鼻咽癌組織中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3與潛伏膜蛋白1的表達(dá)及其關(guān)系

1、鼻咽癌組織中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3與潛伏膜蛋白1的表達(dá)及其關(guān)系【摘要】 目的 研究鼻咽癌組織中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的表達(dá)和活化狀態(tài)及其與愛潑斯坦-巴爾病毒(EpsteinBarr virus, EBV)編碼的潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP1)表達(dá)的關(guān)系。方法 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)45例鼻咽癌、27例慢性鼻咽炎組織中LMP1、STAT3和磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白的表達(dá)并分析其相關(guān)性。結(jié)果 鼻咽癌組織中LMP1、S

2、TAT3和pSTAT3蛋白的陽(yáng)性率均高于慢性鼻咽炎組織(P<0.01)。相關(guān)分析結(jié)果顯示， LMP1和pSTAT3表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.302，P<0.05)，但LMP1與STAT3表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05)。結(jié)論 鼻咽癌組織中存在STAT3蛋白高表達(dá)和異常激活;LMP1可能參與STAT3的活化。 【關(guān)鍵詞】 鼻咽腫瘤;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3;潛伏膜蛋白1ABSTRACT: Objective To study the expression and activation of signal transducer and activator

3、of transcription 3 (STAT3) in human nasopharyngeal carcinoma(NPC) tissues and its relation with the expression of latent membrane protein 1 (LMP1) encoded by EpsteinBarr virus.Methods The expressions of LMP1, STAT3 and phosphated STAT3 (pSTAT3) in 45 cases of NPC and 27 cases of chronic nasopharyngi

4、tis were studied by immunohistochemical method. Correlation between protein expressions was analyzed.Results The positive rates of LMP1, STAT3 and p2 / 16STAT3 in NPC were significantly higher than those in chronic nasopharyngitis (P<0.01). There was a positive correlation between the express

5、ions of LMP1 and pSTAT3 (rs=0.302, P<0.05), but no obvious correlation between LMP1 and STAT3 expressions (P>0.05).Conclusion There are overexpression and abnormal activation of STAT3 protein in NPC tissues. LMP1 may play a role in the activation of STAT3.KEY WORDS: nasopharyngeal carc

6、inoma (NPC); signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3); latent membrane protein 1(LMP1)鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)南方及東南亞地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，目前認(rèn)為其發(fā)病與愛潑斯坦巴爾病毒(EpsteinBarr virus, EBV)感染、遺傳及環(huán)境等因素有關(guān)。EBV編碼的潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP1)由于能轉(zhuǎn)化小鼠成纖維細(xì)胞并在裸鼠體內(nèi)成瘤而被視為EBV的瘤基因1。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化

7、因子(signal transducers and activators of transcription, STATs)家族是一種存在于胞質(zhì)并在激活后能夠轉(zhuǎn)入核內(nèi)與DNA結(jié)合的蛋白家族。STATs家族成員中，STAT3與腫瘤的關(guān)系最為密切2。目前，對(duì)于STAT3在鼻咽癌中表達(dá)及其與LMP1相關(guān)性的研究報(bào)道甚少，本文研究鼻咽癌組織中STAT3的表達(dá)及其與LMP1的關(guān)系。1 材料與方法1.1 臨床資料 收集廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院20052006年石蠟標(biāo)本，共72例。其中鼻咽癌標(biāo)本45例(男26例，女19例，均為鼻咽非角化性癌)，患者年齡1876歲，中位年齡49歲。慢性鼻咽炎標(biāo)本27例(男16例，女1

8、1例)，患者年齡1679歲，中位年齡47歲。所有病例資料完整，診斷前均未行放療或化療。1.2 主要試劑 鼠抗人LMP1單克隆抗體(克隆CS.14)購(gòu)自丹麥DAKO公司，兔抗人STAT3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Neomarkers公司，兔抗人磷酸化STAT3(PhosphoTyr705)多克隆抗體為美國(guó)Signalway公司產(chǎn)品。SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉公司。1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化SP法。用已知的陽(yáng)性標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。全部標(biāo)本經(jīng) 100mL/L中性甲醛固定，石蠟包埋，4m連續(xù)切片。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后，高壓修復(fù)抗原，30mL/L過氧化氫孵育5

9、min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;正常山羊血清封閉20min。滴加稀釋好的一抗(LMP1為1100稀釋，STAT3和pSTAT3均為150稀釋)，4過夜孵育。滴加1100生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育15min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的卵白素，室溫孵育15min。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、中性樹脂封片。1.4 結(jié)果判斷 每一批免疫組化染色均設(shè)已知陽(yáng)性對(duì)照和用PBS代替一抗的空白對(duì)照。LMP1陽(yáng)性表達(dá)定位于胞膜和胞質(zhì)，STAT3陽(yáng)性表達(dá)定位于胞質(zhì)，pSTAT3陽(yáng)性表達(dá)定位于胞核和胞質(zhì)。由兩名病理診斷醫(yī)生分別對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行雙盲法評(píng)估。每一切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野(×100)，在顯微

10、鏡(×400)下計(jì)數(shù)每個(gè)視野100個(gè)腫瘤細(xì)胞，非癌組織則計(jì)數(shù)著色區(qū)100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的比例，取5個(gè)視野的平均百分?jǐn)?shù)為判定結(jié)果。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)34作適當(dāng)修改：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%為0分;6%25%為1分;26%50%為2分;51%75%為3分;>75%為4分。染色強(qiáng)度：0分為無(wú)染色;1分為淡黃色;2分為棕黃色;3分為深棕色。免疫組化染色結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度分別評(píng)分，兩者乘積01分為陰性(-);23分為陽(yáng)性(+);4分以上為強(qiáng)陽(yáng)性()。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)資料采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS for Windows 11.0做四格表的卡方檢驗(yàn)，Spearman等級(jí)相關(guān)分析

11、。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 STAT3、pSTAT3和LMP1蛋白在鼻咽癌及慢性鼻咽炎組織中的表達(dá)情況 STAT3和pSTAT3蛋白在癌細(xì)胞中多呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);癌旁組織的淋巴細(xì)胞及慢性鼻咽炎黏膜上皮細(xì)胞中也有少量表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度遠(yuǎn)不及癌細(xì)胞。STAT3蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞胞質(zhì)，pSTAT3蛋白主要以胞核表達(dá)為主，胞質(zhì)也有不同程度的表達(dá)。LMP1主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)，染色強(qiáng)度從淡黃色到棕黃色不等。鼻咽癌組織中STAT3、pSTAT3及LMP1的陽(yáng)性率均明顯高于慢性鼻咽炎組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1及圖1)。其中19例鼻咽癌

12、組織表現(xiàn)為STAT3和pSTAT3共陽(yáng)性表達(dá)。表1 鼻咽癌和慢性鼻咽炎組織中STAT3、pSTAT3及LMP1的表達(dá)情況2.2 鼻咽癌組織中LMP1和STAT3、pSTAT3表達(dá)的相互關(guān)系 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，鼻咽癌組織中，LMP1和pSTAT3表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.302，P<0.05);LMP1與STAT3表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05，表2)。表2 鼻咽癌組織中LMP1和STAT3及pSTAT3表達(dá)的相互關(guān)系3 討 論STAT3為一種胞質(zhì)蛋白，被多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶等激活后其第705位酪氨酸磷酸化而pSTAT3蛋白隨后形

13、成蛋白二聚體并轉(zhuǎn)位入核，結(jié)合在特定基因的啟動(dòng)子上，誘導(dǎo)相應(yīng)基因的表達(dá)5。在正常生理狀態(tài)下，STAT3的激活是快速而短暫的，對(duì)于正常細(xì)胞的生理功能起著重要作用。STAT3過度激活后誘導(dǎo)cmyc、cyclinD1等多種與細(xì)胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)的關(guān)鍵基因的異常高表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)出致癌作用6。由于持續(xù)激活的STAT3會(huì)使培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并能在裸鼠中形成腫瘤7，STAT3已被認(rèn)為是一種癌基因。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在人類多種惡性腫瘤如血液系統(tǒng)腫瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中持續(xù)激活89。HSIAO等10發(fā)現(xiàn)STAT3在鼻咽癌中有高表達(dá)，但其活化情況尚不清楚。本研究同時(shí)觀察了鼻咽癌組

14、織中STAT3和pSTAT3蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中STAT3和pSTAT3表達(dá)水平均明顯高于慢性鼻咽炎組織，提示鼻咽癌組織中STAT3不僅高表達(dá)，并且呈持續(xù)激活狀態(tài)，STAT3蛋白在鼻咽癌發(fā)展過程中可能扮演重要的角色。LMP1是EBV編碼的具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞功能的癌基因。CHEN等11研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌細(xì)胞中，LMP1可通過上調(diào)白細(xì)胞介素6(IL6)的表達(dá)而激活STAT3，而STAT3可與EB病毒LMP1啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，從而形成一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，促使STAT3在鼻咽癌中持續(xù)活化及LMP1持續(xù)表達(dá)。在鼻咽癌組織的研究中，LMP1與STAT3表達(dá)是否有相關(guān)性的結(jié)果尚不一致1213。因此

15、，我們利用STAT3非磷酸化及磷酸化抗體分別檢測(cè)鼻咽癌組織中STAT3的表達(dá)水平及其活化狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中LMP1表達(dá)與pSTAT3表達(dá)呈正相關(guān)，而與STAT3表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)，這提示了鼻咽癌組織中LMP1可能通過某些機(jī)制直接活化STAT3，而對(duì)STAT3的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。由于LMP1調(diào)節(jié)了多種基因的表達(dá)，除了IL6外，LMP1還可通過哪些途徑影響STAT3的活化有待進(jìn)一步的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1HU LF, CHEN F, ZHENG X, et al. Clonability and tumorigenicity of human epithelial cells expres

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