microRNA研究

1、microRNASmall molecular, Big worldmicroRNA的發(fā)現(xiàn)與研究歷史的發(fā)現(xiàn)與研究歷史microRNA2002年年science十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)之首十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)之首DNARNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)基因組學(xué)基因組學(xué)RNA組學(xué)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)編碼基因數(shù)量蛋白質(zhì)編碼基因數(shù)量人：人： 30,000果蠅和線蟲：果蠅和線蟲：12,000-14,000釀酒酵母：釀酒酵母： 6,200假單孢菌：假單孢菌： 5,500人和鼠的蛋白質(zhì)編碼基因人和鼠的蛋白質(zhì)編碼基因99%是共同的。是共同的。人個體間單倍體基因組的堿基差異人個體間單倍體基因組的堿基差異300萬個，其中萬個，其中1萬萬個

2、（個（0.3%）出現(xiàn)在蛋白質(zhì)編碼基因中。）出現(xiàn)在蛋白質(zhì)編碼基因中。98%轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是非編碼蛋白轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是非編碼蛋白RNA。2倍倍2倍倍RNA的分類的分類 細(xì)胞核和胞液細(xì)胞核和胞液 線粒體線粒體 功能功能核蛋白體RNA rRNA mt rRNA 核蛋白體組成成分信使RNA mRNA mt mRNA 蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運RNA tRNA mt tRNA 轉(zhuǎn)運氨基酸不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前體小核RNA snRNA 參與hnRNA的剪接、轉(zhuǎn)運小胞漿RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的 信號識別體的組成成分非編碼非編碼RNA (ncRNA)：不被翻譯成蛋白質(zhì)的不被翻

3、譯成蛋白質(zhì)的RNA，這些，這些RNA不被翻譯成蛋白質(zhì)，但是參與蛋白質(zhì)翻譯過程。不被翻譯成蛋白質(zhì)，但是參與蛋白質(zhì)翻譯過程。Noncoding RNAs (ncRNAs) in eukaryotesSmall RNA (sRNA) in bacteriaSmall nuclear RNAs (snRNAs)Small nucleolar RNAs (snoRNAs)MicroRNA(miRNA)Small temporal RNAs(stRNAs)Small interfering RNAs(siRNAs)RNA interference (RNAi)Guide RNAs(gRNAs)tRNA/m

4、RNA: tmRNA有些小有些小RNA分子能直接調(diào)控某些基因的開關(guān)從而控制細(xì)胞的分子能直接調(diào)控某些基因的開關(guān)從而控制細(xì)胞的生長發(fā)育并決定細(xì)胞分化的組織類型生長發(fā)育并決定細(xì)胞分化的組織類型小小RNA分子本身又包含了若干類分子本身又包含了若干類RNA，根據(jù)小，根據(jù)小RNA 的生成、的生成、結(jié)構(gòu)和功能大約可分為以下三類：結(jié)構(gòu)和功能大約可分為以下三類：miRNA （microRNA)siRNA (small interfering RNA)其他小其他小RNAmicoRNA(miRNA)是廣泛存在于真核生物中的一組短小的、不編碼蛋白質(zhì)的是廣泛存在于真核生物中的一組短小的、不編碼蛋白質(zhì)的RNA家族，它們是

5、由家族，它們是由19-23個核苷酸組成的單鏈個核苷酸組成的單鏈RNA（3端端可有可有12個堿基長度的變化）個堿基長度的變化）表達(dá)具有組織特異性和階段特異性。即：在不同組織中表達(dá)表達(dá)具有組織特異性和階段特異性。即：在不同組織中表達(dá)有不同類型的有不同類型的miRNA；在生物發(fā)育的不同階段里有不同的；在生物發(fā)育的不同階段里有不同的miRNA表達(dá)表達(dá)與靶與靶mRNA 3-UTR結(jié)合，序列特異性的在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控結(jié)合，序列特異性的在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的翻譯表達(dá)基因的翻譯表達(dá) ，在生物發(fā)育、脂肪代謝、細(xì)胞的分化、增，在生物發(fā)育、脂肪代謝、細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用殖和凋亡等過程中發(fā)揮著重

6、要作用 miRNA具有高度保守性，即各種具有高度保守性，即各種miRNA都能在其他都能在其他種系中找到同源體；種系中找到同源體；miRNA獨有的特征：其獨有的特征：其5端第一個堿基對端第一個堿基對U有強烈的有強烈的傾向性，而對傾向性，而對G卻有抗性，但第二到第四個堿基缺乏卻有抗性，但第二到第四個堿基缺乏U，一般來講，除第四個堿基外，其他位置堿基通常都缺一般來講，除第四個堿基外，其他位置堿基通常都缺乏乏C miRNA執(zhí)行一定的生物學(xué)功能：執(zhí)行一定的生物學(xué)功能：對與其互補的對與其互補的mRNA表達(dá)水平具有調(diào)節(jié)作用；表達(dá)水平具有調(diào)節(jié)作用； 一些偏大的一些偏大的miRNA (27nt)可能參與了基因組

7、的重組裝可能參與了基因組的重組裝參與生物的發(fā)育與多種生理、病理過程參與生物的發(fā)育與多種生理、病理過程為什么為什么miRNAs非常重要非常重要 ?microRNAs 是一類新的基因調(diào)控因子是一類新的基因調(diào)控因子某些某些miRNAs控制了動植物的發(fā)育控制了動植物的發(fā)育 理解理解miRNA 的功能將有助于現(xiàn)在流行的的功能將有助于現(xiàn)在流行的siRNAmicroRNAs 有可能成為新型的疾病標(biāo)志物有可能成為新型的疾病標(biāo)志物microRNAs 可能具有重要臨床應(yīng)用價值可能具有重要臨床應(yīng)用價值實驗結(jié)果：實驗結(jié)果：RNA干擾基因沉默干擾基因沉默199320002001200220032004200520062

8、007microRNA的研究歷史的研究歷史Dr. Victor Ambros1993200020012002200320042005200620071993200020012002200320042005200620071993200020012002200320042005200620072001年年 命名為命名為microRNA1993200020012002200320042005200620072002年年 入選入選science年度十年度十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)之首大科學(xué)發(fā)現(xiàn)之首199320002001200220032004200520062007The first demonstration

9、 of a link between miRNA genes and cancer.199320002001200220032004200520062007miRNA controls some plant phenotype199320002001200220032004200520062007The first quantitative real-time PCR developed for miRNA profiling, designed for the amplification of precursor molecules.19932000200120022003200420052

10、0062007The first study to report on miRNA profiling using an oligonucleotide microchip.The first paper to explore, by using genome-wide miRNA profiling by microarray,the potential importance of miRNAs in the diagnosis and prognosis of a human malignancy199320002001200220032004200520062007An elegant

11、study that shows a pathogenetic link between miRNAs and target oncogenes.199320002001200220032004200520062007The first paper to show that the deregulation of a single miRNA gene can lead to cancer.199320002001200220032004200520062007通過生物信息的手段分析了通過生物信息的手段分析了microRNA在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄因子在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄因子-microR

12、NA相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用19932000200120022003200420052006200721-nt dsRNAs targeting selected promoter regions of human genes caused long-lastingand sequence-specific induction of targeted genes199320002001200220032004200520062007Nature 449, 682-688 (11 October 2007) |19932000200120022003200420052006200

13、7Sanger Release 10.0 contains 5071 hairpin precursor miRNAs, expressing 4922 mature miRNA products, in primates, rodents, birds, fish, worms , flies, plants and viruses in August 2007microRNAs had been neglected for so many years because of their small size. Whats new about miRNA research in recent

14、days?16001200No. of publications:5,209by 10/1/20081428130794082880048440016302636199320012002200320042005200620072008YearNo. of publications microRNA publications increased very rapidly 8186 papers/2010.07.197 By 2003: 145 genes/ 152 mature miRNAs (Sanger Release 3.0) By 2004: 192 genes/ 207 mature

15、miRNAs (Sanger Release 5.1) By 2005: 281 genes/ 319 mature miRNAs (Sanger Release 7.1) By 2006: 411 genes/ 455 mature miRNAs (Sanger Release 9.0) By 2007: 541 genes/ 733 mature miRNAs (Sanger Release 10.1) By 2008: 695 genes/ 866 mature miRNAs (Sanger Release 12.0) Total number of miRNA genes predic

16、ted:Whats new about miRNA research in recent days?1,000 (Landgraf et al. 2007, Tuschl Lab)25,000 (Miranda et al. 2006, IBM Bioinformatics Group)MicroRNA publications increased very rapidlyHow many miRNAs are there in human?8Whats new about miRNA research in recent days?MicroRNA publications increase

17、d very rapidlyHow many miRNAs are there in human?What regulates miRNAs ? (He et al. 2007; Diederichs & Harber 2007;Ruby et al. 2007; Viswanathan et al. 2008)New role of miRNAs as tumor suppressors (He et al. 2007; Mayr et al. 2007) and tumor invasion and metastasis (Ma et al. 2008)MicroRNAs regu

18、late stem cell self-renewal and differentiation (Wang et al. 2007; Park et al. 2007; Yu et al. 2007; Yi et al. 2008; Tay et al. 2008)MicroRNAs function in immune systems (Li et al. 2007; Rodriguez et al. 2007; Thai et al. 2007)Viral miRNAs regulate (HIV or HSV-1) replication (Triboulet et al. 2007;

19、Umbach et al. 2008)MicroRNAs can target 3-UTR, 5-UTR and coding regions (Lytle et al. 2007; Easow et al. 2007; Tay et al. 2008)microRNA的加工成熟與分布的加工成熟與分布據(jù)體內(nèi)外實驗研究表明據(jù)體內(nèi)外實驗研究表明miRNA的生成需要的生成需要兩個步驟兩個步驟：1)由長的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（由長的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA)經(jīng)經(jīng)Drosha酶酶作用生成作用生成70nt左右左右的的miRNA前體前體(pre-miRNA)，該過程發(fā)生在細(xì)胞核，該過程發(fā)生在細(xì)胞核2)將將p

20、re-miRNA經(jīng)經(jīng)Dicer酶酶作用加工為成熟作用加工為成熟miRNA，該過程發(fā)生在細(xì)，該過程發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。胞質(zhì)中。microRNA的加工成熟的加工成熟microRNA是動、植物自身基因組編碼形成的一類小分子是動、植物自身基因組編碼形成的一類小分子首先由基因組轉(zhuǎn)錄形成長鏈?zhǔn)紫扔苫蚪M轉(zhuǎn)錄形成長鏈RNA分子分子pri-miRNA約約60%的的microRNA為獨立轉(zhuǎn)錄表達(dá)；約為獨立轉(zhuǎn)錄表達(dá)；約15%miRNA為成簇為成簇存在而共同轉(zhuǎn)錄；其余還有約存在而共同轉(zhuǎn)錄；其余還有約25%的的miRNA定位于功能基定位于功能基因內(nèi)含子，隨基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。因內(nèi)含子，隨基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Pri-miRNA經(jīng)雙鏈經(jīng)

21、雙鏈RNA核酸酶核酸酶Drosha酶作用，加工形成酶作用，加工形成70-100nt長度的長度的pre-miRNAPre-miRNA在在Exportin5介導(dǎo)作用下轉(zhuǎn)運出胞核至胞質(zhì)中進(jìn)行介導(dǎo)作用下轉(zhuǎn)運出胞核至胞質(zhì)中進(jìn)行下一步加工下一步加工Pre-miRNA在胞質(zhì)中經(jīng)雙鏈在胞質(zhì)中經(jīng)雙鏈RNA核酸酶核酸酶Dicer酶作用加工形成酶作用加工形成單鏈成熟單鏈成熟miRNA分子分子Overall, 98 of 186 (52.5%) of miR genes are in cancer-associated genomic regions or in fragile sitesmicroRNA的分布的分布

22、microRNA的作用機制的作用機制miRNA發(fā)揮作用過程發(fā)揮作用過程19-23nt的成熟的成熟miRNA形成后與其他蛋白共同組成形成后與其他蛋白共同組成RNA介介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）參與）參與RNA干擾途徑干擾途徑miRNA形成形成RISC復(fù)合體后可與特定的靶復(fù)合體后可與特定的靶mRNA結(jié)合，這種結(jié)合，這種結(jié)合不要求嚴(yán)格的互補配對。結(jié)合后導(dǎo)致靶結(jié)合不要求嚴(yán)格的互補配對。結(jié)合后導(dǎo)致靶mRNA翻譯的抑制翻譯的抑制翻譯抑制翻譯抑制5end of the small RNA,28, known as the “seed region”do not have a complex

23、secondary structure and are located in accessible regions of the RNAmicroRNA識別靶位點識別靶位點microRNA作用機制作用機制miRNA與與siRNA的聯(lián)系：的聯(lián)系：均為均為Dicer的產(chǎn)物的產(chǎn)物長度均為長度均為22nt左右，左右，5端是磷酸基，端是磷酸基，3端是羥基端是羥基均需均需Argonaute家族蛋白的存在家族蛋白的存在同為同為RISC的組分的組分二者進(jìn)化關(guān)系上可能的兩種推論：二者進(jìn)化關(guān)系上可能的兩種推論：siRNA是是miRNA的補充的補充 miRNA在進(jìn)化過程中替代了在進(jìn)化過程中替代了siRNA沉默機制有

24、重疊沉默機制有重疊miRNA的加工成熟過程與的加工成熟過程與RNAi技術(shù)中常用的技術(shù)中常用的siRNA有許多有許多相似之處相似之處均經(jīng)過均經(jīng)過Dicer酶酶對對雙鏈雙鏈RNA的識別加工而形成的識別加工而形成單單鏈鏈RNA分子分子。miRNAsiRNA產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)RNA的固有組分之一（正常）RNAi的活性形式，病毒感染和人工插入dsRNA之后誘導(dǎo)而產(chǎn)生（異常）來源內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)基因或病毒RNA（外源）直接來源發(fā)夾狀pre-miRNA長dsRNA結(jié)構(gòu)單鏈雙鏈，3端有2個非配對堿基，通常為UU互補性不完全互補，存在錯配現(xiàn)象完全互補對靶RNA特異性相對較低，一個突變不影響miRNA的效應(yīng)較高，一個突變即引

25、起RNAi沉默效應(yīng)的改變途徑miRNA途徑RNAi途徑對RNA的影響在RNA代謝的各個層面進(jìn)行調(diào)控降解靶mRNA功能調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，在蛋白質(zhì)合成水平發(fā)揮作用，與mRNA的穩(wěn)定性無關(guān)抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用,影響mRNA的穩(wěn)定性miRNA與與siRNA的區(qū)別的區(qū)別microRNA與腫瘤與腫瘤 Oncology Bladder Breast Cervical Colon Leukemia Lung Pancreas Prostate Thyroid Brain Alzheimers Multiple Sclerosis Prion Disease Stroke Misce

26、llaneous Atherosclerosis Cardiac Hypertrophy Diabetes HIV/HPV Infection Lupus Cellular Process Angiogenesis Apoptosis Cell Cycle Neuronal Differentiation Proliferation Telomerase Activity T-cell Activation Various Cell TreatmentmiRNA Disease AnalysismicroRNA與腫瘤E2F1E2F1 Tsp1 CTGFmiR-1792簇簇miR-1792簇位于

27、簇位于13q31，其中包含了，其中包含了7個個microRNA: miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-20, miR-19b-1 和和miR-92-1 ODonnell等發(fā)現(xiàn)等發(fā)現(xiàn)MYC可以結(jié)合到可以結(jié)合到miR-17-92簇所在基因簇所在基因C13orf25的第一個內(nèi)含子上，并誘導(dǎo)的第一個內(nèi)含子上，并誘導(dǎo)miR-17-92簇的表達(dá)簇的表達(dá) 與與p53相關(guān)的相關(guān)的miRNA 2007-06-06腫瘤有著獨特的腫瘤有著獨特的miRNA表達(dá)譜表達(dá)譜microRNA相關(guān)研究相關(guān)研究microRNA Expression AnalysismicroRNA Functional AnalysismiRNA Expression AnalysisStrategy OverviewSample preparationRNA isolationcDNA synthesisReal-time PCR analysis microRNA cDNA synthesis stem-loop RT poly(A) tail RT Real-time PCR workflow microRNA real-time PCR SYBR Green Taqman probemiRNA Func