人cbl基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

1、人cbl 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá) 【Abstract】AIM： To construct the eukaryotic expressing vector of human cbl and test its expression in African green monkey kidney cell line COS7. METHODS: Human cbl gene tagged with flag was amplified from pEFHAcbl plasmid by PCR. The product was cloned into pGEMT easy, sequenced

2、and then subcloned into eukaryotic expressing vector pcDNA3.1(+). The recombined vector was then transfected into COS7 cells with lipofectin and the expression of cbl gene was detected by Western blot. RESULTS: The eukaryotic expressing vector encoding human cbl was successfully constructed and its

3、expression in COS7 cells could be detected. CONCLUSION: The eukaryotic expressing vector encoding human cbl is constructed and it expresses flagcbl fused protein correctly in COS-7 cells.【Keywords】 cbl; polymerase chain reaction; cloning, molecular; gene expression【摘要】目的： 構(gòu)建帶有flag標(biāo)簽的人cbl 基因真核表達(dá)載體，并檢

4、測(cè)其在真核細(xì)胞中的表達(dá).方法： 以含有人全長(zhǎng)cbl cDNA的質(zhì)粒pEFHAcbl 為模板，采用PCR方法擴(kuò)增cbl基因，并在其N末端帶上含24 bp的flag標(biāo)簽，克隆到pGEMT easy載體并測(cè)序，再亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA31(+)，酶切鑒定正確后采用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，Western blot檢測(cè)flagcbl在細(xì)胞中的表達(dá). 結(jié)果： 測(cè)序證實(shí)以pEFHAcbl 為模板獲得的flagcbl融合基因的序列以及讀框全部正確；重組質(zhì)粒pcDNA31(+)flagcbl經(jīng)酶切后產(chǎn)生與理論預(yù)期長(zhǎng)度相符的片段；脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS7后檢測(cè)到預(yù)期目的蛋白的表達(dá).結(jié)論： 成功構(gòu)建了N末

5、端帶flag標(biāo)簽的cbl真核表達(dá)載體，并使其在真核細(xì)胞COS7中表達(dá). 2 / 15【關(guān)鍵詞】 cbl; 聚合酶鏈反應(yīng); 克隆，分子; 基因表達(dá)0引言Cbl (casitas Blineage lymphoma,簡(jiǎn)稱Cbl)是一類廣泛分布的細(xì)胞內(nèi)蛋白，在哺乳類中有Cbl、Cblb和Cbl3 3種.Cbl分子中含有多個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，可以介導(dǎo)與不同的細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)合，在細(xì)胞活化過(guò)程中可作為接頭分子或支架分子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；同時(shí)該分子中的RING結(jié)構(gòu)域能夠與泛素結(jié)合酶E2結(jié)合,作為泛素連接酶E3促進(jìn)其結(jié)合的靶分子發(fā)生泛素化蛋白酶體降解，因此參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控機(jī)制1.近年來(lái)的研究表明，突變的Cbl

6、可成為癌基因2；而許多腫瘤細(xì)胞內(nèi)與增殖有關(guān)的分子（如受體型蛋白酪氨酸激酶，RTK）發(fā)生突變后則不再受Cbl的負(fù)調(diào)控3.我們成功構(gòu)建了N末端融合有flag標(biāo)簽的cbl 基因的真核表達(dá)載體，并采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的COS7細(xì)胞，檢測(cè)其是否正確表達(dá)，為進(jìn)一步研究cbl 對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響奠定基礎(chǔ).1材料和方法11材料 大腸桿菌菌株DH5、pcDNA31(+)真核表達(dá)載體、COS7細(xì)胞由本室保存；含人全長(zhǎng)cbl cDNA的質(zhì)粒由美國(guó)La Jolla變態(tài)反應(yīng)與免疫學(xué)研究所保存；pGEMT easy購(gòu)自Promega公司；dNTP、dATP、pyrobest高保真聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、D

7、L2000 DNA Marker購(gòu)自Takara公司；1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibico 公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自invitrogen公司；抗flag M2 mAb和抗ACTIN抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠、兔第二抗體分別購(gòu)自Sigma公司和博士德公司；Western blot 所用發(fā)光底物為pierce公司產(chǎn)品；用于PCR反應(yīng)的引物由上海生物工程公司合成；質(zhì)粒提取和DNA 回收試劑盒由杭州維特潔公司提供.12方法 121引物設(shè)計(jì)上游引物序列： 5GGT ACC ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG ATG GCC GGC AAC GTG AA

8、G AAG AGC3，其中GGT ACC為KpnI酶切位點(diǎn).下劃線部分為編碼flag標(biāo)簽的核苷酸序列；下游引物序列： 5 CTC GAG CTA GGT AGC TAC ATG GGC AGG AGA AGA AAT GG 3，其中CTC GAG為XhoI酶切位點(diǎn).122PCR擴(kuò)增flagcbl基因及產(chǎn)物修飾在25反應(yīng)體系中加入25 L 10×反應(yīng)緩沖液，20 L dNTP，pEFHAcbl 質(zhì)粒模板10 L，上下游引物各10 L，pyrobest高保真酶025 L，補(bǔ)水至25 L.擴(kuò)增條件為94 5 min，94 45 s，62 1 min，72 2 min，35 cycles.擴(kuò)

9、增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離；回收后溶于35 L去離子水中，并進(jìn)行加“A”反應(yīng)： 50 L 反應(yīng)體系中加入5 L 10×反應(yīng)緩沖液，4 L dATP，3 L MgCl2，擴(kuò)增產(chǎn)物30 L，rTaq酶05 L，補(bǔ)水至50 L，72 40 min. 123PCR產(chǎn)物克隆及序列測(cè)定上述加“A”后的PCR產(chǎn)物回收，回收片段克隆到pGEMT easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序.124pcDNA31(+)flagcbl真核表達(dá)載體的構(gòu)建用BglI先將pGEMT easy酶切成小片段，因flagcbl內(nèi)部無(wú)BglI酶切位點(diǎn)，故包含在酶切后產(chǎn)生的

10、最大片段內(nèi)，將該片段回收后再用Kpn/Xho將flagcbl切出，插入pcDNA31(+)真核表達(dá)載體中，構(gòu)建出重組表達(dá)載體pcDNA31(+)flagcbl.125基因轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞在含100 mL/L新生小牛血清的1640 培養(yǎng)基中，于37，50 mL/L CO2飽和濕度下培養(yǎng)，80%匯合時(shí)按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行空質(zhì)粒和重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染.126Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)分別于轉(zhuǎn)染后24，48 h收細(xì)胞并裂解細(xì)胞內(nèi)總蛋白，取20 g處理后的蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至NC膜，5 g/L脫脂奶封閉1 h，分別與適當(dāng)稀釋后

11、的一抗孵育1 h、PBST洗膜，然后與14000二抗孵育1 h，PBST洗膜后加入發(fā)光底物孵育1 min，暗室中用X光片曝光，顯影，定影.2結(jié)果21人cbl基因的克隆及序列測(cè)定用PCR技術(shù)以pEFHAcbl 質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到2737 bp片段（Fig 1），加“A”后克隆到pGEMT easy載體中，EcoRI/XhoI酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示切出大小為450、1190和3000 bp的幾種片段（Fig 2），表明系陽(yáng)性克隆，測(cè)序結(jié)果表明，所克隆的人cbl基因序列以及flagcbl融合基因的讀框完全正確.22真核表達(dá)載體pcDNA31(+)flagcbl的構(gòu)建利用酶切后產(chǎn)生的載體和片段之

12、間互補(bǔ)的黏性末端進(jìn)行亞克隆.構(gòu)建成功的pGEMT easy flagcbl先用Bgl 將pGEMT easy酶切成小片段，而flagcbl內(nèi)部無(wú)Bgl酶切位點(diǎn)，包含在最大片段內(nèi)，將該片段回收后再用KpnI/Xho雙酶切將flagcbl切出，插入pcDNA31(+)真核表達(dá)載體.Kpn/Xho雙酶切和EcoR/Xho雙酶切鑒定均表明pcDNA31(+)flagcbl表達(dá)載體構(gòu)建成功（Fig 3）.23真核表達(dá)載體pcDNA31(+)flagcbl在COS7細(xì)胞中的表達(dá)構(gòu)建成功的pcDNA31(+)flagcbl和空質(zhì)粒pcDNA31(+)分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h和48 h ant

13、iflag抗體均檢測(cè)到flagcbl在蛋白水平的表達(dá)，Mr約為120×103；而對(duì)照的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后則沒(méi)有相應(yīng)的條帶（Fig 4）.表明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA31(+)flagcbl 可以在真核細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá).3討論Cbl家族蛋白屬于泛素連接酶E3家族的一大類，這類分子中具有RING結(jié)構(gòu)域，又稱為RING型E3 .遺傳和進(jìn)化研究顯示，Cbl家族蛋白是一類保守的蛋白酪氨酸激酶（PTK）信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因素.這一現(xiàn)象最早是在對(duì)C. elegans研究中發(fā)現(xiàn)的，功能缺失的Cbl同源分子Sli1可以恢復(fù)EGFR同源分子Let23的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而增加Sli1基因的拷貝數(shù)則可抑制此通路4；對(duì)

14、Drosphila的研究也發(fā)現(xiàn)DCbl同樣可負(fù)調(diào)控EGFR介導(dǎo)的信號(hào)通路5.此后，越來(lái)越多的研究表明，CCbl可以促進(jìn)多種受體型蛋白酪氨酸激酶（RTK）如EGFR、PDGFR、6、CSF1R7等發(fā)生配體誘導(dǎo)的泛素化和隨后的蛋白酶體降解.Cbl的這種負(fù)調(diào)控RTK作用對(duì)于維持正常細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)機(jī)制具有重要意義.而上述分子很多在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，有些是癌基因的產(chǎn)物；并且許多腫瘤細(xì)胞內(nèi)與增殖有關(guān)的RTK發(fā)生突變后則不再受Cbl的負(fù)調(diào)控3.這就提示，加強(qiáng)Cbl分子的負(fù)調(diào)控作用機(jī)制，下調(diào)某些腫瘤細(xì)胞內(nèi)過(guò)度活化或發(fā)生突變的RTK可能會(huì)抑制相應(yīng)腫瘤的惡性增殖.已有研究表明CCbl不僅可以使細(xì)胞表面

15、的Neu迅速泛素化、下調(diào)，并抑制其下游信號(hào)通路，而且可以抑制轉(zhuǎn)染了Neu的神經(jīng)母細(xì)胞瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)8.與此相一致，Klapper等認(rèn)為HER2單抗Heceptin的抗癌機(jī)制與Cbl結(jié)合并促使HER2泛素化、降解有關(guān)9.另外，膜錨定的Cbl可以逆轉(zhuǎn)由Hck導(dǎo)致的鼠成纖維細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)的改變以及錨著非依賴性生長(zhǎng)受抑10.在鼠NIH3T3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Cbl可抑制PDGF和PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及抵抗凋亡6.這些研究結(jié)果強(qiáng)烈地提示： Cbl可能能夠抑制各種增殖性疾?。ò[瘤在內(nèi)）的細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路，有可能將其作為與異?；罨疨TK相關(guān)疾病的治療手段.我們以pEFHAcbl 質(zhì)粒為模

16、板，通過(guò)PCR法獲得了N末端融合有flag標(biāo)簽的人cbl基因，并構(gòu)建了的flagcbl基因的真核表達(dá)載體，該表達(dá)載體在真核細(xì)胞COS7中能夠正確表達(dá).這為我們進(jìn)一步研究cbl對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，探討一種腫瘤治療的新思路奠定了基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】1 Joazeiro C, Wing S, Huang H, et al. The tyrosine kinase negative regulator cCbl as a RINGtype, E2dependent ubiquitinprotein ligase J. Science, 1999 ;286(5438):309-312.2 Thien C

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