YY-T 1182-2010 核酸擴(kuò)增檢測用試劑(盒)

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核酸擴(kuò)增檢測用試劑（盒）

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了核酸擴(kuò)增檢測試劑（盒）【以下簡稱“試劑（盒）”】的術(shù)語和定義、命名和分類、技術(shù)要求、試驗(yàn)方法、標(biāo)識(shí)、標(biāo)簽和說明書、包裝、運(yùn)輸和貯存等。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于核酸擴(kuò)增檢測試劑（盒）的質(zhì)量控制。核酸擴(kuò)增檢測試劑（盒）應(yīng)包括核酸提取、核酸擴(kuò)增及產(chǎn)物分析試劑組份，如核酸擴(kuò)增檢測試劑（盒）內(nèi)不含有核酸提取組份，應(yīng)由生產(chǎn)企業(yè)說明或指定提取試劑（盒）。

本標(biāo)準(zhǔn)不適用于基因分型、基因芯片和病毒基因分型/突變檢測用試劑（盒）及血源篩查的試劑（盒）。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T21415-2008體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量的測量校準(zhǔn)品和控制物質(zhì)賦值的計(jì)量學(xué)溯源性

3術(shù)語和定義

以下術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1聚合酶鏈反應(yīng)polymerasechainreaction,PCR

聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)是一種對(duì)特定的DNA或RNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法，由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。

3.2PCR雜交（膜上、板上）PCRhybridization

具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA）可以通過氫鍵的方式，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則相結(jié)合，探針結(jié)合于特定核酸序列或PCR產(chǎn)物的雜交過程可以在液相中進(jìn)行，也可以將其中一個(gè)固定在固相載體上進(jìn)行。

3.3PCR電泳PCRelectrophoresis

根據(jù)PCR產(chǎn)物分子質(zhì)量和所帶電荷的不同在電場中進(jìn)行分離的技術(shù)。

3.4實(shí)時(shí)熒光PCRreal-timepolymerasechainreaction,PCR

在PCR過程中利用熒光染料釋放的熒光定量的變化直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，熒光信號(hào)變量與擴(kuò)增產(chǎn)物變量成正比，并通過對(duì)熒光的采集和分析以達(dá)到對(duì)原始模板量進(jìn)行分析的PCR。

注：在每個(gè)循環(huán)中檢測擴(kuò)增產(chǎn)物是否可被檢測。

3.5測量系統(tǒng)的線性linearityofameasuringsystem

給出的測量結(jié)果與樣品中被測量的值直接成比例的能力。

注1：對(duì)與體外診斷醫(yī)療器械，線性相關(guān)于測量結(jié)果在一給定測量范圍經(jīng)校正或線性化以后的測量示值。

注2：線性通過測量包含被測量已知配方或其間相對(duì)關(guān)系（不必絕對(duì)知道）的樣本來評(píng)估。當(dāng)測量結(jié)果相對(duì)被測量絕對(duì)或相對(duì)數(shù)值作圖時(shí)，所畫曲線對(duì)直線的符合程度及線性度的量度。

3.6樣本線性linearityofseriesdilutedsamples

對(duì)高濃度樣本進(jìn)行系列稀釋，得到的檢測濃度對(duì)數(shù)值與稀釋比例之間相關(guān)。

3.7分析特異性analyticalspecificity

測量程序只測量被測量的能力。

3.8測量精密度precisionofmeasurement

在規(guī)定條件下，相互獨(dú)立的測量結(jié)果間的一致程度。

注1：測量精密度不能用于被測量有關(guān)的數(shù)字值表示，在指定目的下只能以“足夠”或“不足”進(jìn)行描述。

注2：精密度的程度通常與精密度相反的測量不精密度統(tǒng)計(jì)量表示，如標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

注3：給定測量程序的“精密度”可以根據(jù)特定的精密度條件進(jìn)行分類。“重復(fù)性”與基本不變的條件有關(guān)，常稱為“序列內(nèi)精密度”或“批內(nèi)精密度”。“重現(xiàn)性”與條件改變有關(guān)，如：時(shí)間、不同實(shí)驗(yàn)室、操作者和測量系統(tǒng)（包括不同校準(zhǔn)和試劑批號(hào)）。

3.9計(jì)量學(xué)溯源性metrologicaltraceability

通過一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈，使測量結(jié)果或測量標(biāo)準(zhǔn)的值能夠與規(guī)定的參考標(biāo)準(zhǔn)，通常是與國家標(biāo)準(zhǔn)或國際標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)系起來的特性。

注1：通過校準(zhǔn)傳遞方案確定的（參考）測量程序?qū)崿F(xiàn)每一步比較。

注2：溯源性有幾種類型。本標(biāo)準(zhǔn)使用術(shù)語“計(jì)量學(xué)溯源性”。

3.10檢測限detectionlimit,limitofdetection

樣品中以一定概率可被申明與零有差異的被測量的最低值。

注1:也被描述為“最低檢測限”（minimumdetectableconcentration）(或劑量或值)。

注2：有時(shí)被不正確地指作分析靈敏度。

注3：本標(biāo)準(zhǔn)中的最低檢測限為區(qū)別于零的不低于95%可信區(qū)間的最低濃度。

3.11定量限limitofquantitation

給定分析程序能定量檢測分析物的最小濃度或量。

3.12閾值循環(huán)數(shù)Ct（Cp）cyclethreshold,crossingpoint

實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增過程中，反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)周期數(shù)。主要的計(jì)算方式是以擴(kuò)增過程前3到15個(gè)循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，當(dāng)熒光值超過閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)則為閾值循環(huán)數(shù)（Ct）。

3.13基因型genotype

一個(gè)有機(jī)體的遺傳組成，即明確界定具體等位基因位點(diǎn)的基因組。

3.14內(nèi)標(biāo)internalcontrol

在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴(kuò)增的一段非靶序列分子，其目的是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結(jié)果不理想的原因。

4命名和分類

4.1命名

***核酸（DNA或RNA）擴(kuò)增檢測試劑（盒）(方法學(xué))。

4.2分類

可按如下方式分類：

a)根據(jù)核酸擴(kuò)增檢測分析采用的方法學(xué)原理分為：實(shí)時(shí)熒光PCR試劑（盒）、RT-PCR試劑（盒）、PCR雜交檢測試劑（盒）、PCR-電泳法檢測試劑（盒）等。

b)根據(jù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的判定可分為：定量和定性。

5技術(shù)要求

5.1外觀

外觀應(yīng)滿足以下條件：

a)試劑（盒）應(yīng)符合生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定的外觀要求；

b)試劑（盒）應(yīng)組份完全，包裝外觀清潔、無泄漏、無破損；標(biāo)志、標(biāo)簽字跡清楚。

5.2溯源性

生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)根據(jù)GB/T21415-2008及有關(guān)規(guī)定提供所用核酸標(biāo)準(zhǔn)品的來源、溯源的賦值過程和相應(yīng)要求，以及測量不確定度等內(nèi)容。

5.3測量系統(tǒng)的線性

5.3.1樣本線性

線性相關(guān)系數(shù)︱r︱≧0.980。

5.3.2試劑（盒）系列標(biāo)準(zhǔn)品線性

試劑（盒）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)不少于4個(gè)濃度，宜包含線性范圍上限和下限，線性相關(guān)系數(shù)︱r︱≧0.980。

5.4準(zhǔn)確度

5.4.1定性試劑

對(duì)陽性參考品進(jìn)行測定，檢測結(jié)果應(yīng)為陽性。

5.4.2定量試劑

準(zhǔn)確度應(yīng)符合如下要求之一：

a)檢測國家標(biāo)準(zhǔn)品（或參考品）/國際標(biāo)準(zhǔn)品（或參考品），絕對(duì)偏差不超過±0.5個(gè)對(duì)數(shù)數(shù)量級(jí)；

b)回收試驗(yàn)：回收率在85%~115%范圍內(nèi)。

5.5分析特異性

分析特異性應(yīng)滿足以下要求：

a)檢測一定數(shù)量的不含被測物的樣本，結(jié)果應(yīng)為陰性；

b)檢測可能引起非特異反應(yīng)的樣本，如與被測物種屬相近、感染部位相同或感染癥狀相似的其他樣本，結(jié)果應(yīng)為陰性。

5.6亞型檢測能力

檢測生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定試劑檢測范圍內(nèi)國內(nèi)常見亞型，應(yīng)能檢出。

注：只有當(dāng)分析物具有不同亞型時(shí)應(yīng)滿足此項(xiàng)要求。

5.7精密度

5.7.1定性試劑

批內(nèi)精密度應(yīng)符合Ct值的變異系數(shù)（CV,%）≦5%

5.7.2定量試劑

批內(nèi)精密度應(yīng)符合檢測濃度對(duì)數(shù)值的變異系數(shù)（CV,%）≦5%。

5.8檢測限/定量限

5.8.1定性試劑

檢測限應(yīng)符合生產(chǎn)企業(yè)聲稱的值。

5.8.2定量試劑

定量限應(yīng)符合生產(chǎn)企業(yè)聲稱的值。適用時(shí)，檢測限應(yīng)符合生產(chǎn)企業(yè)聲稱的值。

5.9干擾物質(zhì)

對(duì)血液樣本，檢測含有生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定濃度的干擾物質(zhì)如血紅素及其代謝產(chǎn)物、脂血等樣本，及含過量EDTA抗凝劑的樣本，應(yīng)符合生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定的要求。

5.10穩(wěn)定性

可選用以下方法進(jìn)行驗(yàn)證：

a)效期穩(wěn)定性：生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)規(guī)定產(chǎn)品的有效期。取到效期后的樣品檢測測量線性、準(zhǔn)確度、分析特異性、亞型檢測能力、精密度、檢測限/定量限、干擾物質(zhì)，應(yīng)分別符合5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9的要求。

b)熱穩(wěn)定性試驗(yàn)：測量線性、準(zhǔn)確度、分析特異性、亞型檢測能力、精密度、檢測限/定量限、干擾物質(zhì)，應(yīng)分別符合5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9的要求。

注1：熱穩(wěn)定性不能用于推導(dǎo)產(chǎn)品有效期，除非是采用基于大量的穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)建立的推導(dǎo)公式。

注2：根據(jù)產(chǎn)品特性可選擇a),b)方法的任意組合，但所選用方法宜能驗(yàn)證產(chǎn)品的穩(wěn)定性，以保證有效期內(nèi)產(chǎn)品性能符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

6試驗(yàn)方法

6.1外觀

在自然光下目視檢查外觀，結(jié)果應(yīng)符合5.1的要求。

6.2溯源性

生產(chǎn)企業(yè)提供的溯源性資料應(yīng)符合5.2的要求。

6.3測量系統(tǒng)的線性

6.3.1樣本線性

在生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定的線性范圍內(nèi)，取接近線性范圍上限的高值樣本按一定比例（例：5倍或10倍）稀釋為至少5種濃度，其中低值濃度樣本需接近線性范圍的下限。按試劑（盒）說明書進(jìn)行操作，將每一濃度樣本重復(fù)檢測3孔，計(jì)算每一濃度的對(duì)數(shù)值和Ct均值，以濃度的對(duì)數(shù)值為Y，Ct均值為X,進(jìn)行線性擬合，計(jì)算其線性相關(guān)系數(shù)r,結(jié)果應(yīng)符合5.3.1的要求。

6.3.2試劑（盒）系列標(biāo)準(zhǔn)品線性

按試劑（盒）說明書進(jìn)行操作，試劑（盒）中每一標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測3孔，計(jì)算每一標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)示濃度的對(duì)數(shù)值與Ct值的均值，以濃度的對(duì)數(shù)值為Y,Ct均值為X,進(jìn)行線性擬合，計(jì)算其線性相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果應(yīng)符合5.3.2的要求。

6.4準(zhǔn)確度

6.4.1定性試劑

對(duì)陽性參考品進(jìn)行測定，檢測結(jié)果應(yīng)符合5.4.1的要求。

6.4.2定量試劑

建議按如下優(yōu)先順序，采用下列方法之一測試定量試劑（盒）的準(zhǔn)確度，應(yīng)符合5.4.2的要求。

a)絕對(duì)偏差

用試劑盒對(duì)參考物質(zhì)或有證參考物質(zhì)（CRM）和相應(yīng)的參考測量程序按照符合GB/T21415-2008規(guī)定的溯源順序進(jìn)行測試，重復(fù)測定3次，取測試結(jié)果均值（M）,按公式（1）計(jì)算絕對(duì)偏差（B）,結(jié)果應(yīng)符合5.4.2a)的要求。

或用有參考方法定值的高、中、低3個(gè)濃度的樣本（可參照EP6-A的要求適當(dāng)添加被測物，以獲得高濃度的樣品）對(duì)試劑（盒）進(jìn)行測試，每個(gè)濃度樣品重復(fù)測定3次，分別取測試結(jié)果均值，按公式（1）計(jì)算絕對(duì)偏差，結(jié)果應(yīng)符合5.4.2a)的要求。

B=M-T…………..(1)

式中：

B-絕對(duì)偏差；

M-測試結(jié)果均值；

T-參考物質(zhì)標(biāo)示值，或各濃度人血清定值。

b)回收試驗(yàn)

在樣品中加入一定體積標(biāo)準(zhǔn)溶液（標(biāo)準(zhǔn)溶液體積與樣本體積比應(yīng)不大于1:20，或其體積比不會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)的變化，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后樣品總濃度必須在試劑（盒）測定線性范圍內(nèi)），重復(fù)測定3次，取平均值，按公式（2）計(jì)算回收率，結(jié)果應(yīng)符合5.4.2b)的要求。

R=c×(V0+V)-c0×V0×100%………………..(2)

V×cs

式中：

R-回收率；

V-加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積；

V0-樣品的體積

c-樣品加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后的測定濃度

c0-樣品的測定濃度

cs-標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度

6.5分析特異性

檢測可能引起非特異反應(yīng)的樣本，如與被測物種屬相近、感染部位相同或感染癥狀相似的其他樣本，結(jié)果應(yīng)符合5.5的要求。

6.6亞型檢測能力

檢測生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定實(shí)際檢測范圍內(nèi)國內(nèi)常見亞型樣本，樣本個(gè)數(shù)應(yīng)至少一個(gè)亞型有一個(gè)樣本，檢測結(jié)果應(yīng)符合5.6的要求。

6.7精密度

6.7.1定性試劑（盒）

用至少高、低2個(gè)濃度水平的樣本各重復(fù)檢測10次，計(jì)算Ct值變異系數(shù)（CV,%）,結(jié)果應(yīng)符合5.7.1的要求。

6.7.2定量試劑（盒）

用至少高、低2個(gè)濃度水平的樣本各重復(fù)檢測10次，其濃度對(duì)數(shù)值變異系數(shù)（CV,%）應(yīng)符合5.7.2的要求。

6.8檢測限/定量限

6.8.1定性試劑

檢測生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)濃度值的樣本20次，至少17次檢測結(jié)果符合5.8.1要求。

6.8.2定量試劑

檢測生產(chǎn)企業(yè)聲稱濃度值的樣本25次，至少22次檢測結(jié)果符合5.8.2要求。

6.9干擾物質(zhì)

按照生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定的方法進(jìn)行檢測，結(jié)果應(yīng)符合5.9的要求。

6.10穩(wěn)定性

可選用以下方法進(jìn)行驗(yàn)證：

a)效期穩(wěn)定性：取到效期后的樣品進(jìn)行檢測，應(yīng)符合5.10a)的要求。

b)熱穩(wěn)定性試驗(yàn)：取有效期內(nèi)樣品按生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定的方法進(jìn)行檢測，應(yīng)符合5.10b)的要求。

7標(biāo)識(shí)、標(biāo)簽和使用說明書

7.1標(biāo)識(shí)、標(biāo)簽

試劑（盒）外包裝上的標(biāo)識(shí)、標(biāo)簽應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

a)產(chǎn)品名稱、型號(hào)或規(guī)格；

b)生產(chǎn)企業(yè)名稱、地址、聯(lián)系方式；

c)醫(yī)療器械注冊(cè)證書編號(hào)；

d)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)；

e)主要成份；

f)產(chǎn)品用途、適用范圍；

g)貯存方法；

h)生產(chǎn)日期或批號(hào)，有效期限。

7.2使用說明書

試劑（盒）包裝內(nèi)應(yīng)放置使用說明書，使用說明書應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

a)產(chǎn)品名稱、型號(hào)或規(guī)格；

b)生產(chǎn)企業(yè)名稱、地址、聯(lián)系方式及售后服務(wù)單位；

c)《醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)許可證》編號(hào)、醫(yī)療器械注冊(cè)證書編號(hào)；

d)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)；

e)主要成份；

f)產(chǎn)品用途、適用范圍；

g)注意事項(xiàng)；

h)詳細(xì)使用說明；

i)貯存方法；

j)生