血清總膽固醇TC測(cè)定操作規(guī)程

1、血清總膽固醇(TC)測(cè)定操作規(guī)程A1. 2原理血清中的膽固醇酯(CE)被膽固醇酯水解酶 (CEH)水解成游離膽固醇(Chol),后者被膽 固醇氧化酶(CHODM化成3一膽笛烯酮， 并產(chǎn)生過氧化氫，再經(jīng)過氧化物酶 (POD)催 化4一氨基安替比林與酚(三者合稱PAP), 生成紅色醍亞胺色素(Trinder 反應(yīng))。醍亞 胺的最大吸收在500nm左右，吸光度與標(biāo)本 中總膽固醇呈正比。反應(yīng)式如下：膽固醇酯+H2O CEH膽固醇+游離脂肪酸膽固醇+02 CHODZX4 -膽笛烯酮十H2022H202+4一氨基安替比林+酚POD昆亞胺 +4H2OA1. 3標(biāo)本采集與處理對(duì)于血脂分析，特別需要強(qiáng)調(diào)“分析前

2、”各 個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量管理。A1. 3.1受檢者（體檢對(duì)象或病人）的準(zhǔn)備： 除總膽固醇不一定用空腹血外，測(cè)定甘油三 酯、脂蛋白與載脂蛋白的病人必須空腹12h,不飲酒24h后采集血樣。對(duì)于體檢對(duì)象抽血 前應(yīng)有2周時(shí)間保持平時(shí)的飲食習(xí)慣，近期 內(nèi)體重穩(wěn)定，無急性病、外傷、手術(shù)等意外 情況。妊娠后期各項(xiàng)血脂都會(huì)增高，應(yīng)在產(chǎn) 后或終止哺乳后3個(gè)月檢驗(yàn)才能反映其基本 血脂水平。注意有無應(yīng)用影響血脂的藥物， 如降血脂藥、避孕藥、嚓嗪類利尿劑、3受體阻滯劑、免疫抑制劑、某些降壓劑、降糖 藥、胰島素及其他激素制劑等，檢驗(yàn)以前應(yīng) 根據(jù)所用藥物的特性停止用藥數(shù)天或數(shù)周， 否則應(yīng)記錄用藥情況。 對(duì)體檢對(duì)象及做前瞻 性觀

3、察者，還應(yīng)注意采血的季節(jié)，因?yàn)檠?水平有季節(jié)性變動(dòng)，為了前后比較應(yīng)在每年 同一季節(jié)檢驗(yàn)。應(yīng)囑體檢對(duì)象在抽血前24h內(nèi)不作劇烈運(yùn)動(dòng)。A1. 3. 2靜脈采血：除非是臥床的病人， 一般在采血時(shí)取坐位。 體位影響水分在血管 內(nèi)外的分布，因此影響血脂水平。例如站立5 min可使血脂濃度提高5%, 15 min提高 16%，故在采血前至少應(yīng)*5min。一般從 肘靜脈取血，使用止血帶的時(shí)間不超過 1 min, 穿刺成功后立即松開止血帶。靜脈阻滯5min 可使甘油三酯增高10 %15%。A1.3 . 3抗凝劑：我國(guó)多用血清作血脂檢 驗(yàn)。如用血漿，多主張用EDTANa2（1m了mL） 抗凝。抗凝血漿中的總膽

4、固醇和甘油三酯水 平比血清中約低3%, EDTA1量越多，血漿 水平偏低越明顯。但肝素抗凝不影響血漿中 水平。A1. 3. 4標(biāo)本處理：血標(biāo)本應(yīng)盡快送實(shí)驗(yàn) 室。室溫下放置30min45min后離心分離 血清或血漿，置潔凈試管加蓋保存。在室溫 中放置不超過3 h, 4C保存可穩(wěn)定4天。置 -70'C可長(zhǎng)期保存，但不可反復(fù)凍融。A1. 4試劑A1. 4. 1 酶試劑：本科使用 XX公司XX產(chǎn) 品號(hào)試劑盒，為干粉試劑。臨用前用水復(fù)溶即可使用。每瓶干粉用水 XX ml復(fù)溶。復(fù)溶 后試劑內(nèi)各主要成分如下： 磷酸鹽緩沖液pH7.7 0 . 4mol/L假單胞菌膽固醇酯水解酶> 800 U/L

5、奴卡氏菌膽固醇氧化酶> 400U/L辣根過氧化物酶 > 1000U/L膽酸鈉3mmol/L4氨基安替比林0.5mmol/L酚 3.5mmol/L聚氧乙烯表面活性劑3g/LA1.4.2總膽固醇校準(zhǔn)血清：也由 XX公司提 供，產(chǎn)品號(hào)為XXA1.4.3試劑與校準(zhǔn)血清的穩(wěn)定性：未開瓶 的試劑于4C保存，可穩(wěn)定至有效期。復(fù)溶 的試劑在2C8C可穩(wěn)定7天，15C 25C 可穩(wěn)定3天。如在穩(wěn)定期內(nèi)試劑出現(xiàn)明顯的 粉紅色，棄去不用oA1.5儀器，XX型號(hào)光電比色計(jì)，具500nm520nm濾光片。A1.6操作標(biāo)本為及時(shí)分離的空腹血清，以及肝素或EDT硫凝血漿。本法為終點(diǎn)法。測(cè)定時(shí)標(biāo)本 管與標(biāo)準(zhǔn)管分別

6、加入標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)血清各10uL，酶試劑1. 00mL混勻后在37C放置 5 min，或20C25C放置10min后用比色 計(jì)比色，以試劑空白調(diào)零，波長(zhǎng)500nm或520nm顏色至少穩(wěn)定60min。A.1 . 7計(jì)算A測(cè)定C= X C0 (A1)A標(biāo)準(zhǔn)式中：C測(cè)定血清總膽固醇濃度，mmol / L;A測(cè)定一一標(biāo)本管吸光度；A標(biāo)準(zhǔn)一一標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；Co-一校準(zhǔn)血清中總膽固醇濃度，mmol/ L;A, 1. 8操作性能A1. 8. 1精密度：批內(nèi)CV<1.5%,批間 CV<2.5%;A1. 8. 2準(zhǔn)確度：以參考方法（ALBK法）定 值的血清為校準(zhǔn)品時(shí)，本法測(cè)定結(jié)果與ALBK 法基本一致。

7、A1. 8. 3靈敏度：以酚為顯色劑，總膽固 醇為5.2mmol/L時(shí)的顯色吸光度 A500nm約 0.30 0.35。A1. 8. 4可報(bào)告范圍：血清與酶試劑用量 之比為1: 100時(shí)，測(cè)定上限為13 mmol/L。A1. 8. 5特異性：血清中多種非膽固醇笛 醇會(huì)不同程度地與本試劑顯色。一般人血清 中非膽固醇笛醇約占總膽固醇的1%,在常規(guī)測(cè)定時(shí)這種影響可以不計(jì)。A1. 8. 6干擾：血紅蛋白高于 2g/L時(shí)會(huì)引 起正干擾；膽紅素>170umol/L時(shí)有明顯負(fù)干 擾?？箟难崤c甲基多巴血中濃度高于治療水平時(shí)也使結(jié)果偏低。高甘油三酯血癥（血 清混濁）在本法中（血清與試劑量1 : 100時(shí)

8、） 一般無明顯影響。注1本法為中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)推薦的總膽 固醇測(cè)定常規(guī)方法（見中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志 1995, 18: 185）。2試劑中兩種酶一膽固醇酯水解酶和膽固 醇氧化酶的質(zhì)量十分重要。必須能有效地水 解各種脂肪酸的膽固醇酯（有些微生物來源 的酯酶不易水解花生四烯酸酯），對(duì)膽固醇 的氧化必須完全。選擇試劑盒時(shí)應(yīng)測(cè)試對(duì)血 清標(biāo)本總膽固醇的反應(yīng)速度，好的試劑一般 能在5min內(nèi)（有的只要1min2min）反應(yīng)達(dá) 到終點(diǎn)。反應(yīng)不能在10min內(nèi)完成的試劑不 宜采用，其原因可能是原酶質(zhì)量不好或酶用 量太少，后者可使高膽固醇結(jié)果偏低。本法 所用試劑，要求標(biāo)本與酶試劑用量的比例為 l : 100,使可

9、報(bào)告范圍上限達(dá) 13mmo1/L過 多地提高標(biāo)本比例，會(huì)使測(cè)定上限降低。如 果標(biāo)本中總膽固醇濃度超過13mmol/L,可 用生理鹽水稀釋后重新測(cè)定。現(xiàn)在臨床很少 要求做游離膽固醇測(cè)定，如需做游離膽固醇 測(cè)定，最簡(jiǎn)便的也是酶法，即在上述總膽固 醇試劑中省去酯水解酶；一般游離膽固醇約 占膽固醇的30%左右。3總膽固醇測(cè)定要求標(biāo)準(zhǔn)化， 與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)取 得一致，必須有準(zhǔn)確可靠的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì) (SRM)。1) 酶法測(cè)定總膽固醇時(shí)，血清中大部分膽固 醇是酯化的，而且血清基體對(duì)酶反應(yīng)有明顯 影響，不可使用純膽固醇溶液為標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)際 上由美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院 (NIST)提 供代號(hào)為SRM909勺人參考血清，

10、作為總膽 固醇測(cè)定的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；我國(guó)也已建立了國(guó)家 一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)GBW 09138“人血清膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì)”。常規(guī)使用的試劑盒必須具有可追溯于 以上參考血清的校準(zhǔn)血清，方能保證檢驗(yàn)結(jié) 果準(zhǔn)確可靠。2) 不可使用總膽固醇的定值控制品作標(biāo)準(zhǔn)。3) 本法使用的校準(zhǔn)血清為液態(tài)，用前必須充 分混勻。A1.9參考值人群血脂水平主要決定于生活因素，特別是飲食營(yíng)養(yǎng)，所以各地區(qū)調(diào)查所得參考值高低 不一，應(yīng)根據(jù)冠心病流行病學(xué)研究及臨床經(jīng) 驗(yàn)統(tǒng).一制定高膽固醇劃分標(biāo)準(zhǔn)。歐美國(guó)家 制定的標(biāo)準(zhǔn)大致相同，40歲以上人群總膽固 醇水平高低的劃分大致可定為：合適水平 <5.17mm01/L(200mg/d1);邊緣水平5.1

11、7mm01/L 6.46mmol/L(201mg/dl 219mg/dl);高膽固醇血癥> 6.47mm01/L(A220mg/dl)。A1. 10 臨床意義 影響總膽固醇水平的因素有：A1. 10. 1年齡與性別?？偰懝檀妓酵?隨年齡上升，但到70歲或80歲后有所下降, 中青年期女性低于男性，50歲以后女性高于 男性；A1. 10.2長(zhǎng)期高膽固醇、高飽合脂肪酸和 高熱量飲食可使總膽固醇增高；A1. 10. 3遺傳因素；A1. 10. 4其他。如缺少運(yùn)動(dòng)、腦力勞動(dòng)、 精神緊張等可使總膽固醇升高。高膽固醇血癥是冠心病的主要危險(xiǎn)因素之 一。病理狀態(tài)下高膽固醇有原發(fā)與繼發(fā)的兩 類。原發(fā)的如家屬性高膽固醇血癥 （低密度 脂蛋白受體缺陷）、家屬性apo B缺陷癥、 多源性（polygenic）高總膽固醇、混合性高 脂蛋白血癥。繼發(fā)的見于腎病綜合征、甲狀 腺機(jī)能減退、糖尿病、妊娠等。低總膽固醇血癥也有原發(fā)的與繼發(fā)的，前者 如家屬性的無6或低脂蛋白血癥；后者如 甲亢、營(yíng)養(yǎng)不良、慢性消耗性疾病等。低總 膽固醇者