基因編輯技術(shù)PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計(jì)學(xué)1基因編輯技術(shù)基因編輯技術(shù)2015.11.18 DNA剪切技術(shù)治療1歲女童獲成功 第1頁/共124頁基因組編輯技術(shù)簡介Genome Editing2015.11.22 HuangCH J208第2頁/共124頁修改遺傳信息的第一步：修改遺傳信息的第一步：按我們的設(shè)計(jì)來重組按我們的設(shè)計(jì)來重組DNADNA第3頁/共124頁第一節(jié)第一節(jié) 基基 本本 概概 念念第4頁/共124頁重組重組DNADNA技術(shù)：技術(shù)： 是指在基因水平上，將是指在基因水平上，將目目的的DNADNA在體外在體外重組重組于能自我復(fù)制于能自我復(fù)制的的載體載體DNADNA分子分子上，然后將重組上，然后將重組DNADNA導(dǎo)入宿主細(xì)

2、胞中進(jìn)行增生，導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增生，以獲得大量的目的以獲得大量的目的DNADNA片段，或片段，或以此為基礎(chǔ)，通過基因的誘導(dǎo)以此為基礎(chǔ)，通過基因的誘導(dǎo)表達(dá)，得到大量相應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)表達(dá)，得到大量相應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過程。物的過程。 又稱為又稱為分子克隆技術(shù)分子克隆技術(shù)或或基基因工程技術(shù)因工程技術(shù)第5頁/共124頁第二節(jié)第二節(jié) 重組重組DNADNA技術(shù)的發(fā)展史技術(shù)的發(fā)展史第6頁/共124頁基因工程的誕生基因工程的誕生1 1、BergBerg的開創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)第一個實(shí)現(xiàn)的開創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)第一個實(shí)現(xiàn)DNADNA重組重組1980年年Nobel化學(xué)獎化學(xué)獎猴病毒猴病毒SV40SV40的的DNA+DNA+噬菌體的噬菌體的DN

3、ADNA第一個取得基因工程成功第一個取得基因工程成功19731973年構(gòu)建年構(gòu)建雙重抗藥性重組質(zhì)粒雙重抗藥性重組質(zhì)粒19731973年是基因工程誕生的元年年是基因工程誕生的元年第7頁/共124頁第三節(jié)第三節(jié) 工具酶工具酶第8頁/共124頁Werner Arber Werner Arber 理論預(yù)見限制酶理論預(yù)見限制酶Hamilton O. Smith Hamilton O. Smith 得到第一個限制酶得到第一個限制酶Daniel Nathans Daniel Nathans 用限制酶切得用限制酶切得SV40 SV40 DNADNA片斷片斷19781978年年NobelNobel生理或醫(yī)學(xué)獎生

4、理或醫(yī)學(xué)獎1 1、 “基因剪刀基因剪刀”限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 第9頁/共124頁1.1.定義：定義：能識別雙鏈能識別雙鏈DNADNA分子中某分子中某特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列，并，并 在識別序列內(nèi)或附近切割在識別序列內(nèi)或附近切割DNADNA雙鏈結(jié)構(gòu)的一類核雙鏈結(jié)構(gòu)的一類核 酸內(nèi)切酶（在核酸分子鏈的酸內(nèi)切酶（在核酸分子鏈的內(nèi)部內(nèi)部制造切口的酶）制造切口的酶）。2.2.來源來源：原核生物原核生物第10頁/共124頁型酶、型酶、型酶：型酶： 具有限制切割與甲基化修飾活性。具有限制切割與甲基化修飾活性。型和型和型酶都沒型酶都沒有多大的實(shí)用價(jià)值。有多大的實(shí)用價(jià)值。型酶：型酶： 應(yīng)用廣泛

5、，能在應(yīng)用廣泛，能在DNADNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)，識別和切分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)，識別和切割雙鏈割雙鏈DNADNA，其切割位點(diǎn)的序列可知、固定。其切割位點(diǎn)的序列可知、固定。 通常所說的限制性內(nèi)切酶就是指通常所說的限制性內(nèi)切酶就是指型酶。型酶。3.分類分類：根據(jù)結(jié)構(gòu)、作用特點(diǎn)不同，分為三類。：根據(jù)結(jié)構(gòu)、作用特點(diǎn)不同，分為三類。第11頁/共124頁識別位點(diǎn)：識別位點(diǎn)：即為即為型酶識別的特殊型酶識別的特殊DNADNA序列序列。通常是通常是4 48 8個堿基對、具有個堿基對、具有回文序列回文序列的的DNADNA片段片段 5 G A A T T C - 3 3 C T T A A G - 54.識別和切割

6、位點(diǎn)：識別和切割位點(diǎn)：第12頁/共124頁 5 5突出粘性末端突出粘性末端 3 3突出粘性末端突出粘性末端 平頭（鈍性末端）平頭（鈍性末端）第13頁/共124頁55突出黏性末端突出黏性末端( (EcoR) )：33突出黏性末端突出黏性末端( (Pst) )：平端缺口（鈍性末端）平端缺口（鈍性末端）( ( Sma） 5-5-G GAATTC-3 5-G AATTC-3 AATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAA 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5G-5 3-CTTAA G-55-5-CTGCACTGCAG-3 5-CTGCA G-3G-3 5-CTGCA G-33-G3-G

7、ACGTC-5 3-G ACGTC-5ACGTC-5 3-G ACGTC-55-5-CCCCCCGGG-3 5-CCC GGG-3GGG-3 5-CCC GGG-33-GGG3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5CCC-5 3-GGG CCC-5切割方式：切割方式：對對dsDNA 2條鏈同時(shí)切割產(chǎn)生條鏈同時(shí)切割產(chǎn)生3種種不同缺口不同缺口第14頁/共124頁 2 2、DNADNA連接酶連接酶 催化催化DNADNA中相鄰的中相鄰的55端磷酸基和端磷酸基和3-3-OHOH末端之間形成末端之間形成3535磷酸二酯鍵。磷酸二酯鍵。 大腸桿菌連接酶大腸桿菌連接酶，只能連接粘性末端，只能連接粘性末端，

8、T4T4噬菌體連接酶噬菌體連接酶不不但能連接粘性末端，但能連接粘性末端， 還能連接齊平末端。還能連接齊平末端。ACG-OH P-AATTCGTTACTTAA-P OH-GCA -ACGAATTCGT- -TGCTTAAGCA第15頁/共124頁 3 3、DNADNA聚合酶聚合酶具有具有5353聚合活性、聚合活性、5353外切酶活性、外切酶活性、3535外外切酶活性。切酶活性。可用于合成雙鏈可用于合成雙鏈cDNAcDNA分子或片斷連接，探針制備，序分子或片斷連接，探針制備，序列分析等。列分析等。 耐熱耐熱DNADNA聚合酶聚合酶 最適反應(yīng)溫度為最適反應(yīng)溫度為75758080 具有具有5353外切

9、酶活性，不具有外切酶活性，不具有3535外切酶活性外切酶活性第16頁/共124頁 （1 1）55端標(biāo)記端標(biāo)記 （2 2）制備載體時(shí)，用堿性磷酸酶處理后，可防止載體自身）制備載體時(shí)，用堿性磷酸酶處理后，可防止載體自身 連接，提高重組效率。連接，提高重組效率。 堿性磷酸酶有細(xì)菌堿性磷酸酶（堿性磷酸酶有細(xì)菌堿性磷酸酶（BAPBAP）和牛小腸堿性磷酸和牛小腸堿性磷酸 酶（酶（CIPCIP）。）。CIPCIP能在能在 1% 1% SDSSDS溶液中溶液中68 68 加熱加熱15 15 minmin而而 失活，故失活，故CIPCIP較為常用。較為常用。 4 4、堿性磷酸酶、堿性磷酸酶 去除去除DNA、RN

10、A、dNTP和和NTP 5端的磷酸根。端的磷酸根。第17頁/共124頁催化單脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移到催化單脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移到DNA3-DNA3-端羥基上。端羥基上。應(yīng)用：探針標(biāo)記，標(biāo)記測序以及制備人工黏性末應(yīng)用：探針標(biāo)記，標(biāo)記測序以及制備人工黏性末端。端。催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸55羥基末端磷酸化。羥基末端磷酸化。用途：放射性標(biāo)記用途：放射性標(biāo)記DNADNA的的55端端 使缺少使缺少5-5-磷酸基的磷酸基的DNADNA磷酸化用于連接反應(yīng)。磷酸化用于連接反應(yīng)。單鏈核酸內(nèi)切酶，降解單鏈單鏈核酸內(nèi)切酶，降解單鏈DNADNA或或RNARNA。6 6、T4T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶7 7、S1S1核酸酶

11、核酸酶5 5、末端轉(zhuǎn)移酶、末端轉(zhuǎn)移酶第18頁/共124頁第四節(jié)第四節(jié) 重組重組DNADNA技術(shù)常用載體技術(shù)常用載體第19頁/共124頁 是指能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行是指能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增擴(kuò)增和和表達(dá)表達(dá)的的一類一類DNADNA分子。分子。 一、定義一、定義 分類：分類：克隆載體：克隆載體：用于在宿主細(xì)胞中用于在宿主細(xì)胞中克隆克隆和和擴(kuò)增擴(kuò)增外外 源源DNADNA片段。片段。 表達(dá)載體：表達(dá)載體：用于在宿主細(xì)胞中獲得外源基因用于在宿主細(xì)胞中獲得外源基因 表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物。產(chǎn)物。第20頁/共124頁 二、特點(diǎn)二、特點(diǎn) 第21頁/共124頁 這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并

12、賦這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能：如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單予一些新的功能：如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。一的限制酶切點(diǎn)等。 3、常用載體、常用載體 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA、噬菌體、噬菌體DNADNA、病毒、病毒DNADNA、酵母、酵母DNADNA第22頁/共124頁 第23頁/共124頁pBR322pBR322質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體相對分子質(zhì)量小，相對分子質(zhì)量小，kbkb。含有氨芐青霉素和四環(huán)素的抗含有氨芐青霉素和四環(huán)素的抗性基因性基因( (AmpAmpr r和和TetTetr r) )。有有2424種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。有一個復(fù)制起

13、始點(diǎn)（有一個復(fù)制起始點(diǎn)（oriori）及與及與DNADNA復(fù)制有關(guān)的序列，賦予該質(zhì)粒復(fù)制有關(guān)的序列，賦予該質(zhì)粒復(fù)制子特性。復(fù)制子特性。為松弛型復(fù)制子。為松弛型復(fù)制子。第24頁/共124頁2 2、噬菌體（、噬菌體（bacteriophage,phage)bacteriophage,phage)第25頁/共124頁噬菌體生活周期噬菌體生活周期第26頁/共124頁第27頁/共124頁3 3、酵母、酵母酵母人工染色體（酵母人工染色體（YACYAC）：用于大片段：用于大片段DNADNA的克隆的克隆。第28頁/共124頁第五節(jié)第五節(jié) 重組重組DNADNA技術(shù)技術(shù)第29頁/共124頁 基本步驟基本步驟 目的

14、基因的獲取目的基因的獲取重組重組DNADNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌目的基因與載體目的基因與載體連接成重組連接成重組DNADNA克隆載體的選克隆載體的選擇擇重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 第30頁/共124頁1 1、 制備目的基因制備目的基因（1 1）化學(xué)合成：）化學(xué)合成： 已知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列或或根據(jù)基因產(chǎn)物的氨基酸序根據(jù)基因產(chǎn)物的氨基酸序列推導(dǎo)出相應(yīng)基因列推導(dǎo)出相應(yīng)基因DNADNA堿基序列。堿基序列。 目前使用目前使用DNADNA合成儀合成的片段長度有限，一般用于小合成儀合成的片段長度有限，一般用于小分子活性多肽基因的合成，較長的鏈則須分段合成

15、，然后用分子活性多肽基因的合成，較長的鏈則須分段合成，然后用連接酶加以連接。連接酶加以連接。第31頁/共124頁（2 2）構(gòu)建基因組）構(gòu)建基因組DNADNA文庫：文庫： 將某種生物細(xì)胞的將某種生物細(xì)胞的整個整個基基因組因組DNADNA用物理或酶學(xué)的方法用物理或酶學(xué)的方法切割成預(yù)期大小的切割成預(yù)期大小的片斷片斷，并，并將將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中中保存和擴(kuò)增。保存和擴(kuò)增。 理論上講，這些重組載體理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基上帶有了該生物體的全部基因，稱為因，稱為基因文庫基因文庫。第32頁/共124頁(

16、3)(3)構(gòu)建構(gòu)建cDNAcDNA文庫：文庫： 第33頁/共124頁分離獲得目的基因。分離獲得目的基因。(4)(4)聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（PCRPCR） 已知目的基因的基因序列，用已知目的基因的基因序列，用PCRPCR從基因組從基因組DNADNA中獲得目的基因，或用逆轉(zhuǎn)錄中獲得目的基因，或用逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR方法直接方法直接從從mRNAmRNA獲得特定基因的獲得特定基因的cDNAcDNA。 第34頁/共124頁 2 2、克隆載體的選擇和構(gòu)建、克隆載體的選擇和構(gòu)建 用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的噬菌體噬菌體和黏性質(zhì)粒；和黏性質(zhì)粒； cD

17、NA cDNA文庫和克隆較小文庫和克隆較小DNADNA片段通常選片段通常選pUCpUC系列質(zhì)粒；系列質(zhì)粒； 待測待測DNADNA序列使用序列使用M13M13噬菌體。噬菌體。第35頁/共124頁 由同一種限制酶由同一種限制酶切割或不同的限制酶切切割或不同的限制酶切割形成割形成互補(bǔ)的黏性末端互補(bǔ)的黏性末端。經(jīng)退火后，由。經(jīng)退火后，由DNADNA連連接酶連接。接酶連接。3 3、目的基因與載體的連、目的基因與載體的連接接粘性末端連接：粘性末端連接：第36頁/共124頁（2 2）平端連接）平端連接：第37頁/共124頁（3 3）定向連接：）定向連接：GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco

18、 Eco RR切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABgBg ll切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4T4 DNADNA連接酶連接酶重組體重組體第38頁/共124頁第39頁/共124頁 接頭接頭是指含有某些是指含有某些限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的寡限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的寡核苷酸片段。核苷酸片段。CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R第40頁/共124頁將重組將重組DNADNA或其他外源或其他外源D

19、NADNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的常用方法：導(dǎo)入宿主細(xì)胞的常用方法：轉(zhuǎn)化、感染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔等。轉(zhuǎn)化、感染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔等。轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformationtransformation）：是指將重組質(zhì)粒：是指將重組質(zhì)粒DNADNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞。轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染（transfectiontransfection）：將重組噬菌體：將重組噬菌體DNADNA直接引入受體細(xì)直接引入受體細(xì)胞的過程。胞的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)（轉(zhuǎn)導(dǎo)（transductiontransduction）：重組噬菌體：重組噬菌體DNADNA分子，在體外經(jīng)過分子，在體外經(jīng)過包包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒，再以此噬菌體

20、為載體，將裝成具有感染能力的噬菌體顆粒，再以此噬菌體為載體，將重組重組DNADNA導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)的過程，也稱為感染（導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)的過程，也稱為感染（infection）。 第41頁/共124頁第42頁/共124頁 （一）根據(jù)遺傳表型進(jìn)行篩選的方法（一）根據(jù)遺傳表型進(jìn)行篩選的方法 （1 1）抗生素抗性篩選）抗生素抗性篩選 （2 2）- -半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選（二）（二）根據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選的方法根據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選的方法方法：方法：第43頁/共124頁（1 1）抗生素抗性篩選）抗生素抗性篩選: : 大多數(shù)載體均帶有抗生素抗性基因大多數(shù)載體均帶有抗生素抗性基因（一）根

21、據(jù)遺傳表型進(jìn)行篩選的方法（一）根據(jù)遺傳表型進(jìn)行篩選的方法 b.b.插入失活法插入失活法: :外源基因插入到一個抗性基因位點(diǎn)，使外源基因插入到一個抗性基因位點(diǎn)，使 此種抗生素抗性消失，重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不能在含有此種抗生素抗性消失，重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不能在含有 這種抗生素的培養(yǎng)基中生長。這種抗生素的培養(yǎng)基中生長。a.a.構(gòu)建重組體時(shí)，保留了抗性基因活性，所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞構(gòu)建重組體時(shí)，保留了抗性基因活性，所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 就能在含此種抗生素的培養(yǎng)基中生長就能在含此種抗生素的培養(yǎng)基中生長, ,未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 則不能生長。則不能生長。第44頁/共124頁( (插入失活法插入失活法) )抗生素抗性篩選抗生

22、素抗性篩選第45頁/共124頁（2 2） - -半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選第46頁/共124頁第47頁/共124頁（二）根據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選的方法（二）根據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選的方法 （1 1）快速裂解菌落并鑒定分子大小）快速裂解菌落并鑒定分子大?。? 2）內(nèi)切酶酶切圖譜鑒定）內(nèi)切酶酶切圖譜鑒定（3 3）分子雜交）分子雜交（4 4）PCRPCR（5 5）核酸序列測定）核酸序列測定第48頁/共124頁（1 1）分分離：提取和獲得目的基因和載體離：提取和獲得目的基因和載體（2 2）切切割：分別對目的基因和載體割：分別對目的基因和載體DNADNA 酶切；酶切；（3 3）連連接：目的

23、基因與載體連接，形成接：目的基因與載體連接，形成 新的重組新的重組 DNADNA分子；分子；（4 4）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化：用重組化：用重組DNADNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)分子轉(zhuǎn)化受體細(xì) 胞；胞；（5 5）篩篩選：篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克隆選：篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克隆（6 6）表表達(dá)：培養(yǎng)獲得外源基因的細(xì)胞或達(dá)：培養(yǎng)獲得外源基因的細(xì)胞或 生物體，獲得所需的遺傳性生物體，獲得所需的遺傳性 狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。小結(jié)：小結(jié)：第49頁/共124頁修改遺傳信息的第二步：修改遺傳信息的第二步：怎樣將需要的信息導(dǎo)入到細(xì)胞？怎樣將需要的信息導(dǎo)入到細(xì)胞？第50頁/共124頁重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒DNADNA轉(zhuǎn)化微生

24、物轉(zhuǎn)化微生物化學(xué)轉(zhuǎn)化法化學(xué)轉(zhuǎn)化法電轉(zhuǎn)化法電轉(zhuǎn)化法基因槍轉(zhuǎn)化法基因槍轉(zhuǎn)化法第51頁/共124頁電轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)電轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)適用微生物多適用微生物多效率高效率高死亡率高死亡率高化學(xué)轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)化學(xué)轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)適用微生物較少適用微生物較少效率較高效率較高第52頁/共124頁基因槍轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)基因槍轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)適用微生物較少適用微生物較少效率較高效率較高第53頁/共124頁革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化一般需要制備原生質(zhì)體一般需要制備原生質(zhì)體第54頁/共124頁真菌的轉(zhuǎn)化真菌的轉(zhuǎn)化一般需要制備原生質(zhì)體一般需要制備原生質(zhì)體第55頁/共124頁植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù) 第56頁/

25、共124頁圖10-1 農(nóng)桿菌侵染傷口的模式圖第57頁/共124頁第58頁/共124頁基因槍介導(dǎo)法基因槍介導(dǎo)法電轉(zhuǎn)化法電轉(zhuǎn)化法PEG轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化法花粉管通道法花粉管通道法第59頁/共124頁動物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)動物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù) 第60頁/共124頁原核顯微注射法原核顯微注射法胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法病毒載體法病毒載體法第61頁/共124頁在隨后的時(shí)間里基因敲除技術(shù)得到了進(jìn)一步發(fā)展和完善基因重組基因重組/敲除的概念及簡史敲除的概念及簡史第62頁/共124頁基因敲除的原理基因敲除的原理基因突變基因突變RNAi同源重組同源重組第63頁/共124頁RNAi引起基因敲除的機(jī)制引起基因敲除的機(jī)

26、制第64頁/共124頁同源重組引起的基因敲除同源重組引起的基因敲除第65頁/共124頁單交換單交換雙交換雙交換圖圖1圖圖2同同 源源 重重 組組 原原 理理 圖圖 示示第66頁/共124頁構(gòu)建與靶基因同源構(gòu)建與靶基因同源 (1015kb)的載體的載體外顯子插有外顯子插有新霉素抗新霉素抗性基因性基因 （neor）作為）作為正選擇正選擇皰疹病毒胸苷激酶皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作為基因作為負(fù)選擇負(fù)選擇neor 和和HSV-tk作雙重篩選作雙重篩選 存活的存活的ES細(xì)胞細(xì)胞將重組體導(dǎo)入將重組體導(dǎo)入ES細(xì)胞，體外培養(yǎng)細(xì)胞，體外培養(yǎng)顯微注射顯微注射回交得到回交得到X被敲除的動物被敲除的動物表型

27、分析表型分析同源重組引起的基因敲除同源重組引起的基因敲除ES細(xì)胞細(xì)胞技技 術(shù)術(shù) 路路 線線第67頁/共124頁圖圖 示示第68頁/共124頁第69頁/共124頁ZFN 技術(shù)原技術(shù)原理理鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸內(nèi)切酶，利用不同的鋅指結(jié)構(gòu)識別特異DNA序列，利用核酸酶切斷靶DNA。鋅指結(jié)構(gòu)中每一個螺旋可以特異識別3-4個堿基；人工設(shè)計(jì)識別特異DNA序列的螺旋采用如上的通用序列，通過改變其中7個X來實(shí)現(xiàn)識別不同的三聯(lián)體堿基，TGEK是多個螺旋間的連接序列；構(gòu)建成對人工鋅指結(jié)構(gòu)域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定區(qū)域切斷DNA雙鏈。第

28、70頁/共124頁ZFN 技術(shù)鋅指核酸酶介導(dǎo)的定向染色體刪除研究人員可以利用ZFN技術(shù)進(jìn)行各種基因編輯，比如基因敲除。已建立有ZFN庫，識別多種DNA序列，但還不能達(dá)到識別任意靶DNA的目的，其應(yīng)用受到一定的限制。第71頁/共124頁第72頁/共124頁嶄新的技術(shù)嶄新的技術(shù) - TALEN經(jīng)典的挑戰(zhàn)經(jīng)典的挑戰(zhàn) 染色體染色體DNA序列的人工編輯修改序列的人工編輯修改 （點(diǎn)）突變：（點(diǎn)）突變：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除，（基因敲除，Knockout） 片段刪除片段刪除 片段插入片段插入目的與用途：生物模型；表達(dá)工具；基因治療目的與用途：生

29、物模型；表達(dá)工具；基因治療嶄新的技術(shù)解決經(jīng)典的挑戰(zhàn)第73頁/共124頁第74頁/共124頁基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向基因敲除技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具，現(xiàn)已應(yīng)用于細(xì)胞、酵母、斑馬魚與大鼠等各類研究對象。技術(shù)原理：技術(shù)原理：表達(dá)一個重組核酸酶，在靶點(diǎn)識別結(jié)構(gòu)域的作用下，核酸酶識別靶點(diǎn)核酸序列，并發(fā)揮內(nèi)切酶活性，從而打斷目標(biāo)基因，完成基因敲除的過程。第75頁/共124頁第76頁/共124頁102堿基模塊單元 14 18個重復(fù)真核表達(dá) 14 18個重復(fù)特異識別指定的14 -18 個核酸序列并

30、與之結(jié)合34氨基酸單元第77頁/共124頁TALEN 發(fā)展過程第78頁/共124頁TALEN (TALE+FOK I) 表達(dá)質(zhì)粒對 TALEN 基因敲除X 2TALEN 表達(dá)質(zhì)粒對轉(zhuǎn)染、表達(dá)切割靶位點(diǎn)切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯誤的個體即形成目標(biāo)基因敲除突變體第79頁/共124頁TALEN介導(dǎo)的同源重組同源重組發(fā)生率升高幾個數(shù)量級Donor plasmidHRDonor plasmidLeft armRight armDonor plasmidLeft armRight

31、 arm點(diǎn)突變片段刪除基因敲入第80頁/共124頁2011年8月， Nature Biotechnology 上同時(shí)發(fā)表了用TALEN 技術(shù)進(jìn)行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇綜述。 一篇人類干細(xì)胞 Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases 一篇大鼠Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs 兩篇斑馬魚 Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engin

32、eered TALENs Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs 一篇綜述Move over ZFNTALEN的最前沿第81頁/共124頁5. 檢測突變效率，篩選（移碼）突變體X 2X 2X 2第82頁/共124頁第83頁/共124頁 TAL的核酸識別單元為34aa模塊中的雙連氨基酸（RVD） RVD與A、G、C、T有恒定的對應(yīng)關(guān)系，即NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G，非常簡單明確 欲使TALEN特異識別某一核酸序列（靶點(diǎn)），只須按照靶點(diǎn)序列將相應(yīng)TAL單元（14 -18個）串聯(lián)克隆即可。TALE

33、識別模塊串聯(lián)構(gòu)建第84頁/共124頁具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)第85頁/共124頁具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)統(tǒng)步驟一：靶點(diǎn)識別單元串聯(lián)第86頁/共124頁步驟二：TALEN表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)統(tǒng)第87頁/共124頁將靶點(diǎn)識別模塊克隆入真核表達(dá)載體，得到將靶點(diǎn)識別模塊克隆入真核表達(dá)載體，得到Talen質(zhì)粒對質(zhì)粒對靶點(diǎn)識別模塊串接成功后需克隆入真核表達(dá)載體中。此真核表達(dá)載體含有TAL的其它必需結(jié)構(gòu)域并在C端融合有FokI序列。目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因。因FokI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，

34、在實(shí)際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（14 - 18個堿基）分別進(jìn)行TAL識別模塊構(gòu)建。X 2真核表達(dá)TALEN質(zhì)粒對第88頁/共124頁步驟三步驟三. 將將TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶基因敲除質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶基因敲除TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，其表達(dá)的融合蛋白即可分別找到其DNA靶位點(diǎn)并與靶位點(diǎn)特異結(jié)合。此時(shí)，兩個TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，于兩個靶位點(diǎn)之間打斷目標(biāo)基因。FOKI 內(nèi)切酶打斷靶點(diǎn)區(qū)第89頁/共124頁內(nèi)切酶的切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制（nonhomologous end-joining，NH

35、EJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯誤的個體即形成目標(biāo)基因敲除突變體。突變體形成第90頁/共124頁P(yáng)CR 酶切法酶切法 利用靶點(diǎn)設(shè)計(jì)時(shí)挑選的，位于相鄰靶位點(diǎn)之間的特異性內(nèi)切酶位點(diǎn)，進(jìn)行PCR產(chǎn)物酶切鑒定。 當(dāng)左右靶點(diǎn)之間沒有合適的酶切位點(diǎn)時(shí)可使用CEL-I核酸酶檢測。 經(jīng)驗(yàn)規(guī)律：= 2%可用，=10%很好第91頁/共124頁啟動子 ABCDEF stop-Target site - DEFHIJK啟動子 ABCDEFHIJK共轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染熒光素酶檢測質(zhì)粒熒光素酶檢測質(zhì)粒+TALEN質(zhì)粒 1+TALEN質(zhì)粒 2熒光素酶檢測法熒光素酶檢測法發(fā)光倍數(shù)與切割效率之間的

36、定量關(guān)系尚缺乏充分研究。有文獻(xiàn)表明，發(fā)光倍數(shù)達(dá)至2倍即可有效獲得突變體。第92頁/共124頁第93頁/共124頁第94頁/共124頁CRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)基因系統(tǒng)基因修飾技術(shù)修飾技術(shù)第95頁/共124頁Biotechnology: Rewriting a genome第96頁/共124頁1 CRISPR-Cas概述概述u1987年，日本大阪大學(xué)（年，日本大阪大學(xué)（Osaka University）在對一種細(xì)菌）在對一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶（編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進(jìn)行研究時(shí)）基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同

37、尋常的，發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片片段，這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。u2013以后，研究者們在包括以后，研究者們在包括science和和nature biotechnology等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)精確的基因修飾。精確的基因修飾。第97頁/共124頁1 CRISPR-Cas概述概述C

38、RISPR-Cas：一種來源是細(xì)菌獲得性免疫的由：一種來源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)指導(dǎo)Cas蛋白對靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。蛋白對靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。第98頁/共124頁CRISPR-Cas主要由兩部分組成主要由兩部分組成：識別識別切割切割1 CRISPR-Cas概述概述第99頁/共124頁1.1 CRISPR結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一個特殊的是一個特殊的DNA重復(fù)序列家族重復(fù)序列家族, 廣泛分布于廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。C

39、RISPR 位點(diǎn)通常由短的高度保守位點(diǎn)通常由短的高度保守的重復(fù)序列的重復(fù)序列(repeats) 組成組成, 重復(fù)序列的長度通常重復(fù)序列的長度通常 2148 bp, 重復(fù)序列之間被重復(fù)序列之間被 2672 bp 間隔序列間隔序列(spacer)隔開。隔開。CRISPR就是通過這些間隔序列（就是通過這些間隔序列（space）與靶基因進(jìn)行識別。）與靶基因進(jìn)行識別。第100頁/共124頁1.1 CRISPR結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)第101頁/共124頁1.2 Cas家族家族Cas（CRISPR associated）：）： 存在于存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在核酸酶，能在

40、guide RNA引導(dǎo)下對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與引導(dǎo)下對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folk酶功能類似，酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。第102頁/共124頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過對入侵的病毒和核酸進(jìn)行，通過對入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性特異性的識別，利用的識別，利用Cas蛋白蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對自身的免疫。進(jìn)行切割，從而達(dá)到對自身的免疫。第103頁/共124頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)第104頁/共12

41、4頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)第105頁/共124頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對外源系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對外源DNA特異性免特異性免疫疫, 而這種特異性是由間隔序列（而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細(xì)防御噬菌體攻擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細(xì)菌進(jìn)化了菌進(jìn)化了CRISPR 介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由揮是由CRISPR 間隔序列的動態(tài)性變化，即通過增加或刪間隔序列的動態(tài)性變化，即通過增

42、加或刪除間隔序列（除間隔序列（spacer）來實(shí)現(xiàn)的。）來實(shí)現(xiàn)的。第106頁/共124頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）為）為NGG。第107頁/共124頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求 在人類基因組中，平均每在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個就出現(xiàn)一個NGG PAM。第108頁/共124頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求第109頁/共124頁3 CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾系統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾第110頁/共124頁3.1 dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換介導(dǎo)編輯模板替換 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的R