年產(chǎn)300噸螺旋霉素的發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)資料

1、學(xué)習(xí)資料1 緒論1.1 引言螺旋霉素，英文名 Spiramycin 。白色或微黃色粉末，微有味；微吸濕；易 溶于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇，難溶于水。該品系多組分大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具 有強(qiáng)大的體內(nèi)抗菌作用和抗菌后效應(yīng) (PAE ,能夠增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，廣 泛分布于體內(nèi)。 本品在組織細(xì)胞內(nèi)濃度較紅霉素高， 而副作用小于紅霉素。 與紅 霉素有交叉耐藥。 對革蘭陽性菌和一些革蘭陰性菌如鏈球菌、 腦膜炎雙球菌、 百 日咳桿菌、梭狀芽胞桿菌等包括對青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素耐藥菌均有 效。螺旋霉素是多組分的抗生素，其主要成分包括螺旋霉素 I 、II 、III 。其發(fā) 酵液中組分 I 含量最高，為

2、60；其次是組分 II 含量，為 24；最后是組分 III 含量，為 13。各組分活性相近。螺旋霉素是 3 種組分的復(fù)合物，復(fù)合物為 奶油色、味苦的無定形堿性抗生素。 可溶于氯仿、 醇類、己烷、苯、酮、醋酸酯， 微溶于水。其硫酸鹽溶于水和低級(jí)醇。熔點(diǎn)：組分 I為134137C :組分II為 130133C ；組分III為128131C。在231-232 um處有紫外吸收峰，本身帶 有發(fā)色基團(tuán)。 遇濃硫酸或鹽酸呈紫色反應(yīng)。 麥芽酚反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、 坂口反應(yīng)、 雙縮反應(yīng)、斐林反應(yīng)均為陰性。多年來，在我國藥品市場中，抗感染藥物的銷售額始終位居第 1，目前年銷 售額已達(dá) 400 多億元人民幣，占全國

3、年藥品銷售總額的 30%左右。在抗感染藥物 市場中，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是主力軍之一， 在今后的發(fā)展中， 我國的醫(yī)療保障系 統(tǒng)將會(huì)更完善，對螺旋霉素及其衍生物的需求也會(huì)加大。2. 菌種的選育2.1 出發(fā)菌種的選擇一般菌種分離純化和篩選的步驟如下：用產(chǎn)二素鏈霉菌SIPI9004生產(chǎn)螺旋霉素。2.2篩選培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件瓊脂培養(yǎng)基/%:葡萄糖1.5，黃豆餅粉1.0,麩皮1.0，MgSO 7H00.05, CaCG0.3，瓊脂 2.0 ; pH7.0, 28C培養(yǎng) 12d。種子培養(yǎng)基：葡萄糖，淀粉，黃豆餅粉，酵母粉，NaCI, CaCO pH7.0,斜面抱子挖塊接種，搖瓶置于旋轉(zhuǎn)搖床(230r/min)

4、, 28C培養(yǎng)48h。發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉，魚粉，酵母粉，NaCI, NaNO KHPQ, CaCQ pH6.5,取種子培養(yǎng)液10%種于發(fā)酵搖瓶中，搖床(230r/min) , 28C培養(yǎng)120h。2.3測定方法總糖：用費(fèi)林法測定。菌體濃度：取發(fā)酵液10ml置于刻度離心管中，離心(3000r min)10min，測定菌絲體濕重。發(fā)酵單位：取發(fā)酵濾液用杯碟法測定， 藤黃八疊球菌為檢定菌。2.4菌種處理單抱子懸浮液制備：新鮮抱子斜面加入無菌生理鹽水， 洗下的抱子經(jīng)濾紙過 濾，鏡檢單抱子分散度達(dá)到97%上方可用于誘變處理。2.5菌種誘變吸取單抱子懸浮液6ml培養(yǎng)皿，置于30W的UV燈(253.7nm)下

5、30cm處，振 動(dòng)照射處理，殺死率控制在 90流右。2.6 初篩用氨基乙酸和纈氨酸作為篩選劑，以適當(dāng)濃度分別加至瓊脂培養(yǎng)基中，制成 不含藥物平板及藥物濃度梯度平板。將誘變后存活抱子涂布于上述平板上，恒溫 培養(yǎng)；UV處理的和不處理的抱子，分別涂布于不含藥物的瓊脂培養(yǎng)基平板上培 養(yǎng)作對照。分別選取單菌落傳斜面培養(yǎng)。2.7 搖瓶復(fù)篩斜面挖塊移種種子瓶培養(yǎng)；以 10%接種量移種發(fā)酵瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵濾液作 生物效價(jià)測定，去劣留優(yōu)。2.8 高產(chǎn)菌株高產(chǎn)菌株為突變的產(chǎn)二素鏈霉菌 SIPI9004 生產(chǎn)螺旋霉素。3 菌種保藏 菌種的保藏方法有：斜面菌種低溫保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真 空冷凍干燥法、液

6、氮超低溫保藏法。真空冷凍干燥法：是目前比較理想的一種方法。在低溫 -15°C 下，快速將 細(xì)胞凍結(jié)，并保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華至干。在此環(huán)境下，微生 物的生長和代謝都暫時(shí)停止， 不易發(fā)生變異， 故可長時(shí)間保存， 一般為 5-10 年， 最多可達(dá) 15 年之久。此法兼?zhèn)淞说蜏?、干燥及缺氧幾方面條件，使微生物可以 保存較長時(shí)間，但過程較麻煩，需要一定的設(shè)備。產(chǎn)二素鏈霉菌遺傳極不穩(wěn)定， 在培養(yǎng)過程或菌株保藏中， 常發(fā)生變異， 故采 用真空冷凍干燥法。4 培養(yǎng)基的配置4.1 配制培養(yǎng)基的原則培養(yǎng)基是指可供微生物細(xì)胞生長繁殖所需的一組營養(yǎng)物質(zhì)和原料， 同時(shí)也為 微生物生長提供除營養(yǎng)

7、外的其他生長所需的條件。 原則上滿足必須的原料； 生化反應(yīng)的基本條件（溫度、溶氧和批pH;來源豐富、價(jià)格低廉、取材方便、 質(zhì)量穩(wěn)定；培養(yǎng)基成分不影響下游產(chǎn)品的提取加工。4.2 培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基可以按照用途可以分成孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基4.2.1 孢子培 養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基。4.2.2 種子培 養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌絲體長的粗壯， 成為活力強(qiáng)的“種子” 。4.2.3 發(fā)酵培 養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基既要有利于生長繁殖， 防止菌體過早衰老， 又要有利于產(chǎn)物的大 量合成。4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的與培養(yǎng)條件孢子培養(yǎng)基 瓊脂培養(yǎng)基 %：葡

8、萄糖 1.5 ，黃豆餅粉 1.0 ，麩皮 1.0 ，MgSO4 ? 7H200.05, CaCGD.3，瓊脂 2.0 ; pH7.0, 28C培養(yǎng) 12d。種子培養(yǎng)基 （g/L） 淀粉 30，黃豆餅粉 20，葡萄糖 5，磷酸二氫鉀 0. 5 ， 蛋白胨6,豆油5,氯化鈉4。以溫度28 ± 0.5 C, 220r/min培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）淀粉70，黃豆餅粉15,玉米漿7,動(dòng)物蛋白NY5糊精 12,氯化鈉 4,硝酸銨 6,碳酸鈣 5,磷酸二氫鉀 0. 5 ,硫酸鎂 1,豆油 3。 以溫度28 ± 0.5 C,接種量8% , 220r/min 培養(yǎng)96h。4.3.1 碳源

9、碳源是組成培養(yǎng)基的主要成分之一, 其主要功能有兩個(gè)： 一是為微生物菌種 的生長繁殖提供能源和合成菌體所必須的碳成分； 二是為合成目的產(chǎn)物提供所需 的碳成分。發(fā)酵條件研究發(fā)現(xiàn)：不同碳源中以淀粉最好,糊精次之,最差是蔗糖 和乳糖。本設(shè)計(jì)中發(fā)酵培養(yǎng)基所用碳源為淀粉與葡萄糖。4.3.2 氮源氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物。 常用的氮源分為有機(jī)氮源和 無機(jī)氮源。 本設(shè)計(jì)的發(fā)酵培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源是黃豆餅粉、 玉米漿和魚粉； 無機(jī) 氮源是硝酸銨。4.3.3 無機(jī)鹽和微量元素 無機(jī)鹽和微量元素是生理活性物質(zhì)的組成成分或具有生理調(diào)節(jié)作用, 磷（核酸）、硫、鐵（細(xì)胞色素） 、鎂、鈣（調(diào)節(jié)細(xì)胞膜透性） 、

10、錳、銅、鋅（輔酶或激 活劑）、鈷、鉀、鈉（調(diào)節(jié)滲透壓） 、氯。一般低濃度起促進(jìn)作用,高濃度起抑制 作用。4.3.4 水 水是所有培養(yǎng)基的主要組成成分， 是生命活動(dòng)不可或缺的物質(zhì)， 是細(xì)胞的主 要成分，良好的介質(zhì)，營養(yǎng)傳遞的道體，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。4.3.5 生長因子 生長因子是指氨基酸、 核苷酸、維生素、脂肪酸等菌體必須地生理活性物質(zhì)。在這種天然培養(yǎng)集中已然含有無需添加。4.3.6 前體物質(zhì) 在抗生素發(fā)酵過程中加入前提物可以控制菌體合成抗生素的方向和增加抗 生素的產(chǎn)量。 在螺旋霉素發(fā)酵中不同的前體物對發(fā)酵有不同的影響。 本設(shè)計(jì)采用 正丙醇作為前體。在 20h 補(bǔ)加 0.5%正丙醇。4.3.7 消泡

11、劑 在發(fā)酵的過程中會(huì)有泡沫的出現(xiàn)， 需要添加消泡劑進(jìn)行消泡。 本設(shè)計(jì)中含有 的豆油，可作為消泡劑。5. 滅菌 滅菌是指利用物理或化學(xué)方法殺滅或除去物料及設(shè)備中的一切有生命物質(zhì) 的過程。常用的滅菌方法有：化學(xué)滅菌法，射線滅菌法，干熱滅菌法，濕熱滅菌 法，過濾除菌法。5.1 培養(yǎng)基滅菌 為減少對培養(yǎng)基的破壞， 采用濕熱滅菌。 培養(yǎng)基的濕熱滅菌還分分為： 培養(yǎng) 基的分批滅菌和連續(xù)滅菌。分批滅菌設(shè)備簡單，易操作，但是計(jì)算難，耗時(shí)長， 對培養(yǎng)基的破壞比較大。 連續(xù)滅菌在不同的溫度下分開滅菌， 減少了培養(yǎng)基受熱 破壞的程度，滅菌時(shí)間短，提高了設(shè)備的利用率。本設(shè)計(jì)采用濕熱連續(xù)滅菌對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。5.1.1

12、 連續(xù)滅菌的設(shè)備 配料預(yù)熱罐，將配好的料液預(yù)熱到 6070 C,以避免滅菌時(shí)由于料液與 蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲； 連消塔，連消塔的作用主要是使高溫蒸汽與料液迅速接觸混合，并使料液的溫度很快升高到滅菌溫度； 維持罐，是一個(gè)直立圓形容器，附有進(jìn)出料管道，保溫時(shí)，培養(yǎng)基由進(jìn)料 口連續(xù)進(jìn)入維持罐底部，液面不斷上升，離開罐后流入冷卻器。 噴淋冷卻器，一般安裝在室外，頂端裝有帶齒輪的水槽，冷卻水從水槽內(nèi) 溢出沿下方的管壁以膜狀依次流下。 培養(yǎng)基從下部進(jìn)入，從上部排出由分配站進(jìn) 入發(fā)酵罐。5.1.2連續(xù)滅菌的流程圖5-1-2連續(xù)滅菌的流程圖培養(yǎng)基在采用連續(xù)滅菌時(shí)，發(fā)酵罐應(yīng)該在連續(xù)滅菌前先進(jìn)行空罐滅

13、菌， 通常 先把發(fā)酵罐的空氣過濾器滅菌并用空氣吹干。加熱器、維持罐及冷卻設(shè)備也應(yīng)先行滅菌。組成培養(yǎng)基的不同成分可以在不同的溫度下分開進(jìn)行滅菌，以減少培養(yǎng)基受熱破壞的程度。連續(xù)滅菌時(shí)，培養(yǎng)基在短時(shí)間內(nèi)被加熱到131 C,短時(shí)間保溫8min后，被快速冷卻，在進(jìn)入早已滅菌完畢的發(fā)酵罐。(1) 配料 配料罐用于培養(yǎng)基的配置。然后將培養(yǎng)基用泵打入預(yù)熱桶中。、(2) 預(yù)熱 預(yù)熱桶的作用一是定容，二是預(yù)熱。預(yù)熱的目的是使培養(yǎng)基在后續(xù)的加熱過程中能快速的升到指定的滅菌溫度，同時(shí)避免太多的冷凝水帶入培 養(yǎng)基，還可減少震動(dòng)和噪聲。一般可將培養(yǎng)基預(yù)熱到7090 °C .(3) 預(yù)熱好的培養(yǎng)基由連消泵打入加

14、熱器。加熱器也稱連消塔，使培養(yǎng)基與蒸汽混合并迅速達(dá)到滅菌溫度。加熱采用的蒸汽壓力一般為0.450.8MPa,其目的是使培養(yǎng)基在較短時(shí)間(2030s)里快速升溫。加熱器有塔式加熱器和 噴射加熱器兩種。(4) 保溫 保溫是將培養(yǎng)基維持滅菌溫度一段時(shí)間，使殺滅微生物的主要 過程。其設(shè)備有維持罐和管事罐兩種。保溫設(shè)備一般采用保溫材料包裹，但不直 接通入蒸汽。（5）降溫 升降溫快是連續(xù)滅菌的主要特征之一，為避免培養(yǎng)基營養(yǎng)成分 的破壞，保溫后的培養(yǎng)基需要迅速降溫至接近培養(yǎng)溫度（4050 C）.國內(nèi)大多采數(shù)用噴淋冷卻設(shè)備，也有采用螺旋板式換熱器、板式換熱器、真空冷卻器等。 反應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基的特點(diǎn)、處理量、場地

15、特性選用噴淋冷卻設(shè)備。5.2發(fā)酵罐滅菌空罐滅菌方法：從有關(guān)管道通入蒸氣，使罐內(nèi)蒸氣壓力達(dá)0.147MPa,維持45mi n。滅菌過程從有關(guān)閥門，邊閥排除空氣，并使蒸氣通過達(dá)到死角滅菌。滅 菌完畢，關(guān)閉蒸氣后，待管內(nèi)壓力低于空氣過濾器時(shí)，通入無菌空氣保壓0.098MP&5.3空氣除菌空氣中的微生物主要是細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒，它們大多附著在空氣中 的灰塵上。5.3.1空氣的預(yù)處理圖為空氣凈化系統(tǒng)流程圖，把這一流程中過濾器以前的部分稱為空氣的預(yù)處理。圖5-3-1空氣除菌設(shè)備流程圖采風(fēng)塔：采風(fēng)塔建在工廠的上風(fēng)頭，遠(yuǎn)離煙囪，采風(fēng)塔可用灰鐵皮或砼制成 采風(fēng)塔越高越好，至少10 m,氣流速度為8

16、 m/s。粗過濾器：安裝在空壓機(jī)吸入口前，主要作用是攔截空氣中較大的灰塵以保 護(hù)空氣壓縮機(jī)，同時(shí)起一定的除菌作用，減輕總過濾器的負(fù)擔(dān)。應(yīng)阻力小，容量 大?？諝鈮嚎s機(jī)：作用是提供動(dòng)力， 以克服隨后各設(shè)備的阻力。 本設(shè)計(jì)采用往復(fù) 式空壓機(jī)?？諝赓A罐：作用是消除壓縮空氣的脈動(dòng)，空氣貯存，降溫，保證穩(wěn)定的出口壓要求：H/B=22.5, V= （0.1 0.2 ） V其中， H 為罐高； B 為罐直徑；VA為空壓機(jī)每分鐘排氣量（20C, 1X 105Pa狀況下），m3冷卻器：空壓機(jī)出口溫度氣溫在120C左右，必須冷卻。另外在潮濕的地域 和季節(jié)還可以達(dá)到降濕的目的。空氣冷卻器可采用列管式熱交換器空氣走殼程

17、， 管內(nèi)走冷卻水。旋風(fēng)分離器：是利用離心力進(jìn)行氣 -固或氣-液沉降分離的設(shè)備。 它結(jié)構(gòu)簡單、 阻力小、分離效率高。絲網(wǎng)除沫器：利用慣性攔截原理。對 1卩m以上的霧滴除去率98%?？諝饧訜嵩O(shè)備： 壓縮空氣加熱設(shè)備一般采用列管換熱器， 空氣走管程， 蒸汽 走殼程，換熱系數(shù)一般為i6ow/（mC）。5.3.2 空氣的過濾除菌大型的發(fā)酵工廠常采用兩級(jí)或者三級(jí)過濾器， 本設(shè)計(jì)采用兩級(jí)過濾器， 第一 級(jí)過濾器稱為總過濾器，二級(jí)為分過濾器?？傔^濾器： 纖維及顆粒狀介質(zhì)過濾器， 介質(zhì)為玻璃纖維和活性炭顆粒。 纖維 層：活性炭層：纖維層高度為 1： 1： 11： 2： 1，介質(zhì)層總高度為 0.31.0m。分過濾

18、器：微孔膜過濾器，它是由耐高溫、疏水的、厚度為 150卩m的聚四 氟乙烯薄膜構(gòu)成，能夠清除所有大于0.01卩m的微粒，能清除幾乎所有空氣中夾 帶的微生物。533無菌空氣的檢驗(yàn)空氣系統(tǒng)的無菌檢測主要考察過濾器是否失效。 過濾器失效的檢測方法之一 是檢測過濾器兩側(cè)的壓降，壓降大說明過濾介質(zhì)被堵塞；二是用粒子計(jì)數(shù)器測定 空氣中的粒子數(shù)是否超標(biāo)，有無達(dá)到潔凈度要求。6種子擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接 入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和 質(zhì)量的純種的過程。種子制備一般包括兩個(gè)過程，即在固體培養(yǎng)基上生產(chǎn)大量抱子的抱子制備和

19、在液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)大量菌絲的種子制備過程。v_y & 實(shí)喊室種了制番階段-卜土嚴(yán)車面種了制備階段 亠1抄士種2冷濟(jì)干煉菌種2斜貢萌種°攥瓶培養(yǎng)日茹子版培養(yǎng)E鈦曲培莽了一飜種子睡培養(yǎng)E二綁種辛滴堵養(yǎng)9發(fā)解縮發(fā)群牛產(chǎn)圖6種子制備的工藝流備圖6.1 孢子的制備孢子制備是種子制備的開始， 是發(fā)酵生產(chǎn)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。 孢子的質(zhì)量、 數(shù) 量對以后菌絲的生長、繁殖和發(fā)酵產(chǎn)量都有明顯的影響。霉菌的孢子培養(yǎng)，一般以大米、小米、玉米、 麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為 培養(yǎng)基。這是由于這些農(nóng)產(chǎn)品中的營養(yǎng)成分較適合霉菌的孢子繁殖， 而且這類培 養(yǎng)基的表面積較大，可獲得大量的抱子。霉菌的培養(yǎng)一般為2528C

20、,培養(yǎng)時(shí)間為414天。本設(shè)計(jì)采用在pH=7 28E下培養(yǎng)12d。6.2 種子的制備種子制備是將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的抱子或菌體轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。種子罐培養(yǎng)的目的是使種子量增大，以縮短發(fā)酵罐的發(fā)酵延滯期。將生產(chǎn)菌種懸浮液用微孔接種法接入種子罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)， 種子罐之間的轉(zhuǎn) 接采用壓差接種法，種子罐接入發(fā)酵罐也采用壓差接種法。螺旋霉素的種子制備采用三級(jí)發(fā)酵。 培養(yǎng)溫度和時(shí)間均為28C、24h，接種 量分別為 15%、 8%。種子罐的衡算：二級(jí)種子罐：500X 0.7 X 0.08 - 0.7=40m3，每個(gè)周期需要3個(gè)40n®的種子 罐。一級(jí)種子罐：

21、40X 0.7 X 0.15 - 0.7=6m3，每個(gè)周期需要3個(gè)6m3的種子罐。6.3 影響種子質(zhì)量的因素（ 1 ）原材料質(zhì)量的影響（2）培養(yǎng)條件溫度：要獲得高質(zhì)量的抱子， 其最適溫度區(qū)間很狹窄， 必須保證在最適范圍， 盡量控制在28 C。濕度：其相對濕度應(yīng)當(dāng)保持在 40%- 50%之間。 通氣量：因采用三級(jí)發(fā)酵，通氣量定為 1： 1.5/ 分。（3）斜面冷藏時(shí)間：冷藏時(shí)間越長，越需要活化，冷藏時(shí)間不能超過78 天。7 發(fā)酵工藝流程控制7.1 發(fā)酵的分類 微生物發(fā)酵過程可分為分批、補(bǔ)料 - 分批、半連續(xù)和連續(xù)等幾種方式。 由于在發(fā)酵過程中需要添加培養(yǎng)基，本設(shè)計(jì)采用補(bǔ)料 - 分批發(fā)酵。7.2

22、發(fā)酵條件的影響及控制7.2.1 溫度 溫度：是指發(fā)酵整個(gè)過程或不同階段中所維持的溫度。 其高低與發(fā)酵中酶反應(yīng)速率、氧在培養(yǎng)液中的溶解度和傳遞速率、 菌體生長速率和產(chǎn)物合成速率等有 密切關(guān)系。影響發(fā)酵溫度變化的因素： 發(fā)酵熱是發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量， 由產(chǎn)熱 因素和散熱因素兩方面決定的。Q發(fā)酵=Q生物+ Q攪拌Q蒸發(fā)Q顯Q輻射7.2.2 pH 微生物生長和產(chǎn)物合成的最重要的狀態(tài)參數(shù)是代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)。PH對發(fā)酵的影響： 影響酶的活性。 影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)。 影響培養(yǎng)基中某些組分中間代謝產(chǎn)物的解離， 從而影響微生物對這些物質(zhì) 的利用； pH不同，引起菌體代謝過程不同，使代謝產(chǎn)物的

23、質(zhì)量和比例發(fā)生改變。 影響霉菌的形態(tài)。pH的控制： 發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，有些成分可在中間補(bǔ)料時(shí)補(bǔ)充調(diào)控。 加入適量的緩沖劑，控制培養(yǎng)基 pH的變化，采用內(nèi)源調(diào)節(jié)。 在發(fā)酵過程加酸堿或其他物質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)。7.2.3 溶氧溶氧是微生物生長所必需的， 是影響發(fā)酵的重要因素。 溶氧太低會(huì)使糖代謝 緩慢，菌體生長不良，產(chǎn)物合成受阻；溶氧太高則使菌體生長過于旺盛，底物完 全氧化的比例過高，也不利于產(chǎn)物的合成。對溶氧的控制還應(yīng)考慮底物的濃度， 在不同的底物濃度下應(yīng)有不同的溶氧水平，底物濃度較高時(shí)，增加DO可以加強(qiáng)菌體的代謝活性， 不會(huì)因?yàn)榛|(zhì)的完全氧化降低產(chǎn)量； 底物濃度較低時(shí)， 過高的 溶氧會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)的完全氧

24、化而降低產(chǎn)物的產(chǎn)量。DC水平應(yīng)該保持在50鳩下。7.2.4CO2溶解在發(fā)酵液中的CO對發(fā)酵有抑制或刺激作用。大多數(shù)微生物適應(yīng)低濃度 CO,當(dāng)尾氣CO濃度高于4%寸，微生物的糖代謝與呼吸速率下降。呼吸商 RQ=CO 釋放率/攝氧率，可以判斷菌的生長、呼吸情況，還可以反映菌的代謝情況。7.2.5 泡沫對發(fā)酵的影響及控制泡沫對發(fā)酵的影響及其控制：通氣攪拌和代謝產(chǎn)生的氣體是泡沫產(chǎn)生的原 因。泡沫是氣體被分散在少量液體中的膠體體系， 泡沫間被一層液膜隔開而彼此 不相連通。 一類存在于發(fā)酵液的液面上， 氣相所占比例特別大， 并且泡沫與它下 面液體之間有明顯界線； 另一種是出現(xiàn)在粘稠的發(fā)酵液中均勻而細(xì)的泡沫

25、， 比較 穩(wěn)定，其氣相所占比例由下而上逐漸增加， 氣泡與液面沒有明顯界限， 此類泡沫 又稱為流態(tài)型泡沫。泡沫控制方法包括物理消泡和化學(xué)消泡，在本設(shè)計(jì)中，豆油可作為消泡劑， 進(jìn)行消泡。7.3 發(fā)酵過程控制接種量為8%發(fā)酵周期為96小時(shí)，發(fā)酵溫度28° C,通氣量為1： 1.5/分， 濕度為40%- 50%在接種發(fā)酵后20小時(shí)補(bǔ)加前體正丙醇，40小時(shí)補(bǔ)加12滋酵 培養(yǎng)基， 60小時(shí)補(bǔ)加 10%培養(yǎng)基。在整個(gè)過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，并隔一段時(shí)間取樣進(jìn)行生化分析和無菌試驗(yàn)，觀察代謝變化、 抗生素產(chǎn)生情況和有無雜菌污染。7.4 發(fā)酵終點(diǎn)的判定判斷放罐的指標(biāo)主要有菌體濃

26、度、過濾速度、菌體形態(tài)、氨基氮、 pH、 DO 和發(fā)酵液的黏度和外觀等。一般，菌絲自溶前的跡象有：氨基氮、D刖pH開始上升，菌絲碎片增多，黏度增加，過濾速度下降。7.5 發(fā)酵染菌的防治與處理1. 染菌原因：種子質(zhì)量問題，培養(yǎng)及滅菌不徹底，空氣染菌，泡沫冒頂，夾 套、內(nèi)壁破裂。處理方法：（1）前期染菌，重新滅菌，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液； （ 2）中期染菌，檢 驗(yàn)所感染雜菌，偏離雜菌的生長條件； （3）發(fā)酵后期染菌，提前放罐。2. 噬菌體感染：發(fā)酵液變稀，在通氣量扥外部條件不變的情況下，DO迅速回升。處理方法：滅菌放罐，清除生產(chǎn)環(huán)境，調(diào)換生產(chǎn)菌株，停產(chǎn)整頓（極其嚴(yán)重 情況下），選育抗性菌。8 發(fā)酵罐的工藝

27、設(shè)置8.1 發(fā)酵罐的數(shù)量衡算年產(chǎn) 300噸的螺旋霉素的工藝設(shè)計(jì)， 螺旋霉素的發(fā)酵周期為 4 天，生產(chǎn)周期 為 5 天。一年的工作日有 200天。螺旋霉素的產(chǎn)率為 11.1g/L ，發(fā)酵液收率 95%， 發(fā)酵液預(yù)處理收率為 95%，固液分離率為 83%，提取率為 92%，純化時(shí)收率為 82%， 干燥的收率為 95% 提取總收率為（0.92 X 0.83 X 0.82 X 0.95 X 0.95=0.56 ） 0.56 , 裝料系數(shù) 0.7 。產(chǎn) 300 噸螺旋霉素所需的發(fā)酵液量：300X 103十 0.95 - 0.56 - 11.1=50802.68m3每個(gè)周期所需發(fā)酵液的體積為：50802.

28、68 -（200-5） =1270.07m3本設(shè)計(jì)選用補(bǔ)料分批發(fā)酵，選取 500 m3的發(fā)酵罐。每個(gè)發(fā)酵罐一個(gè)周期的共用發(fā)酵液量為：500X 0.7 X( 1+12%+10% =427n3所以選用三個(gè)500n®的發(fā)酵罐。8.2發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)(1) 發(fā)酵罐的選擇選用機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐(2) 發(fā)酵罐設(shè)計(jì)發(fā)酵罐中，取 H/D=2;取 d/D=1/3 ; C/d=1; s/d=3 ; W/d=0.1; B=0.2W 封頭 高度：h=ha+hb,ha=1/4D。V全=n D"H+2(hb+D/6)/4,H=2D,hb 忽略。V全=500n3, 得 D=6.52m,H=13.04m,d=

29、2.17m,C=2.17m,s=6.52m,W=0.217m,B=0.04m.其中：H:發(fā)酵罐筒身高D:發(fā)酵罐內(nèi)徑d:攪拌器直徑W:檔板寬度C:下攪拌器距底部距離S:兩攪拌器之間的距離H :液位高度B:擋板與罐壁距離9下游加工螺旋霉素發(fā)酵液的提取采用溶酶萃取法。螺旋霉素的提取步驟：9.1 發(fā)酵液預(yù)處理將發(fā)酵液加1.0%1.5%的硫酸鋁并調(diào)節(jié)pH值4.55.0，攪拌，靜止，使蛋白 質(zhì)充分沉淀。9.2 過濾發(fā)酵液首先通過板框過濾機(jī)過濾。 各板框機(jī)的進(jìn)料壓力相同， 過濾壓力最初 不得超過0.03 MPa待每個(gè)出料嘴都出料后可以提高至0.05 MPa濾速減慢，至 0.100.15 MPa整批過濾完后，

30、用3.54.0 m3/次的水頂洗，用30% (V/V)低 單位(400 U/mL以下)酸水頂洗。接著過濾液由水輸送至濾液貯池，濾液再通過 泵送至混合萃取罐。9.3 醋酸丁酯提取用5moL/L NaO調(diào)過濾液pH值8.59.0，將醋酸丁酯泵入混合萃取罐。啟動(dòng) 攪拌機(jī)攪拌( 80100r/min )混合后靜置分層。若干小時(shí)后，如出現(xiàn)乳化層，則 用高速離心機(jī)將丁酯相和水相分開。9.4 水洗丁酯提取液由萃取罐泵送到水洗罐。然后用 40C、50%(V/V)無鹽水洗滌2 次，每次洗滌均間歇攪拌(轉(zhuǎn)速80100r/min ) 1 min，重復(fù)3次，靜置分層40 60 min ，當(dāng)放水至乳化層為白色時(shí)為止。9

31、.5 水提水洗后再泵入水提灌。按水提液為3000050000 U/mL計(jì)算無鹽水。用量： 用1moL/L氯化氫和0.05mmoL/L磷酸二氫鈉緩沖液調(diào)pH值為2.02.5，與丁酯提取 液混合攪拌1min,重復(fù)3次，靜置分層4060 min，分2次提取，合并2次水液， 用真空泵抽到脫溶罐。9.6 脫丁酯水提液通過真空泵緩緩輸入脫丁酯罐。用1moL/L氫氧化鈉回調(diào)pHfi5.05.5，加堿液要慢，防止局部結(jié)膜，用0.02 MPa干凈空氣和真空徹底去除，至無 丁酯味為止，防止跑料。9.7結(jié)晶晶體成核可分為初級(jí)成核（沒有待結(jié)晶物質(zhì)以晶體形式存在）和二次成核（已 有待結(jié)晶的物質(zhì)以晶體形式存在）兩類。螺旋

32、霉素晶核大小測量困難，因?yàn)榻Y(jié)晶過程中成核和晶體生長總是相耦合 的，并且沒有合適的條件可以保存它。光散射提供了一種估計(jì)核大小的有效方法， 這種方法簡便易行。利用光散射測量單分散性球形顆粒的粒徑。螺旋霉素顆粒的真密度可以使用比重瓶法測量，測量的流體介質(zhì)為正辛烷。9.8干燥將顆粒在真空干燥箱內(nèi)真空度為99990PS以下，水溫80C，每2 h翻料1 次，如有結(jié)塊必須壓碎。干燥時(shí)間10 h左右，當(dāng)水分達(dá)到15%以下時(shí)停止。9.9包裝干燥后進(jìn)入最后包裝階段，將干粉分裝于 8 kg的木桶或3 kg的鐵桶內(nèi)，桶內(nèi) 用3層包裝，塑料袋外層為1層牛皮紙，最內(nèi)一層仍為塑料袋，用繩扎好。10.物料衡算指標(biāo)名稱單位指標(biāo)數(shù)生產(chǎn)規(guī)模t/a：300生產(chǎn)方法用產(chǎn)二素鏈霉菌生產(chǎn)螺旋霉素年工作日d/a200發(fā)酵液收率%95發(fā)酵周期h96提取率%產(chǎn)率g/i11.1發(fā)酵液量 生產(chǎn)300噸螺旋霉素需要發(fā)酵液V=50802.68n3 淀粉： 50802.68*70=3556187