027BACP0AC«35EkjW174pTARB>VC:tMbdi應(yīng)RPCI 13-saostRACi£AC«3.6Mbol crDI

15、CT A心228BACueekjBACiHnOW120CT-C, 'DTtBftCpBctaCACl iHndW125CT-D2tS59BACifietoBACi t£toRj190Otherfi10231"rnp-Z HVE chcx:;嚀 rgwf lRPCt-111 V&grnfirft &§ Va* .-us. dor-t s ftmit。心 brvira 孰irrt by cotaborq ce-:回-人類基因組的鳥槍法測序和物理作圖Grmc rruppKl 1099 由距;don»Mvt.n MQLiMUiq| FIS

16、H定位檢索BAG PAC克隆的常用數(shù)據(jù)庫UCSC Genome Bioinforinatics http:genome ucac cdu/En喜GEbf Ge no rne Rrov srhttp:/vvww.erisemb org/index htrrii熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交 實驗流程英尤顯微鐐下觀斑滴片捅的擴修:機粒提IRDAP俄染老化RMaseit登性勒| V移 問翩針探物沉淀煲件Avidm-Texas Red 或 Arti-DIG- Ftuorescein 37 TJ W fl30minAnti-Avidm Texas Red 或 Anti- mouse-lg-DlGS

17、ZXUfr? fl'40min次01C睇度乙用脫水篋宜性Av id in-Texas Red 或anti- DigoxinAb 37T?蟋育胃螢白8»清化彖文過夜¥籍囂狒3既心5氟 V4XSSC 5rru5X3iX第一天缺口平移標記探針1.1試劑準備(1) 0.1mmol/L dNTP0.3mmol/L dA TP、0.3mmol/L dCTP 和 0.3mmol/L dGTP 等體積混合。(2) 0.1mmol/L dTTP1倍體積的0.3mmol/L dT TP和2倍體積的三蒸水混合。1.2缺口平移體系和反應(yīng)條件0.1mmol/L dT TP 6.5 卬 10.

18、1mmol/L dNTP 10 卬 110 x Nick Translation buffer 511mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16- dUTP 0.51Nick Translation Enzyme 101DNA (1 i g) X i 1H2O 18-X m 1in total 501以上為標記1卬g DNA的缺口平移體系,若標記更多量的DNA,則試劑量和反應(yīng)體系相應(yīng)等倍擴大。各成分混勻后短時離心。對于 < 10kb的質(zhì)粒,于15C反應(yīng)3.5小時;對于BAC/PAC,于15C反應(yīng) 9小時。1.3凝膠電泳判斷探針大小將EP管置于冰上,取其中5卬l于70C加熱

19、5分鐘后行2 %瓊脂糖凝膠電泳以觀察所標記探針的大 小,單一序列探針合適大小為200 600bp ;如片段大小偏大,則于15C延長反應(yīng)1030分鐘,再重復(fù)進行凝膠電泳,直至得到合適大小的探針。1.4終止反應(yīng)向反應(yīng)體系中加入1卬l 0.5M EDTA和(或)70C加熱5分鐘,以滅活酶。探針于-20C保存?zhèn)溆?。第二?. 探針的沉淀和變性1.1探針混合物的組成(1) 對 BAC/PAC 探針DNA探針5ulHuman Cot-1 DNA 3ulSalmon Sperm DNA 0.5ulH2O 1.5ulin total 10ul(2) 對著絲粒探針:DNA探針5ulSalmon Sperm DN

20、A 0.5ulH2O 4.5ulin total 10ul1.2 DNA的沉淀將探針混合物與 1ul (V/10 ) 3M醋酸鈉(PH5.2)和27.5ul (2.5V)無水乙醇(-20 C凍存)混合,-80C沉淀30min (或-20 C沉淀過夜),以14000g在4C離心30min,以沉淀DNA。1.3清洗沉淀小心棄去上清,用 70 %乙醇洗滌一次,再次以 14000g在4C離心15min ;小心棄去上清,在 45 50C的中溫水浴中風(fēng)干 DNA沉淀1015min。注:當大部分乙醇蒸發(fā)時,白色的DNA沉淀變?yōu)榘胪该鳡睿灰欢ㄒ獜氐浊宄掖?,否則會在加入MasterMix后產(chǎn)生微小的沉淀,導(dǎo)致

21、高背景。1.4溶解探針加入5卬l預(yù)熱至37C的去離子甲酰胺(PH 7.0 ),短時離心后在37C振搖30min以充分溶解DNA; 再加入預(yù)熱至37C的Master Mix 5卬,1短時離心后在 37C振搖1530min。注:振搖時間盡可能延長;DNA沉淀亦可以TE緩沖液1.1卬溶解后加入Vysis探針緩沖液4.4卬稀釋, 混勻后瞬時離心,37C振搖1530min。1.5探針的變性和預(yù)雜交短時離心后于80 C水浴中變性探針10min,冰浴5分鐘;短時離心,于37 C水浴中預(yù)雜交3060min ; 獨特序列探針(如cDNA)和重復(fù)序列探針(如 a-衛(wèi)星DNA)探針,無需預(yù)雜交。2. 標本(染色體靶

22、 DNA)的處理和變性2.1滴片和老化取出儲存于-20C的細胞懸液標本,以1100 rpm.離心10min沉淀細胞,換用適量體積的新鮮甲醇:冰 乙醇(v/v) =3:1固定液重懸細胞并調(diào)整細胞密度, 滴片,劃出雜交區(qū)域,晾干;在預(yù)熱到 37 °C的 2 XSSC中老化30min (也可實驗前夜室溫過夜老化再以 2 x SS(M泡2分鐘);依次于70 %、90 % 和100 %的梯度乙醇中依次脫水,每缸 2min,晾干(以下略作 梯度乙醇脫水后涼干”)。2.2 RNase A 消化每張玻片上加 30卬l 100卬g/ml RNAI (將10mg/ml的RNase A儲存液稀釋100倍)

23、,蓋上22 x22mm 蓋玻片,置于37C濕盒中孵育1小時;室溫下2X SSC中振蕩洗滌,5min/次X3次;梯度乙醇脫水后 涼干。2.3靶DNA的變性將玻片放入預(yù)溫至72 °C (每增加一張玻片,溫度要提高1C)的70 %去離子甲酰胺/2 X SSC變性2 分鐘后,立即置入預(yù)冷至-20 C保存的梯度乙醇脫水晾干。2.4蛋白酶消化將50卬l 100 mg/ml的胃蛋白酶(終濃度為 0.01 %)加入預(yù)溫至37C的50ml蒸偕水(PH 2.0,以適 量稀鹽酸酸化)中,混勻;將變性后的玻片放入其中處理 10分鐘;室溫下1XPBS中振蕩洗滌,5min/ 次X2次;室溫下梯度乙醇脫水后涼干。

24、注:靶DNA的變性和消化應(yīng)與探針變性同步進行,完成后盡快進行雜交。3. 雜交將變性后的DNA探針加于玻片雜交區(qū)域,蓋上 22m心22mm蓋玻片,封片后置于濕盒中,37 C雜 交過夜。第三天1. 雜交后洗滌和半抗原信號放大1.1雜交后洗片小心揭去封片膠和蓋玻片,將玻片置于預(yù)熱至 46 C的50 %甲酰胺/2 X SSC, 5minx3缸;將玻片 移入室溫下4XSSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5minx 2缸;每張玻片滴加 30卬1阻斷液1,蓋上 22mmx 22mm蓋玻片,于 37C濕盒中孵育30min ;再次將玻片移入室溫下 4 x SSC/0.1 % Tveen-20 中振蕩洗滌5minx 2缸。注:此后步驟應(yīng)注意避光操作。1.2滴加一抗將 41 Ant-DIG monoclonal antibody 和 0.5 卬 l Txas-red-Avidin 稀釋于 100 卬 l抗體稀釋液 1 中,混勻;每張玻片滴加25卬l于雜交區(qū)

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