結(jié)核桿菌Hsp65和hGMCSF雙順反子表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)

1、結(jié)核桿菌Hsp65和hGMCSF雙順反子表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)【摘要】 目的：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建pIHsp65GM雙順反子真核表達(dá)質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá). 方法：以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組為模板經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增出Hsp65基因，同時從質(zhì)粒pORFhGMCSF中擴(kuò)增出基因佐劑hGMCSF，分別克隆到真核表達(dá)載體pIRES的多克隆位點A（MCSA）和B（MCSB）中，構(gòu)建pIHsp65GM真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞中表達(dá)和檢測. 結(jié)果：酶切鑒定提示插入的基因片段大小分別為1.64 kb和0.47 kb，測序分析表明克隆的Hsp65和hGMCSF序列與GenBank上

2、公布序列完全一致；免疫組織化學(xué)方法檢測到表達(dá)Hsp65的陽性細(xì)胞；ELISA方法檢測到pIHsp65GM轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中hGMCSF的表達(dá),與空載體對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01). 結(jié)論：成功構(gòu)建和表達(dá)了pIHsp65GM質(zhì)粒，為研制優(yōu)于卡介苗的新型抗結(jié)核病DNA疫苗奠定基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 結(jié)核分枝桿菌；熱休克蛋白65；人粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子；雙順反子；基因佐劑0引言卡介苗（bacille calmetteguerin, BCG）是已被廣泛應(yīng)用于預(yù)防結(jié)核?。╰uberculosis, TB）的減毒活疫苗. 由于結(jié)核DNA疫苗的制備簡便、免疫效果好，目前已經(jīng)成為T

3、B的熱門侯選疫苗之一1. 結(jié)核桿菌熱休克蛋白65KD基因（heat shock protein 65KD, Hsp65）是研究最早的結(jié)核抗原之一，可以在動物體內(nèi)對結(jié)核分枝桿菌的感染產(chǎn)生強(qiáng)烈的保護(hù)性免疫反應(yīng)2.粒細(xì)胞2 / 15吞噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colonystimulating factor, GMCSF)作為良好的基因佐劑,可以利用其上調(diào)機(jī)體免疫水平的作用增強(qiáng)DNA疫苗的效能3-4. 雖然Hsp65抗原和GMCSF分別在感染免疫中的作用已經(jīng)被研究證實有效，但對人GMCSF協(xié)同Hsp65抗原在結(jié)核桿菌感染中的免疫應(yīng)答特點和保護(hù)力尚不清楚5. 我們

4、將兩者同時克隆到同一載體上，構(gòu)建含結(jié)核桿菌Hsp65和基因佐劑hGMCSF的雙順反子真核質(zhì)粒，旨在為進(jìn)一步了解結(jié)核DNA疫苗的免疫效果奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組，大腸桿菌DH5，載體pIRES和質(zhì)粒pORFhGMCSF(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室提供)；Ex Taq DNA聚合酶，T4 DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶Nhe I，EcoR I, Xba I和Not I，DL1 kb marker，質(zhì)粒提取試劑盒，DNA凝膠回收純化試劑盒(大連寶生物公司)；兩對PCR引物、重組質(zhì)粒上目的基因的序列測定由上海生工生物工程公司完成； Transmaster轉(zhuǎn)染

5、試劑（廣州博理生物科技公司）；即用型免疫組化Biotin SPHRP試劑盒，DAB酶底物顯色試劑盒（北京鼎國生物科技公司）；鼠抗人Hsp65蛋白單克隆抗體和人hGMCSF蛋白ELISA檢測試劑盒（深圳市晶美生物科技公司）.1.2方法1.2.1目的基因Hsp65和hGMCSF的PCR擴(kuò)增參照GenBank上結(jié)核分枝桿菌H37Rv株Hsp65基因CDS序列（NCBI登陸號：M15467）分別設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.1.2.2pIHsp65真核載體的構(gòu)建與鑒定將Hsp65的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收純化后與載體pIRES，同時用Nhe I和EcoR I雙酶切，酶切后進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并經(jīng)過凝膠

6、回收純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物，將兩者酶切純化的產(chǎn)物按照31的摩爾比混合，用T4 DNA連接酶連接24 h.轉(zhuǎn)化用低溫CaCl2制備的E.coli DH5感受態(tài)細(xì)菌，然后涂布于含氨芐青霉素50 g/mL的LB固體培養(yǎng)基中.次日，隨機(jī)挑取10個單菌落，分別接種于3 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37下150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜.先取少量菌液煮沸作為模板進(jìn)行菌落PCR檢測是否有Hsp65的存在，將菌落PCR篩選呈陽性的菌落用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA.將提取的質(zhì)粒DNA用Nhe I和EcoR I雙酶切，進(jìn)行電泳檢測，以DL1 kb marker為分子量參照， 將篩選出的陽性克隆產(chǎn)物的菌液進(jìn)行測

7、序鑒定. 測序采用Sanger雙脫氧鏈終止法， 對插入序列的兩端進(jìn)行測定， 測序工作由上海生物工程公司完成.1.2.3pIHsp65GM真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定同構(gòu)建pIHsp65載體方法一樣，將hGMCSF的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收純化后與載體pIHsp65同時用Xba I 和Not I 雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化后，將兩者酶切純化的產(chǎn)物按照31的摩爾比混合，用T4 DNA連接酶連接24 h,然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5，涂布于含氨芐青霉素50 g/mL的LB固體培養(yǎng)基中.次日，隨機(jī)挑取10個單菌落，分別接種于3 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37下150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜.

8、將菌落PCR篩選呈陽性的菌落用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA.將提取的質(zhì)粒DNA用Xba I 和Not I雙酶切，進(jìn)行電泳檢測，以DL1 kb marker為分子量參照，將篩選出的陽性克隆產(chǎn)物的菌液進(jìn)行測序鑒定.1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種在12孔板內(nèi)， 待細(xì)胞生長至70%80 %時， 加入陽離子多聚體轉(zhuǎn)染試劑Transmaster和質(zhì)粒pIHsp65GM的混合物.饑餓培養(yǎng)1 h,加入含100 mL/L小牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，檢測Hsp65和hGMCSF蛋白的表達(dá).1.2.5Hsp65蛋白表達(dá)的免疫組化檢測采用未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對照和轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒pIRES的細(xì)胞

9、為陰性對照，將空質(zhì)粒pIRES和重組質(zhì)粒pIHsp65GM轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h,去除培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖鹽水PBS沖洗.經(jīng)40 g/L的多聚甲醛固定后,依次滴加過氧化酶阻斷劑,正常動物非免疫血清,11000鼠抗人Hsp65蛋白抗體,生物素標(biāo)記二抗和鏈霉素抗生物素蛋白.最后加入新鮮配制的DAB工作液染色,顯微鏡下觀察結(jié)果，Hsp65蛋白的表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)染呈棕黃色者為陽性.1.2.6ELISA法檢測hGMCSF蛋白表達(dá)水平分別收集pIRES和質(zhì)粒pIHsp65GM轉(zhuǎn)染24 h和48 h的HepG2細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，采用ELISA雙抗體夾心法檢測hGMCSF蛋白的表達(dá)量，按照試劑盒說明進(jìn)行

10、操作.用酶標(biāo)儀在吸光度A450 nm下測定樣品和試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品的A值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所測A值繪制的蛋白濃度與A值相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品中hGMCSF蛋白的含量(以空白孔調(diào)零).統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行分析,組間比較采用兩樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果2.1Hsp65和hGMCSF基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物分別為1.64 kb和0.47 kb的特異性片段，與預(yù)期Hsp65和hGMCSF基因大小相符(圖1).2.2重組質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶消化鑒定質(zhì)粒pIHsp65經(jīng)Nhe I和Ec

11、oR I雙酶切后,電泳可見大小約6.1 kb與1.64 kb兩片段,與載體pIRES經(jīng)Nhe I和EcoR I雙酶切產(chǎn)物和Hsp65基因PCR產(chǎn)物的2條特異性條帶對比,大小相符（圖2A）.重組質(zhì)粒pIHsp65GM經(jīng)Xba I 和Not I雙酶切后,電泳可見大小約為7.74 kb與0.47 kb兩片段,與質(zhì)粒pIHsp65經(jīng)Xba I和Not I雙酶切產(chǎn)物和hGMCSF基因PCR產(chǎn)物的2條特異性條帶對比,大小相符（圖2B）.2.3序列分析鑒定對質(zhì)粒pIHsp65上的多克隆位點A(multiple cloning sites A,MCSA)內(nèi)的DNA序列進(jìn)行序列分析鑒定，結(jié)果與結(jié)核分支桿菌H37

12、Rv株的Hsp 65的基因序列完全相同.對質(zhì)粒pIHsp65GM上的多克隆位點B(multiple cloning sites B, MCSB)內(nèi)的DNA序列進(jìn)行序列分析鑒定, 結(jié)果與hGMCSF的基因序列完全相同.2.4Hsp65蛋白在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)顯微鏡下觀察，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的空白對照和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pIRES細(xì)胞的陰性對照對比，pIHsp65GM轉(zhuǎn)染的部分HepG2細(xì)胞中胞質(zhì)染呈棕黃色，表明Hsp65表達(dá)呈陽性（圖3）.2.5ELISA檢測pIRES對照組在轉(zhuǎn)染24和48 h時細(xì)胞上清液hGMCSF的表達(dá)量分別為（1.371±0.083） pg/mL和（1.782 ±

13、;0.127） pg/mL （n=3），而pIHsp65GM在轉(zhuǎn)染24和48 h時細(xì)胞上清液hGMCSF的表達(dá)量分別為（271.103 ±4.731） pg/mL和（253.124±3.943）pg/mL；pIHsp65GM轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染24和48 h時hGMCSF的表達(dá)量與pIRES對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）.3討論近年來，對結(jié)核研究最多的抗原主要有Hsp65,Ag85B, ESAT6和MPT64等6-7.其中Hsp65具有免疫優(yōu)勢抗原的特性，能誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫的發(fā)生，并可激活T細(xì)胞,分泌高水平的IFN和殺傷感染的細(xì)胞，是

14、人體感染結(jié)核桿菌以后免疫系統(tǒng)的主要靶抗原，是T細(xì)胞攻擊的主要對象8. 由于僅含有單抗原基因的DNA疫苗并不足以引發(fā)良好的免疫效果，還需要結(jié)合其他的手段如基因佐劑，特別是將細(xì)胞因子與DNA疫苗共表達(dá)才能產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫保護(hù)力. GMCSF作為DNA疫苗的免疫佐劑,能夠調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的分化和成熟,以及MHC和共刺激分子的表達(dá)水平,并且通過調(diào)節(jié)抗原提呈細(xì)胞尤其是樹突狀細(xì)胞的數(shù)量和功能來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度.有研究認(rèn)為將GMCSF作為佐劑與基因疫苗共同免疫小鼠結(jié)果比單獨應(yīng)用基因疫苗產(chǎn)生更強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答并可提供更強(qiáng)的免疫保護(hù)力3-5.本實驗采用載體pIRES為雙順反子真核表達(dá)質(zhì)粒，在上下游克隆位點之間的

15、序列為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點, 此段序列在轉(zhuǎn)錄后能夠自動斷裂, 使上下游克隆位點插入的基因能夠獨立高效的表達(dá)，從而避免了融合表達(dá)蛋白活性低下問題, 為兩種蛋白表達(dá)、動物實驗和結(jié)核疫苗研制提供較大方便. 與以往結(jié)核DNA疫苗的研究比較，本實驗具有以下特點：實現(xiàn)了目的基因與細(xì)胞因子基因在同一載體上共同表達(dá).如果將DNA疫苗與編碼GMCSF的質(zhì)粒混合注射會對DNA疫苗的免疫效果產(chǎn)生干擾作用；若將GMCSF與目的基因共同克隆到一個載體中，由于兩個基因具有相同的局部微環(huán)境，往往可以獲得較好的免疫效果9.本研究使用雙順反子真核表達(dá)載體pIRES，將兩個基因分別克隆到兩個多克隆位點，兩者各自表達(dá)，不相互影響蛋白

16、表達(dá)的空間結(jié)構(gòu).因為表達(dá)為融合產(chǎn)物的DNA疫苗可能破壞抗原的三維結(jié)構(gòu)，對抗體的生成產(chǎn)生負(fù)面影響10.【參考文獻(xiàn)】 1Mustafa AS. Development of new vaccines and diagnostic reagents against tuberculosis J. Mol Immunol, 2002,39:113-119.2Baek KM, Ko SY, Lee M, et al. Comparative analysis of effects of cytokine gene adjuvants on DNA vaccination against mycobact

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