酚氯仿法提取DNA的一些試劑的作用

1、酚氯仿法提取 DNA的一些試劑的作用酚氯仿法提取 DNA的原理用酚抽提細胞DNA時，有什么作用？使蛋白質變性，同時抑制了 DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與 DNA聯(lián)結鍵 已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1.有效變性蛋白質；2.抑制了 DNase的降解作用。缺點：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly （A） RNA。2.不能完全抑制 RNase的活性。氯仿的作用？（酚易溶于氯仿中）氯仿：克服酚的缺點；加速有機相與液相分層 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。用酚-氯仿抽提細胞基因組DNA時

2、，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？異戊醇：減少蛋白質變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。用乙醇沉淀DNA時，為什么加入單價的陽離子？用乙醇沉淀 DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如 NaCl或NaAc , Na+中和DNA分 子上的負電荷，減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。原理：動物和植物組織的脫氧核糖核蛋白（ DNP ）可溶于水或濃鹽溶液（如 1mol/L氯化鈉），但 在0.14mol/L氯化鈉鹽溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RN

3、P）則在0.14mol/L氯化鈉中溶解度最大，利用這一性質可將其分開。將沉淀物溶解于生理鹽水，加入去污劑十二烷基硫酸鈉（ SDS）溶液，使 DNA與蛋白質分離開。加入固體氯化鈉使其濃度達到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-異戊醇去除蛋白質，也可重復該步操作得較純 DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。溶解：將離心后除去RNA的沉淀，用 30ml生理鹽水溶解，充分攪拌后，勻漿一次。加 4毫升10% SDS溶液，使溶液的SDS濃度達到1%左右，邊加邊攪拌，放置 60 C水浴保溫10分鐘（不 停攪拌），冷卻。加固體氯化鈉，使溶液氯化鈉濃度達到1mol/L，充分攪拌10分鐘；除雜質：加等體積氯仿 -異

4、戊醇混合液，充分震蕩10分鐘，8000 r/min離心7分鐘，取上層液量好體積，倒入燒杯中（離心管），加同體積的氯仿-異戊醇混合液，重復上次操作。直至界面不出現(xiàn)蛋白凝膠為止；沉淀：準確量取上清液體積，加 2倍體積95%冷乙醇，攪拌后，置冰箱靜止冷卻，待有白色絲狀 物出現(xiàn)，約10-15分鐘，離心8000 r/min離心7分鐘，得白色沉淀；溶解：將沉淀物用 0.1mol/L NaOH 約10毫升溶解 得DNA溶液。溶液I一溶菌液： 溶菌酶：它是糖昔水解酶， 能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的&1,4糖昔鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液

5、的粘度，維持滲透壓，防止 DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA : （ 1）螯合 Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）；（2） EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的 環(huán)境。溶液II NaOH SDS液：NaOH :核酸在pH大于5,小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當pH > 12或pH v 3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液 II中的NaOH濃度為0.2mo1 /L,加 抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達12.6,因而促使染色體 DNA與質粒DNA的變性。 SDS : SD

6、S是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3） SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3- -R + -蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用 RNase去除RNA時）受到干擾。溶液III-3mol / L NaAc （ pH4.8 ）溶液：NaAc的水溶液呈堿性，為了調節(jié)pH至4.8 ,必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把 pH12.6的抽提液，調回p

7、H至中性，使變性的質粒 DNA能夠復性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/ L NaAc 有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS 一蛋白復合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉淀更完全。為什么用無水乙醇沉淀 DNA ?用無水乙醇沉淀 DNA，這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去 DNA周圍的水分子，使 DNA失水而易于聚合。

8、一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與 DNA相混合，其乙醇的最終含量占 67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95%乙醇昂貴）。但是加95%的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀 DNA。一般在室溫下放置 15- 30分鐘即可。在用乙醇沉淀 DNA 時，為什么一定要加 NaAc或NaCl至最終濃度達 0.10.25mol/L ? 在pH為 8左右的溶液中，DNA

9、分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl ,使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力， 易于互相聚合而形成 DNA鈉鹽沉淀，當加 入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉淀。加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用 SDS與KAc來處理？ 加進去的RNase本身是一種蛋白質，為了純化DNA ,又必須去除之， 加SDS可使它們成為 SDS-蛋白復合物沉淀，再加 KAc 使這些復合物轉變?yōu)槿芙舛?/p>

10、更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以 KAc代替NaAc,也可以收到較好效果。7.為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮 DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa = 7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24 ）等雖然也都符合細胞內環(huán)境的生理范圍（pH），可作 DNA的保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2 +產(chǎn)生Ca3（PO4）2沉淀；在DNA反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要

11、求低鹽濃度，采用Tris-HCl （pKa=8.0 ）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris ,不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存 DNA時，大都采用 Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的 EDTA更能穩(wěn)苯酚、氯仿、異戊醇在DNA提取時的作用抽提DNA去除蛋白質時，怎樣使用酚與氯仿較好？酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水 分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質的密度比水的密度 為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性

12、的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有利弊， 酚的變性作用大， 但酚與水相有一定程度的互溶，大約10%15%的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的 DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶， 不會帶走DNA所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于 酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時， 將酚與氯仿混合（1:1）使用。為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內易產(chǎn)生氣泡，氣泡會 阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降

13、低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24: 1之比。也可采用酚、 氯仿與異戊醇之比為25:24:1 （不必先配制,可在臨用前把一份酚加一份24 : 1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。苯酚：氯仿：異戊醇為什么要25:24:1 ?抽提DNA去除蛋白質時，怎樣使用酚與氯仿較好？酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當 蛋白水溶液與酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀 態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面， 從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的 互溶，大約10%15%的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA ,而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次 變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。為什么用酚與氯仿抽提DNA時