進展期胃癌術(shù)中動脈化療對p53和ki67表達及細胞凋亡作用的影響

1、進展期胃癌術(shù)中動脈化療對p53和ki-67表達及細胞凋亡作用的影響 作者：何運勝姜淮蕪?fù)羰①t肖仕明劉小波【摘要】 目的：觀察進展期胃癌術(shù)中動脈化療對原發(fā)灶和癌旁轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)p53、ki-67表達和細胞凋亡的影響。方法：35例進展期胃癌隨機分為2組，20例術(shù)中經(jīng)胃周動脈灌注化療藥物即術(shù)中灌注（intraoperative artery infusion chemotherapy，IAIC）組，15例術(shù)前介入化療即術(shù)前介入組。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測原發(fā)灶和癌旁轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)p53、ki-67蛋白基因表達和TUNEL法檢測細胞凋亡情況。結(jié)果：2組治療前、治療后p53、ki-67蛋白表達及細胞凋亡指數(shù)（

2、apoptosis index，AI）在動脈化療前、后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；2組立即有效性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；IAIC組治療后原發(fā)灶、癌旁轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的p53、ki-67表達與術(shù)前介入組治療后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；IAIC組治療后原發(fā)灶、癌旁淋巴結(jié)的AI不如術(shù)前介入組（P0.05）。結(jié)論：進展期胃癌IAIC可增強藥代動力學(xué)優(yōu)勢和精確的靶向化療，對減少和防止術(shù)中癌細胞的醫(yī)源性擴散、種植及術(shù)后復(fù)發(fā)有重要的臨床意義，IAIC可望成為進展期胃癌多模式治療重要的組成部分。 【關(guān)鍵詞】 進展期胃癌·藥物療法·p53·ki-67·

3、基因表達·細胞凋亡1 / 18 【ABSTRACT】 0bjective: To observe the effect of artery infusion in the treatment of advanced gastric carcinoma. Methods：Thirty-five cases of advanced gastric carcinoma were randomly divided into intraoperative artery infusion chemotherapy （IAIC, 20 cases） and preoperative interve

4、ntion chemotherapy （15 cases） groups. The specimen of preoperative gastroscopic biopsy samples and resected tissues were harvested. The gene expressions of p53 and ki-67 were analyzed, and situ terminal transferase-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） was used to detect the states of apoptosis. R

5、esults：There were significant differences in p53 and ki-67 expressions between two groups （P<0.05）. AI was lower in the metastasis lymph node of IAIC group （P<0.05）. Conclusion：IAIC was effective in decreasing and preventing iatrogenic cancer cell diffusion and recurrence in advanced g

6、astric cancer. 【KEY WORDS】 Advanced gastric carcinoma·Drug therapy·p53·ki-67·Gene expression·Cell apoptosis 進展期胃癌（advanced gastric carcinoma, AGC）的最主要治療手段是外科手術(shù)切除，但并不能改變AGC術(shù)后癌細胞殘留、局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性1。研究認為通過術(shù)中超選動脈灌注抗癌藥物，形成腫瘤局部區(qū)域高濃度來提高根治手術(shù)的效果、減少術(shù)中的醫(yī)源性播散，可獲得生存益處2-5。但這些結(jié)果主要為臨床觀察性研究，

7、為此本研究觀察術(shù)中動脈灌注化療（intraoperative artery infusion chemotherapy，IAIC）后原發(fā)癌灶及癌旁轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的p53、ki-67蛋白表達，癌細胞變形、凋亡變化，并以術(shù)前介入化療作為對照，旨在評價IAIC的臨床意義。 1資料與方法 1.1一般資料收集2007年9月1日2008年3月1日入住川北醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院經(jīng)胃鏡、病理組織學(xué)確診及術(shù)中確診的進展期胃癌患者（包括賁門癌患者），且能夠耐受開腹手術(shù)（賁門癌）能經(jīng)腹完成的病例，納入研究組，共35例，男23例，女12例。年齡4079歲，中位年齡55.5歲。隨機分為2組，20例行IAIC即術(shù)中灌注組（IAI

8、C組），15例行術(shù)前介入化療即術(shù)前介入組。按國際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的TNM分期（1997年版），IAIC組期例，期10例，期5例；術(shù)前介入組期3例，期8例，期4例。所有患者及家屬自愿接受介入化療和IAIC治療方案，并簽字為憑。早期胃癌及患者、家屬不愿接受該方案的患者；不能夠耐受開腹手術(shù)和賁門癌不能經(jīng)腹完成的患者；入院前已接受了化療及免疫制劑治療（包括中藥）等患者不納入研究組。 1.2主要試劑及儀器注射用鹽酸拓普替康：2 mg/瓶，由黃石飛云制藥生產(chǎn)；順鉑注射液：20 mg/瓶，由云南個舊生物藥業(yè)生產(chǎn)；替加氟注射液：5 mL，0.25 g/支，由齊魯制藥生產(chǎn)；Polymer Detecti

9、on System For Immuno-Histological Staining PV-9000和TUNEL試劑盒：購于美國GBI公司；Olympus顯微鏡CX31-32L02（日本原裝，購于湖北孝感市陽光神琦醫(yī)藥有限公司)；PAS-8000真彩色病理圖像分析軟件，購于成都帕薩羅杰儀器有限公司；動脈穿刺導(dǎo)管、導(dǎo)絲、鞘組，購于日本TURUMO公司；高壓注射泵針筒、DSA連接管(南京嘉辰醫(yī)療器材有限公司)。 1.3方法 1.3.1IAICIAIC組患者手術(shù)入腹后，胃近半癌經(jīng)分離出胃左或胃網(wǎng)膜左動脈的灌注；胃遠半癌經(jīng)分離出胃網(wǎng)膜右動脈或胃右動脈灌注，置入導(dǎo)管并確認在動脈血管內(nèi)，同時結(jié)扎伴行的靜脈

10、；生理鹽水200 mL+拓普替康6 mg ,替加氟1.0 g，順鉑40 mg迅速動脈灌注。IAIC組血管選擇：胃左動脈4例、胃右動脈3例、胃網(wǎng)膜右動脈9例、胃網(wǎng)膜左動脈4例。 1.3.2術(shù)前介入化療術(shù)前介入組患者采用Seldinger法，用藥成分及劑量同IAIC，超選動脈灌注，術(shù)前介入組血管選擇：肝動脈3例、胃左動脈9例、胃右動脈3例，未作動脈栓塞，介入化療后79 d（平均7.5 d）接受手術(shù)。 1.3.3手術(shù)類型2組、期患者行R0切除，D2+或D3淋巴結(jié)清除；期患者進行姑息切除，盡量行D2淋巴結(jié)清除。 1.3.4病理組織學(xué)檢查35例患者術(shù)前門診胃鏡活組織檢查標本、手術(shù)切除的大體胃癌標本及癌旁

11、淋巴結(jié)標本經(jīng)10甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，4 m厚連續(xù)切片，分別作HE染色、免疫組織化學(xué)SP法染色及原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記（TUNEL法），光學(xué)顯微鏡下觀察。以細胞核中出現(xiàn)棕紅色顆粒為癌細胞蛋白陽性表達。 1.4評價標準立即有效性采用病理切片點計數(shù)與直接計數(shù)方法6，計算鏡下變性、壞死癌細胞占全部癌細胞的構(gòu)成比：0級（<25%）為(無效)；級(25%)為輕度有效；級（50%）為中度有效；級（75%）為明顯有效；I級的記為有效，有效率（%）=有效例數(shù)/病例數(shù)×100%。 p53、ki-67蛋白表達及凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）計算方法7：

12、選取10個高倍視野，用圖像分析儀定量計數(shù)腫瘤細胞陽性表達數(shù)，每個標本計數(shù)細胞總數(shù)不少于200個， p53、ki-67蛋白陽性表達率（%）= 陽性表達細胞數(shù)計數(shù)細胞總數(shù)×100%，AI=陽性表達細胞數(shù)計數(shù)細胞總數(shù)。 1.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行分析，采用2檢驗，計數(shù)資料用x±s表示，有效率的等級資料采用非參數(shù)統(tǒng)計分析秩和檢驗（Wilcoxon），計量資料采用t檢驗。=0.05為檢驗水準。 2結(jié)果 2.12組患者治療后的有效率比較IAIC組從灌注開始到手術(shù)切下標本最短的時間為80 min，最長的時間為135 min，平均85 min；術(shù)前介入組在介入化療后

13、79 d（平均7.5 d）接受手術(shù)。20例IAIC組術(shù)后立即有效性分別為0級2例、級2例、級9例、級7例，有效率為90%；而15例術(shù)前介入組為0級1例、級4例、級5例、級5例，其有效率為93%，2組間有效率對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 2.2進展期胃癌治療前、后原發(fā)癌灶的p53、ki-67蛋白表達及AI的檢測結(jié)果p53、ki-67蛋白表達定位于原發(fā)灶癌細胞核，呈棕褐色（圖1 A、C）；細胞凋亡小體定位于原發(fā)癌灶的細胞核，呈棕紅色，凋亡細胞主要分布在腺上皮或腺管內(nèi)，有成團的分布或散在分布，發(fā)生了明顯的組織學(xué)改變，表現(xiàn)為癌細胞數(shù)量相對減少，核固縮且淡染變性，核質(zhì)比例減小，纖維組織增生，部分

14、伴有壞死灶，該變化在癌細胞浸潤的前沿區(qū)域較為明顯，并可見明顯的細胞核固縮、碎裂(圖2 A)。p53、ki-67及AI，2組治療后明顯優(yōu)于治療前（P0.05）；治療后2組組間對比p53、ki-67蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；2組組間對比AI，術(shù)前介入組優(yōu)于IAIC組（P<0.05，表1）。 2.3進展期胃癌治療后癌旁轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的p53、ki-67及AI檢測結(jié)果p53、ki-67蛋白表達定位于癌癥轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞核上，呈棕褐色（見圖1 E、F）；細胞凋亡小體定位于癌旁轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞核上，呈棕紅色，成團的分布或散在分布，發(fā)生了明顯的組織學(xué)改變，核質(zhì)比例減小，可

15、見明顯的細胞核固縮、碎裂(見圖2 B)。治療后IAIC組和術(shù)前介入組的p53、ki-67蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），AI比較，術(shù)前介入組優(yōu)于IAIC（P0.05，見表1）。 3討論 Araki等8早在1995年就提出并界定的術(shù)中局部灌注化療(intraoperative local infusion chemotherapy，ILIC即IAIC），在理論上完全能夠達到減少腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的最終目的。腫瘤藥代動力學(xué)研究表明，經(jīng)胃左動脈給藥時，胃壁組織中藥物濃度較高，其癌緣藥物的濃度可達全身化療時的968倍，并可使門靜脈中藥物濃度達到全身化療時的200倍，有效作用時間大大延長9，并可在

16、癌組織、門靜脈、肝臟和癌旁淋巴組織中均形成高濃度的“化療浴場”，明顯提高腫瘤局部及轉(zhuǎn)移路徑藥物的濃度，且符合“為了提高胃癌患者的生存率，有必要加強胃癌肝轉(zhuǎn)移的研究與治療”的觀點10，且抗腫瘤藥物僅需在腫瘤組織中維持30 min就可導(dǎo)致癌細胞核發(fā)生固縮和碎裂11。 Soini等12在癌細胞中發(fā)現(xiàn)細胞增殖、凋亡和壞死的復(fù)合指標較任一單獨指標能更準確地反映預(yù)后。癌基因的活化是促使腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素之一，但抑癌基因的失活在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到更加常見、重要的作用12-13。抗腫瘤藥物通過破壞DNA介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑癌基因p53可誘導(dǎo)細胞發(fā)生調(diào)亡14，Meta定量分析認為p53表達是獨立影響胃

17、癌預(yù)后的重要參數(shù)15；而ki-67與細胞增殖密切相關(guān)，研究表明ki-67核抗原表達的胃癌具有較高的增殖活性，與胃癌的惡性生物學(xué)行為顯著相關(guān)16。ki-67蛋白表達陽性率隨著腫瘤浸潤深度的增加而增加，生存期分析顯示，ki-67高陽性表達胃腺癌患者預(yù)后差，5年生存率低(P0.01)。故在IAIC后，通過癌基因和抑癌基因的檢測可快速反映癌細胞的生長狀況。術(shù)前介入化療后可明顯上調(diào)p53、下調(diào)ki-67表達和促使AI上調(diào)7,17。本研究表明IAIC和術(shù)前介入化療有等效作用，通過介導(dǎo)抑癌基因p53蛋白表達上調(diào)，從而發(fā)揮抑癌作用；高濃度大劑量藥物隨轉(zhuǎn)移途徑，殺死大量G1、S、G2、M期敏感的具有增殖活力的腫

18、瘤細胞18，顯著抑制腫瘤細胞增殖活性，降低癌細胞ki-67增殖核抗原，協(xié)同抑癌基因p53，加速癌細胞凋亡。 2組治療后原發(fā)癌灶A(yù)I明顯增高，從統(tǒng)計學(xué)上看，術(shù)前介入組要優(yōu)于IAIC組；IAIC組在細胞凋亡上不如術(shù)前介入組明顯，可能與IAIC的藥物作用時間有一定的關(guān)系，術(shù)前介入化療后平均7.5 d后接受手術(shù)，而IAIC灌注的化療藥物作用原發(fā)灶的時間僅僅是短短的幾十分鐘到數(shù)小時（即IAIC藥物灌注結(jié)束到手術(shù)切下胃腫瘤標本這一段時間）。但IAIC能明顯促進癌細胞的凋亡，IAIC灌注前、后有較強的相關(guān)性。如何提高IAIC的AI，筆者將對此做進一步研究。 通過動脈化療，在光學(xué)顯微鏡下觀察HE標本和細胞凋亡

19、病理標本，發(fā)現(xiàn)原發(fā)癌灶和癌旁淋巴結(jié)癌細胞發(fā)生了顯著的立即改變。IAIC組能夠在80 min內(nèi)，使大量腫瘤細胞變性、壞死，級2例、級9例、級7例，有效率達90%，與高登鵬等11,19報道的立即有效性91、95%基本一致；而術(shù)前介入組級4例、級5例、級5例，有效率為93%，2組有效率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），充分說明IAIC能夠利用高濃度大劑量抗腫瘤藥物，促進藥物的濃度依賴性、增加局部藥物的濃度，提高破壞腫瘤細胞的能力，與術(shù)前介入化療有等效的作用。 通過進展期胃癌IAIC的前瞻性研究，筆者認為進展期胃癌IAIC，靶向精確，近期效果良好，對減少和防止術(shù)中癌細胞的醫(yī)源性擴散、種植及術(shù)后復(fù)發(fā)有

20、重要的臨床意義；同時通過基因蛋白表達和AI的檢測，可大致了解所應(yīng)用的化療方案是否有效，通過進一步的研究有可能在抗腫瘤藥物敏感試驗上尋找到一條捷徑，可望成為腫瘤個體化治療的一個手段；與術(shù)前介入化療相比，IAIC給藥方便，操作簡單，易于臨床推廣應(yīng)用，可望成為進展期胃癌多模式治療的重要組成部分；本研究樣本量小，有待大宗病例進一步的前瞻性研究證實?！緟⒖嘉墨I】 1 季加孚.胃癌外科的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢J.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2006，l3(l):1-3. 2 Kobayashi M, Yamamoto H, Sugimoto T, et al. Intraoperative local infusio

21、n chemotherapy (ILIC) for gastric cancerJ. Gan To Kagaku Ryoho, 1998,25(9):1281-1283.3 Cheong JH, Shen JY, Song CS, et al. Early postoperative intraperitoneal chemotherapy following cytoreductive surgery in patients with very advanced gastric cancerJ. Ann Surg Oncol, 2007,14(1):61-68.4 Yasuhiro K, M

22、ichitaka F, Masahiko K, et al. Chemotherapy as a component of multimodal therapy for gastric carcinomaJ. World J Gastroenterol, 2006,12(13):2000.5 Samalin E, Ychou M. Neoadjuvant treatment in upper gastrointestinal adenocarcinomas: new paradigms from old conceptsJ. Curr Opin Oncol, 2007,19(4):384-38

23、9.6 Kobayashi M, Yamamoto H, Sugimoto T, et al. Intraoperative local infusin chemotherapy（ILIC） for gastric cancerJ. Gan to Kagaku Ryoho, 1998，25（9）：1281-1283.7 徐圣德，高斌，文剛等.術(shù)前動脈化學(xué)治療對進展期胃癌細胞凋亡和增殖的影響J.介入放射學(xué)雜志，2007，16(5)353-356.8 Araki K, Yamamoto H, Kobayashi M. Experimental and clinical study on intra

24、operative local infusion chemotherapy (ILIC) for advanced gastric carcinomaJ. Gan To Kagaku Ryoho, 1995,22(11):1531-1534.9 吳鵬，朱正綱，葉正寶，等.5-氟尿嘧啶-2-脫氧核苷經(jīng)胃左動脈介入灌注后的藥代動力學(xué)實驗研究J.外科理論與實踐，2004，9(2):135-139.10 張瑞奎，李忠，石瑩，等.胃癌肝轉(zhuǎn)移的治療與研究J.武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，13(2):148-150.11 高登鵬，張霄成，石秀玲，等.胃癌術(shù)中術(shù)后局部化療對癌細胞及患者預(yù)后的影響J.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合

25、雜志，2005，14(19)：2535-2437.12 Soini Y，Virkajarul N, Lehto VP, et al. Hepatocelluar carcinomas with a high prohferation index and a tow degree 0f apoptosis and necrosts are assoeated with a shorteoed SurvivalJ. Cancer, 1996,73(9):1025.13 Waki T，Tamura G，Sato M，et al .Promoter methylation status 0f DAP-kinase and RUNX3 genes in neoplastic and non