以磷酸二酯酶為主要靶點的阿魏酸抗阿爾茲海默病作用機制研究

1、以磷酸二酯酶為主要靶點的阿魏酸抗阿爾茲海默病作用機制研 究越來越多證據(jù)表明，磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE )在學(xué)習(xí)和記憶過 程中發(fā)揮了很大作用,其相應(yīng)的抑制劑能通過調(diào)控細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺甘(cyclic adenosine monophosphate,c AMP )含量來改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病所致的 學(xué)習(xí)記憶障礙。因此尋找特異性PDEffl制劑是目前國內(nèi)外各大藥理實驗室的研究 熱點。我們近期的實驗結(jié)果顯示，阿魏酸(ferulic acid,FA )能調(diào)節(jié)PDE的表達及 活性，從而影響生物體的各種代謝。但是FA是如何對PDB!行調(diào)控以及面對PDE 這樣一個龐大的超家族,

2、FA是針對其中某一種亞型發(fā)揮特異性調(diào)節(jié)作用還是發(fā) 揮非特異性PDE調(diào)節(jié)作用并不明確。本項目通過現(xiàn)代分子生物學(xué)手段明確 FA對PDE1型表達有抑制作用，并對其 下游信號通路具有調(diào)節(jié)作用，并在整體動物學(xué)實驗上驗證FA抗阿爾茨海默病(Alzheimer ' s disease,AD )樣炎癥作用與其對PDE的表達抑制作用密切相關(guān)。 這些工作將不僅為AD的特異性靶向治療提供安全有效的天然藥物，同時也為FA 的藥理作用及機制深入研究提供理論支撐。本課題展開了相關(guān)的研究工作，包括以下四個部分。第一，運用分子對接的方 法模擬FA與PD4B2勺相互作用。分子對接結(jié)果表明,FA可與包括Tyr233、Hi

3、s234、Met347、Asn395 Phe414 Gln443、和Phe446在內(nèi)的氨基酸殘基發(fā)生強烈的相互作用，數(shù)據(jù)還表明，F(xiàn)A可進 入PDE4B2勺結(jié)合腔,并與氨基酸殘基 Phe446和Phe414形成兀sup：t /sup相 互作用。在FA與氨基酸殘基Gln443和His234之間可發(fā)現(xiàn)有氫鍵。FA的構(gòu)象位于疏水腔區(qū)域,表明FA與PDE4B2間存在靜電和疏水性相互作用。分子對接結(jié)果從理論上支持了 FA對PDE4鼬活性及表達的潛在影響，表明 FA可被用作基本結(jié)構(gòu)來設(shè)計 PDE4W制劑，應(yīng)進行進一步的研究來證實該相互作 用。第二,體外研究FA對A B <sub>25-35<

4、;/sub>和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS )所致PC12細胞損傷的保護作用。檢測了超氧化物 歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性，炎性因子(TNF-a 和 IL-1 0 )的表 達;檢測與抗AD作用密切相關(guān)c AMP和Ca²⁺&度；另外，檢測FA對 神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF )對PC12細胞分化的促進作用。實驗結(jié)果表明FA能顯著降低A0 _25-35和LPS所致TNF-a和 IL-1 B水平的升高，同時升

5、高SOD勺表達水平,從而驗證了其強大的抗炎和抗氧 化功能。FA能夠抑制LPS所引起的c AM冰平的降低；通過激光共聚焦技術(shù)檢測 細胞內(nèi)Ca<sup>2+</sup澈度的變化，發(fā)現(xiàn)FA能夠有效降低LPS所弓I起的PC12 細胞內(nèi)Ca<sup>2+</sup澈度的升高;FA與NGFW?育，增強NGFW導(dǎo)PC12細胞 的分化作用。初步推測FA有可能對PDEg達具潛在抑制作用。第三,PDE4B可調(diào)節(jié)細胞內(nèi) c AMPzK平和 c AMP/c AMFS答元件結(jié)合蛋白(c AMPresponse element binding protein,CREB )通路。進一步研

6、究FA對LPS誘導(dǎo)PC12細胞磷酸二酯酶4B (PDE4B上調(diào)表達及活 性的影響，使用激光共聚焦顯微鏡檢測FA對LPS誘導(dǎo)PC12ffi胞骨架蛋白F-actin 變化的影響。我們進一步檢測 FA對LPS誘導(dǎo)的c AMP特異性PDE活性和細胞炎 性因子(TNF-a和IL-1 B )及ROS生的影響；通過實時熒光定量 RT-PCR(real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,Q-PCR )檢測 LPS誘導(dǎo) PC12a月fi PDE4Bm RNAft達；通過免疫印 跡對PDE4B

7、 CREEft磷酸化CREB(p CREB的蛋白表達進行檢測。FA對LPS所致PC12Mlfi F肌動蛋白(F-actin )骨架的損傷具有保護作用， 明顯改善細胞骨架蛋白F-actin的分布和結(jié)構(gòu)。顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-a、 IL-1 B 及活性氧(reactive oxygen species,ROS )的產(chǎn)生。酶活性試驗表明，F(xiàn)A可明顯減弱LPS誘導(dǎo)PC12ffi月fi c AMP依賴性PDEW活 性的上調(diào)。對PC12細胞PDE4B m RN的研究表明，F(xiàn)A預(yù)處理可減少由LPS誘導(dǎo) 的PDE4B m RNA!達上調(diào)。免疫印跡表明，F(xiàn)A預(yù)處理后，抑制LPS誘導(dǎo)的PDE4B1調(diào)彳用；對

8、抗LPS誘導(dǎo) 的CRE斯p CREB下調(diào)作用。FA對LPS誘導(dǎo)的PDE4限達上調(diào)的抑制作用及其 對下游信號分子CRE序口 p CRE法達下調(diào)的對抗作用可能是其對神經(jīng)炎癥性疾病 比如AD樣神經(jīng)炎癥具有治療作用的一個機制。第四，檢測FA對LPS誘導(dǎo)Sprague-Dawley (SD大鼠學(xué)習(xí)和記憶缺失的保 護作用；探討FA對LPS誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細胞損傷的保護作用及機制 ？在本研究 中,Morris水迷宮試驗檢測FA對抗LPS誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)和記憶缺失作用，蘇木精 -伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE )檢測FA對LPS損傷大鼠大腦皮 層和海馬神經(jīng)元的組織病理學(xué)保護作用

9、 ？免疫熒光法檢測FAXt LP%傷海馬神經(jīng) 元細胞骨架蛋白B-tubulin 的保護作用？為闡明FA對LPS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的 保護作用，檢測SOD舌性;Q-PCR檢測FA抗LPS誘導(dǎo)的IL-1 B ?caspase-1?Nod樣 受體蛋白 3 (Nod like receptor protein,NLRP3 )和 PDE4B勺 m RNAg達彳乍用； 免疫印跡法檢測PDE4B NLRP3f口 CRE強p CREEg白的表達？免疫組織化學(xué)染色 法檢測FA對LPS誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元CA1?CA»口 CA3區(qū)PDE4E®白表達的影響？Morris水迷宮試驗表明FA預(yù)處理對抗L

10、PS誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙;HE 染色顯示，預(yù)先給予不同劑量FA可以減輕腹腔注射LPS誘導(dǎo)的SD大鼠海馬神經(jīng) 元損傷；與LPS組相比,FA預(yù)處理組大鼠海馬神經(jīng)元B -tubulin 蛋白表達增加;FA 預(yù)處理顯著維持大鼠大腦皮層和海馬神經(jīng)元中被LPS抑制的SOD勺活性;FA預(yù)處理顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1 B ?capase-1?NLRP邵口 PDE4國勺m RNAK平的增 加？Western蛋白印跡分析表明，相較于LPS組,FA預(yù)處理組的CREEK p-CREB的 表達增加，同時抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元中PDE4前NLRP3勺表達；免疫組 化染色結(jié)果顯示，F(xiàn)A預(yù)處理顯著抑制了 LPS誘導(dǎo)