營養(yǎng)缺陷型菌株篩選

1、營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選采用輻射，化學試劑等因素處理細菌，以提高其變異幾率，關鍵步驟是進行營養(yǎng)缺陷型微生物的篩選工作，營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變產生的，由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產物的培養(yǎng)基中才能生長的突變株。營養(yǎng)缺陷型的篩選與鑒定涉及下列幾種培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基（MM，符號為-）是指僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基(CM，符號為+)是指可滿足某種微生物的一切營養(yǎng)缺陷型菌株的營養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。補充培養(yǎng)基（SM，符號為A或B等）是指在基本培養(yǎng)基中添加某種營養(yǎng)物質以滿足該營養(yǎng)物質缺陷型菌株生長需求的合成或半合成培養(yǎng)基。 營養(yǎng)缺陷

2、型菌株不僅在生產中可直接作發(fā)酵生產核苷酸、氨基酸等中間產物的生產菌，而且在科學實驗中也是研究代謝途徑的好材料和研究雜交、轉化、轉導、原生質融合等遺傳規(guī)律必不可少的遺傳標記菌種。營養(yǎng)缺陷型的篩選一般要經過誘變、淘汰野生型、檢出和鑒定營養(yǎng)缺陷型四個環(huán)節(jié)?，F(xiàn)分述如下：第一步，誘變劑處理：與上述一般誘變處理相同。第二步，淘汰野生型：在誘變后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷型的比例一般較低。通過以下的抗生素法或菌絲過濾法就可淘汰為數眾多的野生型菌株即濃縮了營養(yǎng)缺陷型?？股胤?有青霉素法和制霉菌素法等數種。青霉素法適用于細菌，青霉素能抑制細菌細胞壁的生物合成，殺死正在繁殖的野生型細菌，但無法殺死正處于休止狀態(tài)的營

3、養(yǎng)缺陷型細菌。制霉菌素法則適合于真菌，制霉菌素可與真菌細胞膜上的甾醇作用，從而引起膜的損傷，也是只能殺死生長繁殖著的酵母菌或霉菌。在基本培養(yǎng)基中加入抗生素，野生型生長被殺死，營養(yǎng)缺陷型不能在基本培養(yǎng)基中生長而被保留下來。菌絲過濾法 適用于進行絲狀生長的真菌和放線菌。其原理是：在基本培養(yǎng)基中，野生型菌株的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型的孢子則不能。通過過濾就可除去大部分野生型，保留下營養(yǎng)缺陷型。第三步，檢出缺陷型：具體方法很多。用一個培養(yǎng)皿即可檢出的，有夾層培養(yǎng)法和限量補充培養(yǎng)法；在不同培養(yǎng)皿上分別進行對照和檢出的，有逐個檢出法和影印接種法?？筛鶕嶒炓蠛蛯嶒炇揖唧w條件加以選用?，F(xiàn)分別介紹如下

4、：夾層培養(yǎng)法 先在培養(yǎng)皿底部倒一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，待凝，添加一層混有經誘變劑處理菌液的基本培養(yǎng)基，其上再澆一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，經培養(yǎng)后，對首次出現(xiàn)的菌落用記號筆一一標在皿底。然后再加一層完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)后新出現(xiàn)的小菌落多數都是營養(yǎng)缺陷型突變株。限量補充培養(yǎng)法 把誘變處理后的細胞接種在含有微量（0.01%）蛋白胨的基本培養(yǎng)基平板上，野生型細胞就迅速長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型則緩慢生長成小菌落。若需獲得某一特定營養(yǎng)缺陷型，可再在基本培養(yǎng)基中加入微量的相應物質。逐個檢出法 把經誘變處理的細胞群涂布在完全培養(yǎng)基的瓊脂平板上，待長成單個菌落后，用接種針或滅過菌的牙簽把這些單個菌落逐個整齊地

5、分別接種到基本培養(yǎng)基平板和另一完全培養(yǎng)基平板上，使兩個平板上的菌落位置嚴格對應。經培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基平板的某一部位上長出菌落，而在基本培養(yǎng)基的相應位置上卻不長，說明此乃營養(yǎng)缺陷型。影印平板法 將誘變劑處理后的細胞群涂布在一完全培養(yǎng)基平板上，經培養(yǎng)長出許多菌落。用特殊工具“印章”把此平板上的全部菌落轉印到另一基本培養(yǎng)基平板上。經培養(yǎng)后，比較前后兩個平板上長出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)在前一培養(yǎng)基平板上的某一部位長有菌落，而在后一平板上的相應部位卻呈空白，說明這就是一個營養(yǎng)缺陷型突變株。第四步，鑒定缺陷型：可借生長譜法進行。生長譜法是指在混有供試菌的平板表面點加微量營養(yǎng)物，視某營養(yǎng)物的周圍有否長菌來確

6、定該供試菌的營養(yǎng)要求的一種快速、直觀的方法。用此法鑒定營養(yǎng)缺陷型的操作是：把生長在完全培養(yǎng)液里的營養(yǎng)缺陷型細胞經離心和無菌水清洗后，配成適當濃度的懸液（如107108個ml），取0.1ml與基本培養(yǎng)基均勻混合后，傾注在培養(yǎng)皿內，待凝固、表面干燥后，在皿背劃幾個區(qū)，然后在平板上按區(qū)加上微量待鑒定缺陷型所需的營養(yǎng)物粉末（用濾紙片法也可），例如氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶堿基等。經培養(yǎng)后，如發(fā)現(xiàn)某一營養(yǎng)物的周圍有生長圈，就說明此菌就是該營養(yǎng)物的缺陷型突變株。用類似方法還可測定雙重或多重營養(yǎng)缺陷型。 工業(yè)微生物菌種的選育營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選來源：青島海博 關于菌株的幾個概念：野生型菌株：從自然界分離到的

7、微生物在其發(fā)生突變前的原始狀態(tài)。營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經過人工誘變或自然突變失去合成某種營養(yǎng)的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補充所缺乏的營養(yǎng)因子才能生長。原養(yǎng)型：營養(yǎng)缺陷型菌株經回復突變或重組后產生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上和野生型相同 關于培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基（minimal medium，MM）：僅能滿足微生物野生型菌株生長需要的培養(yǎng)基，用來表示。完全培養(yǎng)基（complete medium，CM）：凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基。用來表示。補充培養(yǎng)基（supplemental medium，SM）：凡只能滿足相應的營養(yǎng)缺陷型生長需要的組全培養(yǎng)基，它是在基本培養(yǎng)基中加入該菌株

8、不能合成的營養(yǎng)因子而組成。 （一）、營養(yǎng)缺陷型菌株的分離和篩選一般經誘變后，再經中間培養(yǎng)、淘汰野生型、檢出營養(yǎng)缺陷型、確定生長譜等。1、營養(yǎng)缺陷型的誘發(fā) 營養(yǎng)缺陷型的誘變方法和誘變因子與普通誘變育種基本相同。2、淘汰野生型 在誘變后的存活菌體中營養(yǎng)缺陷型菌株的數量很少，一般僅占存活菌體的百分之幾或千分之幾，而野生型細胞卻大量存在，因而要采取一些措施，盡量淘汰野生型細胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于檢出。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法等。（1）抗生素法：細菌用青霉素法：細菌細胞壁的主要成分為肽聚糖，而青霉素能抑制細胞壁肽聚糖鏈之間的交鏈，阻止合成完整的細胞壁。處

9、在生長繁殖過程的細菌對青霉素十分敏感，因而被抑制或殺死，但不能抑制或殺死處休止狀態(tài)的細菌。將誘變處理后的菌懸液分離加有抗生素的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后野生型細胞由于正常生長繁殖而被殺死，營養(yǎng)缺陷型細胞因不能生長而被保留下來，達到富集目的。酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌細胞膜上的甾醇，引起細胞膜的損傷，殺死生長繁殖過程的真菌，起到富集營養(yǎng)缺陷型的作用。（2）菌絲過濾法 真菌和放線菌等絲狀菌的野生型孢子在基本培養(yǎng)基中能萌發(fā)長成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型的孢子則不能萌發(fā)。把誘變處理后的孢子移入到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)10h左右，使野生型孢子萌發(fā)的菌絲剛剛肉眼可見，用滅菌的脫脂棉、濾紙或玻璃漏斗除去菌絲。繼續(xù)

10、培養(yǎng)，每隔34h過濾一次，重復34次，最大限度地除去野生型細胞。然后稀釋、涂皿分離。（3）高溫殺菌法 利用芽孢桿菌類的芽孢和營養(yǎng)體對熱敏感性的差異，讓誘變后的細菌形成芽孢，然后把處在芽孢階段的細菌移到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一定時間，野生型芽孢萌發(fā)，而營養(yǎng)缺陷型芽孢不能萌發(fā)。此時將培養(yǎng)物加熱到80，維持一定時間，野生型細胞大部分被殺死，缺陷型則得以保留，起到了濃縮作用。3、營養(yǎng)缺陷型的檢出 營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出方法有：點植對照法、夾層平板法、限量營養(yǎng)法和影印接種法等。（1）點植對照法誘變后的孢子或菌體，經富集培養(yǎng)，涂布分離在完全培養(yǎng)基平板進行培養(yǎng)，待菌落孢子成熟后，用滅菌的牙簽或接種針把每個菌落

11、上孢子或菌體分別接到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基平板上的相應位置，同時培養(yǎng)，然后觀察對比菌落生長情況。如果基本培養(yǎng)基上不生長而完全培養(yǎng)基相應位置上生長的菌落，可能為營養(yǎng)缺陷型。挑取孢子或菌體分別移接到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基斜面上，進一步復證。該法可靠性強，但工作量大。（2）影印法經富集后的孢子或菌體分離在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌落成熟（母皿），用滅菌后的特制“絲絨印?！痹谀该笃桨寰渖陷p輕一印，再轉印到方位相同的另一基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基的平板上。培養(yǎng)后觀察比較菌落生長情況，凡是在基本培養(yǎng)基上不生長，而在完全培養(yǎng)基上生長的菌落，分別移接到以上兩種培養(yǎng)基斜面上進一步復證。另外還可采用更簡便的方法，以上印模從

12、母皿中沾上菌體細胞后，僅影印在基本培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后，生長的菌落情況與存放于冰箱的母皿菌落比較即可檢出營養(yǎng)缺陷型。本法適用于細菌、酵母菌，其次對小型菌落的放線菌和霉菌也適用。（3）限量補充培養(yǎng)法如果試驗的目的僅是檢出營養(yǎng)缺陷型菌株，則其該法是將富集培養(yǎng)后的細胞接種到含有0.01%蛋白胨的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，野生型細胞迅速地長成大菌落，在平皿底部作好顏色標記，而生長緩慢的小菌落可能是缺陷型，此稱限量培養(yǎng)。如果試驗的目的是要定向篩選某種特定的缺陷型，則可在基本培養(yǎng)基中加入某種單一的氨基酸、維生素或堿基等物質，稱為補充培養(yǎng)。（4）夾層培養(yǎng)法先在培養(yǎng)皿上倒一薄層基本培養(yǎng)基，凝固后再倒一層經過誘變處

13、理的菌液，其上再澆一層基本培養(yǎng)基；經培養(yǎng)后，對首次出現(xiàn)的菌落用記號筆在皿底標記，然后再倒一層完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)，出現(xiàn)的形態(tài)較小的新菌落，多為缺陷型。4、營養(yǎng)缺陷型的鑒定 （1）營養(yǎng)缺陷型鑒定步驟A、缺陷型類別的測定通常分別用以下物質來代表氨基酸、維生素、核酸堿基：氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸類酵母浸出液，基中氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶均有維生素混合物，代表維生素類核酸堿基混合液，代表嘌呤、嘧啶類。 將待測微生物從斜面上用生理鹽水或緩沖液喬洗下來，離心洗滌，制成濃度為106108ml-1菌懸液，取0.1ml加入到基本培養(yǎng)基中，混勻倒入平皿，制成平板。凝固后，用加圓濾紙分別浸濕沾取

14、以上四類代表物質，覆于平板標定的位置上。培養(yǎng)后，觀察圓濾紙片周圍菌株生長情況，如出現(xiàn)混濁的生長圈，就可初步確定缺陷型所需的生長因子屬于哪一類別，進一步復證。B、缺陷型所需生長因子的測定在同一平皿上測定一種缺陷型菌株對許多種生長因子的需求情況，稱為生長譜法。單一生長因子：鑒定氨基酸或維生素的營養(yǎng)缺陷型，較為簡便的方法是分組測定法。將21種氨基酸，組合6組，每6種不同氨基酸歸為一組。如果以15種維生素進行測定，則把5種維生素歸為一組，共5個組合。組別 氨基酸組合組 1 賴氨酸 精氨酸 蛋氨酸 胱氨酸 亮氨酸 異亮氨酸 2 纈氨酸 精氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸 組氨酸 3 蘇氨酸 蛋氨酸 苯丙氨

15、酸 谷氨酸 脯氨酸 天冬氨酸 4 丙氨酸 胱氨酸 酪氨酸 谷氨酸 甘氨酸 絲氨酸 5 鳥氨酸 亮氨酸 色氨酸 脯氨酸 甘氨酸 谷氨酰胺 6 胍氨酸 異亮氨酸 組氨酸 天冬氨酸 絲氨酸 谷氨酰胺 組別 維生素組合組 1 維生素A 維生素B1 維生素B2 維生素B6 維生素B12 2 維生素C 維生素B1 維生素D2 維生素E 煙酰胺 3 葉酸 維生素B2 維生素D2 膽堿 泛酸鈣 4 對氨基苯甲酸 維生素B6 維生素E 膽堿 肌醇 5 生物素 維生素B12 煙酰胺 泛酸鈣 肌醇 測定方法：缺陷型菌株和基本培養(yǎng)基混合制成平板，把5組或6組生長因子直接加于同一瓊脂平板上，或用濾紙片沾取后覆于瓊脂平板上，培養(yǎng)后，觀察哪一組或哪兩組區(qū)產生混濁生長圈，即可確定該菌株缺陷的生長因子。 如果要測定數十或上百個缺陷型菌株時，則可改成一個平皿中加入一種生長因子，制成平板，在翻轉平皿底部，幾十個方格子，把每株缺陷型按編號移接到瓊脂