營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株篩選

1、營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選采用輻射，化學(xué)試劑等因素處理細(xì)菌，以提高其變異幾率，關(guān)鍵步驟是進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)缺陷型微生物的篩選工作，營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指通過(guò)誘變產(chǎn)生的，由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)的突變株。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選與鑒定涉及下列幾種培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基（MM，符號(hào)為-）是指僅能滿足某微生物的野生型菌株生長(zhǎng)所需的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基(CM，符號(hào)為+)是指可滿足某種微生物的一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的營(yíng)養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM，符號(hào)為A或B等）是指在基本培養(yǎng)基中添加某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以滿足該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺陷型菌株生長(zhǎng)需求的合成或半合成培養(yǎng)基。 營(yíng)養(yǎng)缺陷

2、型菌株不僅在生產(chǎn)中可直接作發(fā)酵生產(chǎn)核苷酸、氨基酸等中間產(chǎn)物的生產(chǎn)菌，而且在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中也是研究代謝途徑的好材料和研究雜交、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)融合等遺傳規(guī)律必不可少的遺傳標(biāo)記菌種。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選一般要經(jīng)過(guò)誘變、淘汰野生型、檢出和鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型四個(gè)環(huán)節(jié)?，F(xiàn)分述如下：第一步，誘變劑處理：與上述一般誘變處理相同。第二步，淘汰野生型：在誘變后的存活個(gè)體中，營(yíng)養(yǎng)缺陷型的比例一般較低。通過(guò)以下的抗生素法或菌絲過(guò)濾法就可淘汰為數(shù)眾多的野生型菌株即濃縮了營(yíng)養(yǎng)缺陷型。抗生素法 有青霉素法和制霉菌素法等數(shù)種。青霉素法適用于細(xì)菌，青霉素能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成，殺死正在繁殖的野生型細(xì)菌，但無(wú)法殺死正處于休止?fàn)顟B(tài)的營(yíng)

3、養(yǎng)缺陷型細(xì)菌。制霉菌素法則適合于真菌，制霉菌素可與真菌細(xì)胞膜上的甾醇作用，從而引起膜的損傷，也是只能殺死生長(zhǎng)繁殖著的酵母菌或霉菌。在基本培養(yǎng)基中加入抗生素，野生型生長(zhǎng)被殺死，營(yíng)養(yǎng)缺陷型不能在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而被保留下來(lái)。菌絲過(guò)濾法 適用于進(jìn)行絲狀生長(zhǎng)的真菌和放線菌。其原理是：在基本培養(yǎng)基中，野生型菌株的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型的孢子則不能。通過(guò)過(guò)濾就可除去大部分野生型，保留下營(yíng)養(yǎng)缺陷型。第三步，檢出缺陷型：具體方法很多。用一個(gè)培養(yǎng)皿即可檢出的，有夾層培養(yǎng)法和限量補(bǔ)充培養(yǎng)法；在不同培養(yǎng)皿上分別進(jìn)行對(duì)照和檢出的，有逐個(gè)檢出法和影印接種法。可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)室具體條件加以選用?，F(xiàn)分別介紹如下

4、：夾層培養(yǎng)法 先在培養(yǎng)皿底部倒一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，待凝，添加一層混有經(jīng)誘變劑處理菌液的基本培養(yǎng)基，其上再澆一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，對(duì)首次出現(xiàn)的菌落用記號(hào)筆一一標(biāo)在皿底。然后再加一層完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)后新出現(xiàn)的小菌落多數(shù)都是營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。限量補(bǔ)充培養(yǎng)法 把誘變處理后的細(xì)胞接種在含有微量（0.01%）蛋白胨的基本培養(yǎng)基平板上，野生型細(xì)胞就迅速長(zhǎng)成較大的菌落，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型則緩慢生長(zhǎng)成小菌落。若需獲得某一特定營(yíng)養(yǎng)缺陷型，可再在基本培養(yǎng)基中加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。逐個(gè)檢出法 把經(jīng)誘變處理的細(xì)胞群涂布在完全培養(yǎng)基的瓊脂平板上，待長(zhǎng)成單個(gè)菌落后，用接種針或滅過(guò)菌的牙簽把這些單個(gè)菌落逐個(gè)整齊地

5、分別接種到基本培養(yǎng)基平板和另一完全培養(yǎng)基平板上，使兩個(gè)平板上的菌落位置嚴(yán)格對(duì)應(yīng)。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基平板的某一部位上長(zhǎng)出菌落，而在基本培養(yǎng)基的相應(yīng)位置上卻不長(zhǎng)，說(shuō)明此乃營(yíng)養(yǎng)缺陷型。影印平板法 將誘變劑處理后的細(xì)胞群涂布在一完全培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)長(zhǎng)出許多菌落。用特殊工具“印章”把此平板上的全部菌落轉(zhuǎn)印到另一基本培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，比較前后兩個(gè)平板上長(zhǎng)出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)在前一培養(yǎng)基平板上的某一部位長(zhǎng)有菌落，而在后一平板上的相應(yīng)部位卻呈空白，說(shuō)明這就是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。第四步，鑒定缺陷型：可借生長(zhǎng)譜法進(jìn)行。生長(zhǎng)譜法是指在混有供試菌的平板表面點(diǎn)加微量營(yíng)養(yǎng)物，視某營(yíng)養(yǎng)物的周圍有否長(zhǎng)菌來(lái)確

6、定該供試菌的營(yíng)養(yǎng)要求的一種快速、直觀的方法。用此法鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型的操作是：把生長(zhǎng)在完全培養(yǎng)液里的營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞經(jīng)離心和無(wú)菌水清洗后，配成適當(dāng)濃度的懸液（如107108個(gè)ml），取0.1ml與基本培養(yǎng)基均勻混合后，傾注在培養(yǎng)皿內(nèi)，待凝固、表面干燥后，在皿背劃幾個(gè)區(qū)，然后在平板上按區(qū)加上微量待鑒定缺陷型所需的營(yíng)養(yǎng)物粉末（用濾紙片法也可），例如氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶堿基等。經(jīng)培養(yǎng)后，如發(fā)現(xiàn)某一營(yíng)養(yǎng)物的周圍有生長(zhǎng)圈，就說(shuō)明此菌就是該營(yíng)養(yǎng)物的缺陷型突變株。用類似方法還可測(cè)定雙重或多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型。 工業(yè)微生物菌種的選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選來(lái)源：青島海博 關(guān)于菌株的幾個(gè)概念：野生型菌株：從自然界分離到的

7、微生物在其發(fā)生突變前的原始狀態(tài)。營(yíng)養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)過(guò)人工誘變或自然突變失去合成某種營(yíng)養(yǎng)的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)充所缺乏的營(yíng)養(yǎng)因子才能生長(zhǎng)。原養(yǎng)型：營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營(yíng)養(yǎng)要求在表型上和野生型相同 關(guān)于培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基（minimal medium，MM）：僅能滿足微生物野生型菌株生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基，用來(lái)表示。完全培養(yǎng)基（complete medium，CM）：凡可滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基。用來(lái)表示。補(bǔ)充培養(yǎng)基（supplemental medium，SM）：凡只能滿足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)需要的組全培養(yǎng)基，它是在基本培養(yǎng)基中加入該菌株

8、不能合成的營(yíng)養(yǎng)因子而組成。 （一）、營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的分離和篩選一般經(jīng)誘變后，再經(jīng)中間培養(yǎng)、淘汰野生型、檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型、確定生長(zhǎng)譜等。1、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的誘發(fā) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的誘變方法和誘變因子與普通誘變育種基本相同。2、淘汰野生型 在誘變后的存活菌體中營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的數(shù)量很少，一般僅占存活菌體的百分之幾或千分之幾，而野生型細(xì)胞卻大量存在，因而要采取一些措施，盡量淘汰野生型細(xì)胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于檢出。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌絲過(guò)濾法、差別殺菌法和饑餓法等。（1）抗生素法：細(xì)菌用青霉素法：細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分為肽聚糖，而青霉素能抑制細(xì)胞壁肽聚糖鏈之間的交鏈，阻止合成完整的細(xì)胞壁。處

9、在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程的細(xì)菌對(duì)青霉素十分敏感，因而被抑制或殺死，但不能抑制或殺死處休止?fàn)顟B(tài)的細(xì)菌。將誘變處理后的菌懸液分離加有抗生素的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后野生型細(xì)胞由于正常生長(zhǎng)繁殖而被殺死，營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞因不能生長(zhǎng)而被保留下來(lái)，達(dá)到富集目的。酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌細(xì)胞膜上的甾醇，引起細(xì)胞膜的損傷，殺死生長(zhǎng)繁殖過(guò)程的真菌，起到富集營(yíng)養(yǎng)缺陷型的作用。（2）菌絲過(guò)濾法 真菌和放線菌等絲狀菌的野生型孢子在基本培養(yǎng)基中能萌發(fā)長(zhǎng)成菌絲，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型的孢子則不能萌發(fā)。把誘變處理后的孢子移入到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)10h左右，使野生型孢子萌發(fā)的菌絲剛剛?cè)庋劭梢?，用滅菌的脫脂棉、濾紙或玻璃漏斗除去菌絲。繼續(xù)

10、培養(yǎng)，每隔34h過(guò)濾一次，重復(fù)34次，最大限度地除去野生型細(xì)胞。然后稀釋、涂皿分離。（3）高溫殺菌法 利用芽孢桿菌類的芽孢和營(yíng)養(yǎng)體對(duì)熱敏感性的差異，讓誘變后的細(xì)菌形成芽孢，然后把處在芽孢階段的細(xì)菌移到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間，野生型芽孢萌發(fā)，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型芽孢不能萌發(fā)。此時(shí)將培養(yǎng)物加熱到80，維持一定時(shí)間，野生型細(xì)胞大部分被殺死，缺陷型則得以保留，起到了濃縮作用。3、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的檢出方法有：點(diǎn)植對(duì)照法、夾層平板法、限量營(yíng)養(yǎng)法和影印接種法等。（1）點(diǎn)植對(duì)照法誘變后的孢子或菌體，經(jīng)富集培養(yǎng)，涂布分離在完全培養(yǎng)基平板進(jìn)行培養(yǎng)，待菌落孢子成熟后，用滅菌的牙簽或接種針把每個(gè)菌落

11、上孢子或菌體分別接到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基平板上的相應(yīng)位置，同時(shí)培養(yǎng)，然后觀察對(duì)比菌落生長(zhǎng)情況。如果基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)而完全培養(yǎng)基相應(yīng)位置上生長(zhǎng)的菌落，可能為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。挑取孢子或菌體分別移接到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基斜面上，進(jìn)一步復(fù)證。該法可靠性強(qiáng)，但工作量大。（2）影印法經(jīng)富集后的孢子或菌體分離在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌落成熟（母皿），用滅菌后的特制“絲絨印?！痹谀该笃桨寰渖陷p輕一印，再轉(zhuǎn)印到方位相同的另一基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基的平板上。培養(yǎng)后觀察比較菌落生長(zhǎng)情況，凡是在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，而在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，分別移接到以上兩種培養(yǎng)基斜面上進(jìn)一步復(fù)證。另外還可采用更簡(jiǎn)便的方法，以上印模從

12、母皿中沾上菌體細(xì)胞后，僅影印在基本培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后，生長(zhǎng)的菌落情況與存放于冰箱的母皿菌落比較即可檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型。本法適用于細(xì)菌、酵母菌，其次對(duì)小型菌落的放線菌和霉菌也適用。（3）限量補(bǔ)充培養(yǎng)法如果試驗(yàn)的目的僅是檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，則其該法是將富集培養(yǎng)后的細(xì)胞接種到含有0.01%蛋白胨的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，野生型細(xì)胞迅速地長(zhǎng)成大菌落，在平皿底部作好顏色標(biāo)記，而生長(zhǎng)緩慢的小菌落可能是缺陷型，此稱限量培養(yǎng)。如果試驗(yàn)的目的是要定向篩選某種特定的缺陷型，則可在基本培養(yǎng)基中加入某種單一的氨基酸、維生素或堿基等物質(zhì)，稱為補(bǔ)充培養(yǎng)。（4）夾層培養(yǎng)法先在培養(yǎng)皿上倒一薄層基本培養(yǎng)基，凝固后再倒一層經(jīng)過(guò)誘變處

13、理的菌液，其上再澆一層基本培養(yǎng)基；經(jīng)培養(yǎng)后，對(duì)首次出現(xiàn)的菌落用記號(hào)筆在皿底標(biāo)記，然后再倒一層完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)，出現(xiàn)的形態(tài)較小的新菌落，多為缺陷型。4、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定 （1）營(yíng)養(yǎng)缺陷型鑒定步驟A、缺陷型類別的測(cè)定通常分別用以下物質(zhì)來(lái)代表氨基酸、維生素、核酸堿基：氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸類酵母浸出液，基中氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶均有維生素混合物，代表維生素類核酸堿基混合液，代表嘌呤、嘧啶類。 將待測(cè)微生物從斜面上用生理鹽水或緩沖液?jiǎn)滔聪聛?lái)，離心洗滌，制成濃度為106108ml-1菌懸液，取0.1ml加入到基本培養(yǎng)基中，混勻倒入平皿，制成平板。凝固后，用加圓濾紙分別浸濕沾取

14、以上四類代表物質(zhì)，覆于平板標(biāo)定的位置上。培養(yǎng)后，觀察圓濾紙片周圍菌株生長(zhǎng)情況，如出現(xiàn)混濁的生長(zhǎng)圈，就可初步確定缺陷型所需的生長(zhǎng)因子屬于哪一類別，進(jìn)一步復(fù)證。B、缺陷型所需生長(zhǎng)因子的測(cè)定在同一平皿上測(cè)定一種缺陷型菌株對(duì)許多種生長(zhǎng)因子的需求情況，稱為生長(zhǎng)譜法。單一生長(zhǎng)因子：鑒定氨基酸或維生素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，較為簡(jiǎn)便的方法是分組測(cè)定法。將21種氨基酸，組合6組，每6種不同氨基酸歸為一組。如果以15種維生素進(jìn)行測(cè)定，則把5種維生素歸為一組，共5個(gè)組合。組別 氨基酸組合組 1 賴氨酸 精氨酸 蛋氨酸 胱氨酸 亮氨酸 異亮氨酸 2 纈氨酸 精氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸 組氨酸 3 蘇氨酸 蛋氨酸 苯丙氨

15、酸 谷氨酸 脯氨酸 天冬氨酸 4 丙氨酸 胱氨酸 酪氨酸 谷氨酸 甘氨酸 絲氨酸 5 鳥氨酸 亮氨酸 色氨酸 脯氨酸 甘氨酸 谷氨酰胺 6 胍氨酸 異亮氨酸 組氨酸 天冬氨酸 絲氨酸 谷氨酰胺 組別 維生素組合組 1 維生素A 維生素B1 維生素B2 維生素B6 維生素B12 2 維生素C 維生素B1 維生素D2 維生素E 煙酰胺 3 葉酸 維生素B2 維生素D2 膽堿 泛酸鈣 4 對(duì)氨基苯甲酸 維生素B6 維生素E 膽堿 肌醇 5 生物素 維生素B12 煙酰胺 泛酸鈣 肌醇 測(cè)定方法：缺陷型菌株和基本培養(yǎng)基混合制成平板，把5組或6組生長(zhǎng)因子直接加于同一瓊脂平板上，或用濾紙片沾取后覆于瓊脂平板上，培養(yǎng)后，觀察哪一組或哪兩組區(qū)產(chǎn)生混濁生長(zhǎng)圈，即可確定該菌株缺陷的生長(zhǎng)因子。 如果要測(cè)定數(shù)十或上百個(gè)缺陷型菌株時(shí)，則可改成一個(gè)平皿中加入一種生長(zhǎng)因子，制成平板，在翻轉(zhuǎn)平皿底部，幾十個(gè)方格子，把每株缺陷型按編號(hào)移接到瓊脂