實(shí)驗(yàn)十二 血清肌酸激酶測(cè)定與應(yīng)用PPT課件

1、1 1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?了解血清肌酸磷酸激酶測(cè)定的方法。了解血清肌酸磷酸激酶測(cè)定的方法。 掌握其測(cè)定的應(yīng)用與意義。掌握其測(cè)定的應(yīng)用與意義。第1頁/共20頁2 2 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理肌酸激酶（Creatine phosphokinaseCreatine phosphokinase，簡(jiǎn)稱CKCK）廣泛存在于骨骼肌、心肌和腦組織中，肝臟和紅細(xì)胞等不含此酶。骨骼肌中含量最豐富，占全身總量的96%96%之多。肌酸磷酸激酶在肌肉收縮中很重要，它催化下列反應(yīng)：第2頁/共20頁上述反應(yīng)保證肌肉收縮時(shí)的能量供應(yīng)和運(yùn)動(dòng)后ATPATP和肌酸磷酸的再合成。正常人血清中肌酸磷酸激酶主要由骨骼肌和心肌細(xì)胞透過細(xì)胞膜進(jìn)入血

2、液的結(jié)果，其活力很小。正常值每升血液中100100活力單位以下。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能使血清肌酸酸磷酸活性升高。其原因一般認(rèn)為運(yùn)動(dòng)時(shí)缺氧, , 代謝產(chǎn)物積累，供能相對(duì)不足等原因，引起肌細(xì)胞膜通透性升高?；蚣〖?xì)胞膜受到損傷，促使CKCK從細(xì)胞內(nèi)釋放增加，進(jìn)入血液循環(huán)，其中以肌肉牽拉的機(jī)械性損傷或產(chǎn)生血腫等原因最為重要。 第3頁/共20頁滑雪運(yùn)動(dòng)和馬拉松賽跑后，血清CKCK的活性較高，特別是大強(qiáng)度的馬拉松賽跑最高。在運(yùn)動(dòng)后4 4小時(shí)升高，8-168-16小時(shí)達(dá)最高值。跳躍、短跑等短時(shí)間激烈運(yùn)動(dòng)，沖擊性運(yùn)動(dòng)，也易引起CKCK活性升高。大運(yùn)動(dòng)量的訓(xùn)練和100m100m、200m200m跑比賽后，血清中CKCK活性

3、都顯著升高，尤其是在比賽時(shí)，升高更為顯著。應(yīng)用肌酸磷酸激酶來作機(jī)能評(píng)定時(shí)，一般認(rèn)為2-32-3天取血測(cè)定一次, , 在負(fù)荷后經(jīng)常處于100-200100-200國(guó)際活力單位/L/L。如果超過200200IU/LIU/L，就是運(yùn)動(dòng)量過大，身體尚未恢復(fù)，此時(shí)應(yīng)調(diào)整運(yùn)動(dòng)量。第4頁/共20頁3 3 實(shí)驗(yàn)器材與試劑 器材 器材 試管、分光光度計(jì)、分析天平、采血裝置（注射器）、水浴箱、離心機(jī)第5頁/共20頁 試劑 試劑 混合底物pH 7.4 pH 7.4 三羥甲基氨基甲烷- -鹽酸緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷（TrisTris）2.4g2.4g，加蒸餾水至100 ml100 ml，再加入0.2 N0.2

4、N鹽酸88.8 ml88.8 ml及無水硫酸鎂0.34g0.34g，調(diào)節(jié)pHpH至7.47.4。此液在室溫下可保存數(shù)月。0.012 M0.012 M磷酸肌酸溶液：稱取磷酸肌酸鈉（C C4 4H H8 8O O5 5- -O O4 4PNaPNa3 36H6H2 2O O）4 436 mg36 mg，加蒸餾水至100 ml100 ml，調(diào)節(jié)PHPH至7.47.4，保存于-25-25或普通冰箱上層冰盒中，可用一個(gè)月左右。0.001 M ADP0.001 M ADP溶液：稱取ADPADP鈉鹽0.233g0.233g，加蒸餾水至100 ml100 ml，調(diào)節(jié)PHPH至7.47.4，保存于-25-25或

5、冰箱上層冰盒中，可用一個(gè)月左右。第6頁/共20頁臨用前，取上述（1 1）（2 2）（3 3）試劑各10 ml10 ml混合。在此混合底物液30 ml30 ml中，加入鹽酸半胱氨酸0.105g0.105g，調(diào)節(jié)PHPH至7.47.4。此試劑最好新鮮配制，也可以保存于冰盒中。一般可放5-75-7天，若空白管光密度太高，說明有游離肌酸產(chǎn)生，即不能再用。 0.3 N 0.3 N 氫氧化鋇溶液 稱取氫氧化鋇（Ba(OH)Ba(OH)2 28H8H2 2O O）4.73g4.73g，加蒸餾水使之溶解（可加熱助溶），并稀釋到100 ml100 ml。 5% 5% 硫酸鋅溶液稱取硫酸鋅（ZnSOZnSO4 4

6、7H7H2 2O O）8.82g8.82g，加蒸餾水溶解，并稀釋到100 100 mlml。上述2 2、3 3兩種溶液配好后，需進(jìn)行滴定，即吸取5%5%硫酸鋅溶液5 5 mlml，放入50 ml50 ml三角燒瓶中，加入酚酞指示劑2 2滴，用0.3 N 0.3 N Ba(OH)Ba(OH)2 2溶液滴定至出現(xiàn)粉紅色3030秒鐘不褪色為止。 Ba(OH)Ba(OH)2 2用量與ZnSOZnSO4 4相等，如不相等，可稀釋較濃的溶液。第7頁/共20頁標(biāo)準(zhǔn)肌酸溶液（1.71.7MM/ml/ml） 準(zhǔn)確稱取無水肌酸22.3mg22.3mg，置于100ml100ml容量瓶中，加蒸餾水使之溶解，并稀釋到刻

7、度，置冰箱中保存，可用數(shù)日。雙乙酰液 先配成1%1%溶液，置棕色瓶中放冰箱保存。臨用時(shí)用蒸餾水稀釋2020倍。貯存堿溶液 稱取30g 30g NaOHNaOH，無水碳酸鈉（Na2CO3Na2CO3）64g64g，加蒸餾水使溶解并稀釋至500 ml500 ml，室溫低時(shí)可析出沉淀，此時(shí)應(yīng)放于3737水浴中待沉淀溶解后再使用。-萘酚溶液 稱取-萘酚1g1g，用上述貯存堿液使溶解，并稀釋到100 100 mlml，此液必須新鮮配制，否則空白管光密度讀數(shù)增高。第8頁/共20頁4 4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟肌酸磷酸激酶顯色法肌酸磷酸激酶顯色法。測(cè)定CKCK活性原理：利用上述反應(yīng)所生成的肌酸與-萘酚和雙乙酸反應(yīng)，

8、生成紅色化合物。在一定范圍內(nèi)，紅色深淺與肌酸含量成正比，與同樣處理的肌酸標(biāo)準(zhǔn)液比色，求得酶的活力。第9頁/共20頁加入物（加入物（mlml）空白管空白管標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管測(cè)定管混合底物混合底物0.750.750.750.750.750.75血清血清0.10.1標(biāo)準(zhǔn)肌酸標(biāo)準(zhǔn)肌酸（1.7M/ml1.7M/ml）0.10.1蒸餾水蒸餾水0.10.1 置置3737水浴保溫水浴保溫30 min 30 min Ba(OH)Ba(OH)2 2溶液溶液0.50.50.50.50.50.5ZnSOZnSO4 4溶液溶液0.50.50.50.50.50.5蒸餾水蒸餾水0.50.50.50.50.50.5 混勻，離

9、心混勻，離心5-10 min 5-10 min 測(cè)定操作步驟（如下表測(cè)定操作步驟（如下表3-143-14）：）： 表表3-14 3-14 單位：?jiǎn)挝唬?mlml第10頁/共20頁上清液上清液1.1.0.50.51.1.0.50.51.1.0.50.5-萘酚溶液萘酚溶液1.1.1 11.1.1 11.1.1 1雙乙酰液雙乙酰液1.1.0.50.51.1.0.50.51.1.0.50.5置置3737水浴保溫水浴保溫15 min 15 min 蒸餾水蒸餾水1.1.3 31.1.3 31.1.3 3離心離心35min35min， 520nm520nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色波長(zhǎng)處進(jìn)行比色 讀取各管的光密度讀取各

10、管的光密度 第11頁/共20頁計(jì)算：第12頁/共20頁 肌酸磷酸激酶檢測(cè)試劑盒法：肌酸磷酸激酶檢測(cè)試劑盒法： 原理原理ATP+ATP+葡萄糖葡萄糖 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸+ADP +ADP 為作用酶為作用酶葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸+NADP+NADP+ + 6- 6-磷酸磷酸- -葡萄糖葡萄糖+NADPH+H+NADPH+H+ + 為作用酶為作用酶第13頁/共20頁 器材與試劑：試管、可見光分光光度計(jì)、電子分析天平、采血裝置（注射器）、水浴鍋、離心機(jī)、試劑盒測(cè)定法。 如：采用中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)的肌酸磷酸激酶檢測(cè)試劑盒，該試劑盒適用于全自動(dòng)，半自動(dòng)生化分析儀及分光光度

11、計(jì)測(cè)定人血清中CKCK的酶活濃度?；緟?shù)：波長(zhǎng)：340 nm340 nm，溫度：25,30,3725,30,37，比色杯光徑：1cm1cm。第14頁/共20頁試劑試劑主要成分主要成分實(shí)驗(yàn)濃度實(shí)驗(yàn)濃度R1 R1 己糖激酶己糖激酶(HK)(HK)3000 U/L3000 U/L葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶( G6PDH)( G6PDH)2000 U/L2000 U/LADPADP2 mmol/L2 mmol/LAMPAMP5 mmol/L5 mmol/LAp5AAp5A10 mol/L10 mol/LNADPNADP2 mmol/L2 mmol/LNACNAC20 mmol/L20

12、 mmol/L磷酸肌酸磷酸肌酸30 mmol/L30 mmol/LR2R2咪唑緩沖液咪唑緩沖液(pH 6.7(pH 6.7，25)25)100mmol/L100mmol/L葡萄糖葡萄糖20mmol/L20mmol/L原裝試劑雜2-8避光保存，有效期12個(gè)月。復(fù)溶后在2-8可穩(wěn)定7天，在15-25可穩(wěn)定12小時(shí)。試劑盒主要成分與濃度，見表試劑盒主要成分與濃度，見表3-153-15： 表表3-15 3-15 肌酸磷酸激酶檢測(cè)試劑盒成分與濃度肌酸磷酸激酶檢測(cè)試劑盒成分與濃度第15頁/共20頁加入物（加入物（mlml）空白管空白管樣品管樣品管工作液工作液2.502.500.500.50蒸餾水蒸餾水2.

13、502.50樣品樣品0.500.50混合均勻，在3737溫育2 2分鐘后，讀取初始吸光度，然后在精確1 1分鐘，2 2分鐘，3 3分鐘時(shí)分別讀取吸光度，確定每分鐘平均吸光度變化A A。表3-16 3-16 肌酸磷酸激酶檢測(cè)試劑盒的操作 操作步驟：取一定量R2R2（參看R1R1瓶簽）復(fù)溶1 1瓶R1R1，溶解后即為工作液。工作液預(yù)先保溫至測(cè)試溫度。第16頁/共20頁 計(jì)算： CKCK（U/LU/L）= =（A A樣品/ /分AA空白/ /分）F F F=(Vt/Vs F=(Vt/Vs消光系數(shù)) ) 1000=80951000=8095（3737） Vt=Vt=反應(yīng)總體積 Vs=Vs=樣品體積 N

14、ADPHNADPH在340 nm340 nm波長(zhǎng)下毫克分子消光系數(shù)=6.3=6.3 參考值：男：24-195 U/L24-195 U/L；女：24-170 U/L24-170 U/L 線性上限：CKCK活力可達(dá)1500U/L1500U/L（3737） 注意事項(xiàng)：當(dāng)A/A/分大于0.03600.0360（F=4127F=4127），0.01900.0190（F=8095F=8095）時(shí)，樣品用生理鹽水稀釋后重新測(cè)定， 結(jié)果結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；試劑空白吸光度大于乘以稀釋倍數(shù)；試劑空白吸光度大于0.60.6時(shí)時(shí), ,勿用；血清勿用；血清CKCK不穩(wěn)定，樣品收集后要盡快分析，在室溫不穩(wěn)定，樣品收集后要盡快分析，在室溫4 4小時(shí)，在小時(shí)，在4 4 8-128-12小時(shí)后，小時(shí)后，CKCK活性即要下降。活性即要下降。第17頁/共20頁5 5 注意事項(xiàng)5 5 注 意 事項(xiàng) 紅細(xì)胞中肌酸磷酸激酶活力很低，故溶血標(biāo)本不影響測(cè)定結(jié)果。 混合底物的pHpH要求準(zhǔn)確。 氧氧化鋇和硫酸鋅要滴定至恰好等量，否則離心后會(huì)出現(xiàn)混濁。特別是鋇離子多時(shí)，不能完全被硫酸根清除盡，使顯色混濁而影響測(cè)定結(jié)果。 肌酸磷酸激酶活力單位定義：以1