免疫熒光操作步驟及注意事項

1、免疫熒光操作步驟及注意事項免疫熒光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用 這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原（或抗體）。利用熒光 顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及 利用定量技術（比如流式細胞儀）測定含量。紫外光激發(fā)熒光物質放射熒光示意圖免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的第 一步，細胞片的質量對實驗的成敗至關重要，原因很簡單，如果發(fā)生細

2、胞掉片，一 切都無從談起。這一步關鍵的是玻片（Slides or Coverslips） 的處理以及細胞的活 力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結出許多有益的細節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通 透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質選擇適當?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固 定程序對于獲得好的實驗結果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它 方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫 熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更 加關鍵。最后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片 后在4?或-20?避光保存，以

3、免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結果。由于操作步驟比較多，同時在分析結果時無法像WB那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識別，所以要得到一個完美的免疫熒光實驗結果，除了需要高質量 的抗體，以及對實驗條件進行反復優(yōu)化外，還必須設立嚴謹?shù)膶嶒瀸φ??？傊?疫熒光實驗從細胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每 步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個步驟的質量，才能最終達到你的實驗 目的?；緦嶒灢襟E :(1) 細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次;對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞

4、，用 PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次，用細胞離心 甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。(2) 固定。根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎?。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4?保存3個月。PBS洗滌3X 5 min.(3) 通透。使用交聯(lián)劑 (如多聚甲醛 )固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育 前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮 抗原蛋白的性質。通透的時間一般在 5-15min.通透后用PBS洗滌3X 5 min.(4) 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為 30min.(5) 一抗結合。室溫孵育1h或者4?過夜。PBST漂洗3次，

5、每次沖洗5min.(6) 二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育Ih.PBST漂洗3次，每次沖洗 5min 后，再用蒸餾水漂洗一次。(7) 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。( 一 ) 細胞準備 用于免疫熒光實驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經(jīng) 過離心后涂片的懸浮細胞或者是將取自體內(nèi)的組織細胞懸液離心后涂片。貼壁良好 的細胞一般在培養(yǎng)時直接放入 coverslips 讓細胞生長在其上即可，盡量避免使用 貼壁性能不好的細胞進行免疫熒光實驗，以免后續(xù)的漂洗操作引起細胞脫落。少數(shù) 實驗需要使用這類細胞或者懸浮細胞進行免疫熒光觀察，建議使用細胞離心甩片機

6、制備細胞片或直接制備細胞涂片。（ 二 ） 固定和通透 除研究細胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應固定。固定的目的有?防止細胞從玻片上脫落 ; ? 除去防礙抗原 -抗體結合的類脂 ; ? 使標本易于保 存。標本的固定原則是 :?不能損傷細胞內(nèi)的抗原 ; ? 不能凝集蛋白質 ; ? 應保持細胞和亞細胞結構 ;?固定后應保持通透性，以保證抗體自由進入所有細胞與亞細胞組分與抗原結 合。常用的固定劑有多種，應根據(jù)所研究抗原的性質和所使用的抗體特性選擇適當 的固定劑。通常固定方法可以分為兩類 : 有機溶劑和交聯(lián)劑。有機溶劑如甲醇和丙 酮等可去除類脂并使細胞脫水，同時將細胞結構蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚

7、甲醛通常 通過自由氨基酸基團形成分子間橋連，從而產(chǎn)生一種抗原相互連接的網(wǎng)絡結構。交 聯(lián)劑比有機溶劑更易于保持細胞的結構，但因為交聯(lián)阻礙抗體結合，可能會降低一 些細胞組分的抗原性，因此需要增加一個通透步驟以使抗體能夠進入標本。兩種固 定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原生產(chǎn)的抗體在免疫熒光 中可能更為有效。最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數(shù)情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進 行固定。通常，細胞結構抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇及高濃度的甲 醛固定可獲得較好的結果，而細胞膜相關組分抗原一般以多聚甲醛固定。細胞器和細胞顆粒內(nèi)的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要進行通透以使抗體能

8、達到抗原表 位。通透步驟只在檢測細胞內(nèi)抗原表位的時候才需要，因為抗體需要進入細胞內(nèi)部 去檢測蛋白。但是，如果待檢測的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質內(nèi)區(qū)域，則 同樣需要對細胞進行通透。相反，如果所檢測的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則 不需要進行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時是不需要通透 的。甲醇同樣具有通透作用，但有些場合并不適合用甲醇，因為一些表位對甲醇非 常敏感。常用的通透劑是去垢劑，如 Triton ,NP-40, 以及 Tween 20, Saponin, Digit onin 和Leucoperm等。Trit on和NP-40屬于烈性去垢劑，可部分溶解細胞 核膜，

9、因此非常適合核抗原檢測。但應該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用 時間過長，它們將破壞蛋白，從而影響實驗結果。 Triton X-100 是最常用的通透 劑，但是它將破壞細胞膜，因此不適用于細胞膜相關抗原。后面一組去垢劑要溫和 得多，它們可以在細胞質膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會溶解細 胞質膜。適于胞質抗原或者質膜上靠近胞質一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。一般的操作程序是先固定后通透，但針對有些水不溶性的目的抗原的檢測宜先 通透再固定，這樣做的原因主要是可以通過通透去除許多水溶性的蛋白，從而大大 減少了免疫熒光的背景和非特異性信號。固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸餾水沖洗，防

10、止自發(fā)性熒光。（ 三 ） 封閉封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結合，最常用的封閉劑為 1% BSA, PBS pH 7.5, 其他可選擇的封閉劑還有 1% gelatin, 1%bovine 或與二抗種屬相同的血 清（3-10%）等。（ 四 ） 抗體孵育直接免疫熒光法中的一抗和間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體，因此在這 些抗體孵育的時候必須注意避光。此外，為保證結合質量和防止干燥，抗體孵育應 盡量在濕盒中進行。（ 五 ） 封片及熒光觀察 標記好熒光的細胞片原則上可以直接進行觀察，特別是有時候封片不當反而使 得前功盡棄。但在絕大多數(shù)情況下，為了保存結果，以便進一步觀察、照像、統(tǒng)計 分析等，需作封片處理。常規(guī)的方法是采用甘油或中性樹脂封片，為了增強封片的 效果，往往需要在封片時添加特殊的抗熒光淬滅劑。（ 六 ） 標本保存由于熒光色素和蛋白質分子的穩(wěn)定性都是相對的，因此隨著保存時間的延長， 在各種條件影響下，標記蛋白可能變性解離，失去