心先安對缺血預(yù)處理心肌細(xì)胞組織中p53蛋白表達(dá)的影響

1、心先安對缺血預(yù)處理心肌細(xì)胞組織中p53蛋白表達(dá)的影響 作者：吳若嵐 張端蓮 喻小紅【摘要】 目的：觀察心先安對缺血預(yù)處理心肌細(xì)胞組織中p53蛋白表達(dá)的影響，探討心先安對缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。方法:將35只SD大鼠隨機(jī)分成4組:正常對照組（n=5）、假手術(shù)組（n=10）、缺血再灌注損傷組（n=10）、心先安預(yù)處理組（n=10），建立在體心肌缺血再灌注動物模型。實驗完畢后，將各組動物心肌組織做免疫組織化學(xué)染色，觀察各組動物心肌細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)的變化。利用HPIAS-1000圖文報告管理系統(tǒng)對p53抗原的表達(dá)進(jìn)行定量分析，測定各組中p53蛋白表達(dá)的平均光密度和平均陽性面積率。結(jié)果：正

2、常對照組心肌細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)呈陰性，心先安預(yù)處理組心肌細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)呈陰性；假手術(shù)組心肌細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)呈陰性，缺血再灌注損傷組p53蛋白表達(dá)呈陽性。圖像分析結(jié)果顯示，正常對照組、心先安預(yù)處理組、假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間p53蛋白的平均光密度和陽性面積率的差異有顯著性意義（P<0.01）; 正常對照組與假手術(shù)組之間、心先安預(yù)處理組與假手術(shù)組之間p53蛋白的平均光密度和陽性面積率的差異無顯著性意義（P>0.05）。結(jié)論：心先安注射液預(yù)處理對大鼠缺血再灌注損傷心肌具有保護(hù)作用。 1 / 16【關(guān)鍵詞】 心先安 缺血再灌注 心肌 p53蛋白隨著社會老齡

3、化和心血管疾病的高發(fā)，圍術(shù)期惡性心血管意外已成為威脅手術(shù)病人生命的第一殺手，也嚴(yán)重影響了麻醉醫(yī)生的工作安全。如何預(yù)防圍術(shù)期惡性心血管意外以及如何減輕缺血事件發(fā)生后心肌細(xì)胞的損傷，成為臨床醫(yī)生關(guān)心的焦點(diǎn)。心先安（即環(huán)磷腺苷葡胺注射液）是環(huán)化腺苷酸（cAMP）的衍生物，參與心肌細(xì)胞的能量代謝，提供外源性cAMP，對維持心肌細(xì)胞氧耗的供需平衡有積極意義，目前研究表明心先安預(yù)處理可減少缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的凋亡，具有一定保護(hù)意義。 p53基因為一抑癌基因，目前研究表明p53基因與細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系，觀察心肌細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的表達(dá)可以了解細(xì)胞受損程度。 本實驗采用免疫組織化學(xué)方法觀察了心先安對缺血再

4、灌注損傷心肌的保護(hù)作用，為缺血再灌注損傷心肌的治療提供實驗依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料 選用健康雄性Wistar大鼠（SPF級）35只,體重250300g左右。腹腔注射戊巴比妥鈉4.5 mg·(100 g)-1 ,麻醉動物后行氣管切開接微型呼吸機(jī)人工呼吸呼吸頻率60 次·min-1 ,潮氣量2ml·(100g)-1,沿胸骨左緣第4肋骨開胸在左心室、右心室與左心房交界處結(jié)扎/ 開放左冠狀動脈前降支建立心肌缺血再灌注模型。將動物隨機(jī)分成四組: 正常對照組（不做任何處理）；假手術(shù)組（絲線穿過冠狀動脈前降支但不結(jié)扎）；缺血再灌注損傷組(IR)（ 缺血/ 再灌注前靜脈注

5、射生理鹽水0.8ml / kg，結(jié)扎左冠狀動脈前降支45min ,再灌注120 min ）；心先安注射液預(yù)處理組（在結(jié)扎前20min，靜脈注射心先安注射液0.8ml/kg , 其它處理同缺血/ 再灌注組）。1.2 主要試劑 心先安注射液（環(huán)磷腺苷葡胺注射液），江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份公司。即用型兔抗鼠p53單克隆抗、 即用型S-P通用型免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸，以上試劑均購于北京中山生物技術(shù)有限公司。1.3 方法1.3.1 常規(guī)HE染色1.3.2 免疫組織化學(xué)S-P法檢測p53相關(guān)抗原 5m組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫處理10 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，p53

6、均采用高壓抗原修復(fù)，正常羊血清處理10 min以減少非特異性背景，一抗4孵育過夜，生物素標(biāo)記的二抗處理10 min，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物處理10min，DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照組，人乳腺癌作為p53的陽性對照組。1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷 p53以細(xì)胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)對p53抗原的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個高倍鏡視野(×400)，測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度

7、、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和q 檢驗，檢驗水準(zhǔn)為0.05。2 結(jié)果2.1 HE染色 正常對照組：可見心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，細(xì)胞界限清晰，結(jié)構(gòu)正常；假手術(shù)組：可見心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，但可見部分胞漿溶解，結(jié)構(gòu)基本上正常；缺血再灌注損傷組：可見心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，胞漿溶解呈空泡或網(wǎng)狀，細(xì)胞界限模糊，可見心肌細(xì)胞斷裂；心先安預(yù)處理組：可見心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，細(xì)胞核呈橢圓形位于中央

8、，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常。2.2 p53的表達(dá) 正常對照組：心肌細(xì)胞內(nèi)無棕黃色顆粒沉積，p53表達(dá)極弱或無表達(dá)；假手術(shù)組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見極少量的棕黃色顆粒，p53表達(dá)極弱；缺血再灌注損傷組：心肌細(xì)胞內(nèi)有較多棕黃色顆粒，p53表達(dá)強(qiáng)；心先安預(yù)處理組：心肌細(xì)胞內(nèi)無棕黃色顆粒沉積，p53表達(dá)極弱或無表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示，正常對照組 p53蛋白表達(dá)的平均光密度為1.357±0.051，假手術(shù)組 p53蛋白表達(dá)的平均光密度為1.295±0.068，缺血再灌注損傷組 p53蛋白表達(dá)的平均光密度為4.683±0.562；心先安預(yù)處理組p53蛋白表達(dá)的表達(dá)的平均光密度為1.309&#

9、177;0.03；正常對照組 p53蛋白表達(dá)的陽性面積率為0.192±0.028，假手術(shù)組 p53蛋白表達(dá)的陽性面積率為0.173±0.027，缺血再灌注損傷組 p53蛋白表達(dá)的陽性面積率為0.482±0.157；心先安預(yù)處理組p53蛋白表達(dá)的表達(dá)的陽性面積率為0.187±0.024。經(jīng)單因素方差分析，各組間的差異有顯著性意義(P0.05)。經(jīng)q檢驗，正常對照組、心先安預(yù)處理組、 假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間p53蛋白的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；正常對照組與假手術(shù)組之間、心先安預(yù)處理組與假手術(shù)組之間平均光密

10、度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0 05)。見表1。表1 心先安注射液預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷后各組p53蛋白表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（略）注：* 正常對照組、假手術(shù)組、心先安預(yù)處理組與缺血再灌注損傷組比較，P0.001；# 心先安預(yù)處理組、假手術(shù)組與正常對照組比較，P0.05。3 討論 隨著人口老齡化和缺血性心臟疾患的高發(fā)，如何保證缺血性心臟病患者以及有潛在缺血性心臟病風(fēng)險的患者的圍術(shù)期安全，降低惡性心血管事件的發(fā)生，提高麻醉安全，已成為臨床醫(yī)生關(guān)心的焦點(diǎn)。 合并心血管疾病的手術(shù)病人,圍術(shù)期發(fā)生缺血再灌注損傷的機(jī)率較高,可能與多種因素有關(guān),總的來說有3點(diǎn):即能量

11、代謝失常、氧自由基生成和鈣超載。缺血再灌注損傷發(fā)生（MIR）后, 返回的氧產(chǎn)生大量氧自由基(OFP),可損傷心肌細(xì)胞膜，改變膜通透性、離子泵和離子通道, 增加Ca2+ 內(nèi)流,使局部心肌細(xì)胞的心電不穩(wěn)定性增加。心肌缺血時,除OFP聚集增多外, 無氧代謝產(chǎn)物乳酸也大量堆積, 再灌注的沖刷作用使之逸出,直接損傷心肌細(xì)胞膜, Ca2+ 、Na+ 內(nèi)流,使心肌細(xì)胞復(fù)極離散,導(dǎo)致心肌細(xì)胞的動作電位2相折返,易觸發(fā)惡性心律失常1。研究表明,MIR時,細(xì)胞漿、細(xì)胞核Ca2+含量均顯著升高, 且細(xì)胞核鈣超載是其心肌細(xì)胞凋亡的主要促發(fā)因素2。因此,最大限度地減少損傷、保護(hù)再灌注心肌就是降低圍術(shù)期惡性心血管事件發(fā)生

12、的關(guān)鍵。 研究表明,MIR后可出現(xiàn)心肌頓抑現(xiàn)象, 即短時間的心肌缺血尚不足以造成心肌壞死, 但再灌注后恢復(fù)正?；蚪咏９┭? 其機(jī)械功能障礙卻需數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周才能完全恢復(fù)3。心肌頓抑可使ATP消耗明顯減少。腺苷是ATP的分解產(chǎn)物, 其與心肌細(xì)胞膜上的腺苷受體結(jié)合, 通過興奮型C蛋白中介, 激活細(xì)胞膜上的腺苷酸環(huán)化酶, 生成cAMP。cAM P作為第二信使, 使無活性的蛋白激酶激活,催化多種蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化反應(yīng),引起靶細(xì)胞各種生理生化反應(yīng), 如擴(kuò)張冠脈, 抑制內(nèi)皮素釋放, 升高心肌細(xì)胞錳超氧化物歧化酶(Mn2SOD)含量,抗氧化,降低心肌細(xì)胞Na+ 、Ca2+含量等, 從而發(fā)揮心肌保護(hù)作

13、用4。 心先安（MAC）是cAMP的衍生物。本實驗發(fā)現(xiàn), 增加外源性cAMP, 既有助于維持心肌氧耗平衡，又可發(fā)揮cAMP的心肌保護(hù)作用, 對抗再灌注對Ca2+內(nèi)流等所致的心肌細(xì)胞膜損傷, 改善其電生理功能, 使恢復(fù)生理功能的心肌細(xì)胞與鄰近的正常心肌細(xì)胞復(fù)極不一致性減少, 再灌注后心肌Q T離散度明顯下降, 提示可以降低惡性心律失常的發(fā)生5。 研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。而細(xì)胞凋亡與心肌受損程度以及受損心肌的重塑有直接的因果關(guān)系。細(xì)胞凋亡(apoptosis)是細(xì)胞死亡形式之一,是有核細(xì)胞在一定條件下啟動其自身內(nèi)部機(jī)制,通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生自然死亡的過程。

14、細(xì)胞凋亡的一個顯著特征即受基因調(diào)控,心肌缺血/ 再灌注損傷時細(xì)胞凋亡也同樣受基因調(diào)控。近年來人們發(fā)現(xiàn)p53與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。正常的p53基因即野生型p53 基因(wt2p53)與突變型p53 基因(mt-p53) 均參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。野生型p53基因能誘導(dǎo)白細(xì)胞的凋亡,突變型p53則抑制細(xì)胞凋亡。齊麗彤等6應(yīng)用Wistar大鼠結(jié)扎左冠狀動脈45min再灌注4h ,觀察到缺血-再灌注過程中心肌細(xì)胞p53 表達(dá)增加。Kirshenbaum 等研究心肌細(xì)胞凋亡的分子調(diào)節(jié)機(jī)制,結(jié)果證實p53基因為心肌細(xì)胞凋亡的激活因子,并且指導(dǎo)促凋亡基因Bax 的轉(zhuǎn)錄。 我們的實驗結(jié)果顯示,正常對照組、假手術(shù)組

15、及心先安治療組的p53表達(dá)極弱或陰性表達(dá),缺血再灌注損傷組p53表達(dá)呈強(qiáng)陽性，證明p53基因過度表達(dá)能促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。本研究中, p53在缺血再灌注損傷組表達(dá)增加,因此可以認(rèn)為p53的過度表達(dá)是心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。而心先安預(yù)處理組p53表達(dá)極弱或陰性表達(dá),說明心先安注射液具有明顯改善心肌氧供和預(yù)防缺血再灌注心肌細(xì)胞損傷的作用,與改善微循環(huán)、減少鈣超載、抗氧化自由基損傷有關(guān)。缺血再灌注損傷的機(jī)制很復(fù)雜，尚未完全闡明，已證實與多個因素相關(guān)，如氧自由基、鈣離子超載、細(xì)胞因子的釋放等等。通過對這些因素的干預(yù)，必定可以減輕缺血再灌注心肌的損傷，降低惡性心血管事件的發(fā)生。 從以上的實驗結(jié)果和討論來分

16、析心先安注射液的應(yīng)用為防治缺血再灌注損傷具有積極意義,并為加強(qiáng)缺血后心肌保護(hù)作用提供重要的理論依據(jù)。對合并缺血性心血管疾患或有潛在風(fēng)險的手術(shù)病人，早期合理應(yīng)用心先安，可降低圍術(shù)期惡性心血管事件的發(fā)生，并對發(fā)生了缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，減少心肌細(xì)胞的凋亡，降低缺血后心肌的重塑，具有重要的積極作用。【參考文獻(xiàn)】 1 張開滋, 吾柏銘, 唐其柱, 等.臨床心律失常.長沙: 湖南科學(xué)技術(shù)出版社, 2001, 119123.2 張紅, 司良毅, 周紅, 等. 大鼠心肌缺血再灌注時心肌細(xì)胞核1, 3,4, 5- 四磷酸肌醇受體的結(jié)合特性改變. 中華心血管病雜志,2005,33 (2) : 161165.3 施佳, 金惠根, 陳萬春, 等.早期補(bǔ)鎂對心肌梗死再灌注時心肌頓抑的影響.國外醫(yī)學(xué).心血管疾病分冊, 2004,3