分子發(fā)光分析

1、1 第五章第五章 分子發(fā)光分析分子發(fā)光分析定義：激發(fā)態(tài)分子以輻射躍遷形式釋放能量產生分子發(fā)光。分子發(fā)光包括光致發(fā)光的熒光、磷光和化學發(fā)光光譜。2第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法n一、概述一、概述定性、定量的依據(jù)定性、定量的依據(jù)分析分析 方法的特點方法的特點3第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法二、基本原理二、基本原理（一）分子熒光的產生（一）分子熒光的產生 處于分子處于分子基態(tài)基態(tài)單重態(tài)中的電子對，其自旋方單重態(tài)中的電子對，其自旋方向相反，當其中一個電子被激發(fā)時，通常躍遷至第向相反，當其中一個電子被激發(fā)時，通常躍遷至第一一激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)單重態(tài)軌道上，也可能躍遷至能級更高的單重態(tài)軌道上，也可能躍遷

2、至能級更高的單重態(tài)上。這種躍遷是符合光譜選律的，如果躍遷單重態(tài)上。這種躍遷是符合光譜選律的，如果躍遷至第一激發(fā)三重態(tài)軌道上，則屬于禁阻躍遷。單重至第一激發(fā)三重態(tài)軌道上，則屬于禁阻躍遷。單重態(tài)與三重態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向不同。態(tài)與三重態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向不同。4第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷輻射躍遷方式或方式或無輻無輻射躍遷射躍遷方式再回到基態(tài)。方式再回到基態(tài)。輻射躍遷：熒光、磷光的發(fā)射。輻射躍遷：熒光、磷光的發(fā)射。無輻射躍遷：振動弛豫（無輻射躍遷：振動弛豫（VRVR）、）、內轉化（內轉化（icic）、）、體系間竄躍（體系間竄躍（

3、iscisc）等。等。5基態(tài)：電子自旋配對，基態(tài)：電子自旋配對，多重度多重度=2s+1=1，為單為單重態(tài)，以重態(tài)，以S0表示。表示。激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋仍然配對，量，電子自旋仍然配對，為單重態(tài)，稱為激發(fā)單為單重態(tài)，稱為激發(fā)單重態(tài)，以重態(tài)，以S1，S2表示表示激發(fā)三重態(tài)：分子吸收能激發(fā)三重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋不再配對，量，電子自旋不再配對，為三重態(tài)，稱為激發(fā)三為三重態(tài)，稱為激發(fā)三重態(tài)，以重態(tài)，以T1，T2.表示。表示。三重態(tài)能級低于單重態(tài)三重態(tài)能級低于單重態(tài)（Hund規(guī)則）規(guī)則）6第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法振動弛豫振動弛豫: :指在指在同一電子能

4、級同一電子能級中，電子由高中，電子由高振動能級振動能級轉至低振轉至低振動能級，而將多余的能量以動能級，而將多余的能量以非輻射非輻射的形式發(fā)出。發(fā)生振動弛的形式發(fā)出。發(fā)生振動弛豫的時間為豫的時間為1010-14-14s s1010-12-12s s數(shù)量級。數(shù)量級。內轉化內轉化: :電子由高能級以電子由高能級以無輻射躍遷無輻射躍遷方式轉移至低能級。方式轉移至低能級。系間跨躍系間跨躍：在兩個不同多重態(tài)之間的在兩個不同多重態(tài)之間的無輻射無輻射躍遷，如從躍遷，如從S1到到T1，該躍遷是禁阻的。然而，當不同多重態(tài)的兩個電子能層該躍遷是禁阻的。然而，當不同多重態(tài)的兩個電子能層有較大重疊時，處于這兩個能層上的

5、受激電子的自旋方向發(fā)有較大重疊時，處于這兩個能層上的受激電子的自旋方向發(fā)生變化，即可通過自旋生變化，即可通過自旋-軌道耦合而產生無輻射躍遷。軌道耦合而產生無輻射躍遷。7第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法熒光發(fā)射熒光發(fā)射 處于處于第一激發(fā)單重態(tài)第一激發(fā)單重態(tài)中的電子躍遷至中的電子躍遷至基態(tài)各振動能級時，將得到最大波長為基態(tài)各振動能級時，將得到最大波長為3 3的熒光。的熒光。3 3的波長較激發(fā)波長的波長較激發(fā)波長1 1或或2 2都長都長，而且不論電子開始被激發(fā)至什，而且不論電子開始被激發(fā)至什么高能級，最終將只發(fā)射出波長么高能級，最終將只發(fā)射出波長3 3為的為的熒光。熒光的產生在熒光。熒光的產生在1

6、010-9-9-10-10-6-6s s內完成。內完成。8第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法（二）熒光效率及其影響因素（二）熒光效率及其影響因素1.1.熒光效率：也叫量子效率，它表示物質發(fā)射熒光的能力，通常用下式表示 = 發(fā)射熒光分子數(shù) / 激發(fā)分子總數(shù) = kf /（kf+ki）式中式中k kf f為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)， k ki i為其它有為其它有關過程的速率常數(shù)的總和關過程的速率常數(shù)的總和。 9第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法熒光效率越高，物質發(fā)射的熒光越強熒光效率越高，物質發(fā)射的熒光越強對于高熒光分子，例如熒光素，其量子產率對于高熒光分子，例如熒光素，其

7、量子產率在某些情況下接近在某些情況下接近1 1，說明，說明 k kI I很小，可以忽很小，可以忽略不計。略不計。一般來說，一般來說，k kf f主要取決于化學結構，而主要取決于化學結構，而 kiki則主要取決于化學環(huán)境，同時也與化學結構則主要取決于化學環(huán)境，同時也與化學結構有關。有關。10第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法2 2、熒光與分子結構的關系、熒光與分子結構的關系 共軛效應：共軛度越大，熒光越強。共軛效應：共軛度越大，熒光越強。 剛性結構：分子剛性越強，分子振動少，與其它分子碰撞失剛性結構：分子剛性越強，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機率下降，熒光量子效率提高。如熒光素活的機率下降，

8、熒光量子效率提高。如熒光素（ 大）大）與酚酞與酚酞（ =0）；芴；芴（ =1）與聯(lián)苯與聯(lián)苯（ =0.18）。）。 取代基：取代基： 給電子取代基增強熒光（給電子取代基增強熒光（p- 共軛），如共軛），如-OH、-OR、 -NH2、-CN、NR2等；等； 吸電子基降低熒光，如吸電子基降低熒光，如 -COOH、 -C=O、 -NO2、-NO、-X等；等； 重原子降低熒光但增強磷光。重原子降低熒光但增強磷光。11第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法螯合物中配位體的發(fā)光螯合物中配位體的發(fā)光 不少有機化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不少有機化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結構，分子處于非同一平面，因而

9、不不是剛性結構，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強，平面結構的增大，物，隨著分子的剛性增強，平面結構的增大，常會發(fā)生熒光。常會發(fā)生熒光。 如如8-8-羥基喹啉本身有很弱的熒光，但其金屬羥基喹啉本身有很弱的熒光，但其金屬螯合物具有很強的熒光。螯合物具有很強的熒光。12第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法3 環(huán)境因素對熒光的影響環(huán)境因素對熒光的影響溶劑效應溶劑效應： 溶劑極性增強使物質的熒光波長紅移，熒光強度大。溶劑極性增強使物質的熒光波長紅移，熒光強度大。溫度溫度：溫度增加，熒光強度下降（因為內、外轉換增

10、加、粘度：溫度增加，熒光強度下降（因為內、外轉換增加、粘度 或或“剛性剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。pH值值：具酸或堿性基團的有機物質，在不同：具酸或堿性基團的有機物質，在不同pH值時，其結構值時，其結構 可能發(fā)生變化，因而熒光強度將發(fā)生改變。可能發(fā)生變化，因而熒光強度將發(fā)生改變。表面活性劑表面活性劑：熒光物質周圍形成膠束，提高熒光效率。：熒光物質周圍形成膠束，提高熒光效率。溶解氧溶解氧：降低熒光效率。：降低熒光效率。13第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法（三） 熒光強度與溶液濃度的關系 熒光強度If正比于吸收的光量Ia與熒光

11、量子產率 。 If = Ia 式中為熒光量子效率，又根據(jù)Beer定律，當A0.05 If =2.3 I0 klc If = K c 即熒光強度與熒光物質的濃度成之正比，但這種線性關系只有在極稀的溶液中，當lc0.05時才成立。對于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強度和濃度不呈線性關系。14第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法熒光猝滅熒光猝滅: : 熒光物質分子與溶劑分子或其它溶質熒光物質分子與溶劑分子或其它溶質分子的相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象稱為熒分子的相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。光猝滅。猝滅劑猝滅劑：能引起熒光強度降低的物質稱為猝滅劑。：能引起熒光強度降低的物質

12、稱為猝滅劑。熒光自猝滅效應熒光自猝滅效應：自吸收，激發(fā)態(tài)之間的碰撞：自吸收，激發(fā)態(tài)之間的碰撞15第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法（四）激發(fā)光譜發(fā)射光譜（四）激發(fā)光譜發(fā)射光譜激發(fā)光譜激發(fā)光譜：固定測量波長為熒光的最大發(fā)射波長，：固定測量波長為熒光的最大發(fā)射波長，然后改變激發(fā)波長，根據(jù)所測得的熒光強度與激然后改變激發(fā)波長，根據(jù)所測得的熒光強度與激發(fā)光波長的關系，即可繪制激發(fā)光譜曲線。激發(fā)發(fā)光波長的關系，即可繪制激發(fā)光譜曲線。激發(fā)光譜曲線與其吸收曲線可能相同。光譜曲線與其吸收曲線可能相同。熒光光譜熒光光譜：固定激發(fā)光波長為其最大激發(fā)波長，：固定激發(fā)光波長為其最大激發(fā)波長，測定不同的波長下熒光或強度

13、，即可繪制熒光強測定不同的波長下熒光或強度，即可繪制熒光強度隨波長變化的曲線即發(fā)射光譜（熒光光譜）。度隨波長變化的曲線即發(fā)射光譜（熒光光譜）。16第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法三、熒光分析儀三、熒光分析儀 測量熒光的儀器由激發(fā)光源、樣品池、單色測量熒光的儀器由激發(fā)光源、樣品池、單色器以及檢測器四部分組成。器以及檢測器四部分組成。第一單色器第一單色器或濾光片或濾光片記錄儀第二單色器第二單色器或濾光片或濾光片熒光熒光光源光源激發(fā)激發(fā)樣品池樣品池17第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法（1 1）光源）光源 鹵鎢燈、高壓汞燈（線）、高壓氙弧燈（帶）。鹵鎢燈、高壓汞燈（線）、高壓氙弧燈（帶）。（2 2

14、）樣品池）樣品池 熒光用的樣品池須用低熒光的材料制成，通常用石熒光用的樣品池須用低熒光的材料制成，通常用石英，形狀以四面透光、方形和長方形為宜。英，形狀以四面透光、方形和長方形為宜。（3 3）單色器）單色器 熒光計：濾光片；熒光分光光度計：光柵熒光計：濾光片；熒光分光光度計：光柵（4 4）檢測器）檢測器 由光電管和光電倍曾管作檢測器，并與激發(fā)光成直由光電管和光電倍曾管作檢測器，并與激發(fā)光成直角。角。18第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法分子熒光分析法及其應用分子熒光分析法及其應用熒光分析方法的特點熒光分析方法的特點（1 1）靈敏度高）靈敏度高（2 2）選擇性強）選擇性強（3 3）試樣量少和方法

15、簡單）試樣量少和方法簡單 （4 4）提供比較多的物理參數(shù)）提供比較多的物理參數(shù)19第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法熒光分析法四、應用四、應用（1 1）無機化合物的分析）無機化合物的分析 無機化合物本身能發(fā)熒光的物質相對較少，無機化合物本身能發(fā)熒光的物質相對較少，但加入某種試劑將非熒光物質轉化為熒光物質進但加入某種試劑將非熒光物質轉化為熒光物質進行分析。行分析。（2 2）有機化合物的熒光測定）有機化合物的熒光測定 芳香族化合物芳香族化合物20第二節(jié)第二節(jié) 磷光分析法磷光分析法一、磷光的產生和強度一、磷光的產生和強度 電子由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)至第一激發(fā)三重態(tài)的幾率很小，因為這是禁阻躍遷。但是，由第一激發(fā)單重態(tài)

16、的最低振動能級，有可能以系間竄躍方式轉至第一激發(fā)三重態(tài)，再經過振動馳豫，轉至其最低振動能級，由此激發(fā)態(tài)躍回至基態(tài)時，便發(fā)射磷光，這個躍遷過程（T1S0）也是自旋禁阻的（激發(fā)三重態(tài)穩(wěn)定性大），其發(fā)光速率較慢，約為10-4-10s即這種躍遷所發(fā)射的光，在激發(fā)停止光照射后，仍可持續(xù)一段時間。21第二節(jié)第二節(jié) 磷光分析法磷光分析法熒光與磷光的根本區(qū)別：熒光與磷光的根本區(qū)別： 熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動能層至基態(tài)各振動能層間躍遷產生的；而磷光是由激發(fā)三重態(tài)的最低振動能層至基態(tài)各振動能層間躍遷產生的。磷光具有如下三個特點：（1）磷光輻射的波長比熒光長）磷光輻射的波長比熒光長（2）磷光的壽命比熒光長）磷光的

17、壽命比熒光長（3）磷光的壽命和輻射強度對于重原子和順磁性離子敏感。磷光的壽命和輻射強度對于重原子和順磁性離子敏感。22第二節(jié)第二節(jié) 磷光分析法磷光分析法二、溫度對磷光的影響二、溫度對磷光的影響 由于激發(fā)三重態(tài)的壽命長，激發(fā)態(tài)分子與周由于激發(fā)三重態(tài)的壽命長，激發(fā)態(tài)分子與周圍的溶劑分子間發(fā)生碰撞和能量轉移過程的幾率圍的溶劑分子間發(fā)生碰撞和能量轉移過程的幾率增大，使磷光強度減弱甚至消失，增大，使磷光強度減弱甚至消失，通常在低溫下通常在低溫下測量磷光。測量磷光。 低溫磷光分析中，低溫磷光分析中，液氮液氮是最常用的合適的冷是最常用的合適的冷卻劑。溶劑在液氮溫度（卻劑。溶劑在液氮溫度（7777K K）下應

18、具有足夠的下應具有足夠的粘度，對所分析的試樣應具有良好的溶解特性。粘度，對所分析的試樣應具有良好的溶解特性。最常用的溶劑是最常用的溶劑是EPAEPA，它由乙醇、異戊烷和二乙它由乙醇、異戊烷和二乙醚按體積比為醚按體積比為2 2：5 5：5 5混合而成?；旌隙?。23第二節(jié)第二節(jié) 磷光分析法磷光分析法三、重原子效應三、重原子效應 使用含有重原子的溶劑使用含有重原子的溶劑（如碘乙烷、溴乙烷）如碘乙烷、溴乙烷）或在磷光物質中引入重原子取代基，或在磷光物質中引入重原子取代基， 可以增加磷可以增加磷光效應，分別稱外部重原子效應和內部重原子效光效應，分別稱外部重原子效應和內部重原子效應。應。重原子效應機理重

19、原子效應機理：重原子的高核電荷引起或增強：重原子的高核電荷引起或增強了溶質分子的自旋了溶質分子的自旋- -軌函耦合作用，從而增大了軌函耦合作用，從而增大了 S S0 0 T1T1吸收躍遷和吸收躍遷和S S1 1T T1 1系間跨越躍遷的幾率，系間跨越躍遷的幾率，有利于磷光的發(fā)生和增大磷光的量子產率。有利于磷光的發(fā)生和增大磷光的量子產率。24第二節(jié)第二節(jié) 磷光分析法磷光分析法四、室溫磷光四、室溫磷光 由于低溫磷光需要低溫實驗裝置，溶劑選擇的限制等因素，從而發(fā)展了多種室溫磷光法（RTP）。（1 1）固體基質室溫磷光法固體基質室溫磷光法（SS-RTPSS-RTP） 此法基于測量室溫下吸附于固體基質上

20、的有機化合物所發(fā)射的磷光。所用的載體種類較多，有纖維素載體（如濾紙、玻璃纖維）、無機載體（如硅膠、氧化鋁）以及有機載體（如乙酸鈉、聚合物、纖維素膜）等。理想的載體是既能將分析物質牢固地束縛在表面或基質中以增加其剛性，并能減小三重態(tài)的碰撞猝滅等非輻射去活化過程，而本身又不產生磷光背景。25第二節(jié)第二節(jié) 磷光分析法磷光分析法（2 2）膠束增穩(wěn)的溶液室溫磷光法（）膠束增穩(wěn)的溶液室溫磷光法（MS-RTPMS-RTP） 當溶液中表面活性劑的濃度達到臨界膠束濃度后，便相互聚集形成膠束。由于這種膠束的多相性，改變了磷光物質的微環(huán)境和定向的約束力，減小了內轉化和碰撞能量損失等非輻射去活化過程的趨勢，明顯增加了

21、三重態(tài)的穩(wěn)定性，從而可以實現(xiàn)在溶液中測量室溫磷光。利用膠束穩(wěn)定的因素，結合重原子效應，并對溶液除氧，是MS-RTP 的三個要素。26第二節(jié)第二節(jié) 磷光分析法磷光分析法五、五、 磷光分析儀磷光分析儀 在熒光分光光度計上配上磷光配件后，即可用于磷光測定。主要有（1）試樣室：將樣品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶內測定。（2）磷光鏡。六、六、 應用應用 磷光分析主要用于測定有機化合物，如石油產品、多環(huán)芳烴、農藥、藥物等方面。與熒光法互補，靈敏度。與熒光法互補，靈敏度較高。較高。27第三節(jié)第三節(jié) 化學發(fā)光分析化學發(fā)光分析一、概述一、概述定義定義：某些物質在進行化學反應時，由于：某些物質在進行化學反應時，由于吸

22、收了吸收了反應時產生的反應時產生的化學能化學能，而使反應產物分子激發(fā)至，而使反應產物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，便發(fā)出激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，便發(fā)出一定波長的光。這種吸收化學能使分子發(fā)光的過一定波長的光。這種吸收化學能使分子發(fā)光的過程稱為程稱為化學發(fā)光化學發(fā)光。利用化學發(fā)光反應而建立起來。利用化學發(fā)光反應而建立起來的分析方法稱為的分析方法稱為化學發(fā)光分析法化學發(fā)光分析法。特點特點：p62p6228第三節(jié)第三節(jié) 化學發(fā)光分析化學發(fā)光分析二、基本原理二、基本原理（一）化學發(fā)光反應的條件：（一）化學發(fā)光反應的條件： 能快速釋放出能快速釋放出足夠的能量足夠的能量?；瘜W反應

23、必須提?；瘜W反應必須提供足夠的激發(fā)能，激發(fā)能主要來源于反應焓。供足夠的激發(fā)能，激發(fā)能主要來源于反應焓。 要有有利的化學反應歷程，使化學反應的能要有有利的化學反應歷程，使化學反應的能量至少能被一種物質所接受并量至少能被一種物質所接受并生成激發(fā)態(tài)生成激發(fā)態(tài)。 激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉移它的能量給另激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉移它的能量給另一個分子，而使該分子激發(fā)，然后以一個分子，而使該分子激發(fā)，然后以輻射光子輻射光子的的形式回到基態(tài)。形式回到基態(tài)。 29第三節(jié)第三節(jié) 化學發(fā)光分析化學發(fā)光分析（二）化學發(fā)光效率（二）化學發(fā)光效率 clcl和強度和強度 r r : :生成激發(fā)態(tài)分子的效率生成激發(fā)態(tài)分子的效

24、率 f f : : 激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率30第三節(jié)第三節(jié) 化學發(fā)光分析化學發(fā)光分析生物發(fā)光與非生物發(fā)光（生物發(fā)光與非生物發(fā)光（0.010.01）化學發(fā)光強度化學發(fā)光強度: : I Iclcl（t t）: : t t時刻的化學發(fā)光強度時刻的化學發(fā)光強度dc/dc/dtdt: : 分析物參加反應的速率分析物參加反應的速率31第三節(jié)第三節(jié) 化學發(fā)光分析化學發(fā)光分析三、化學發(fā)光反應的類型三、化學發(fā)光反應的類型1. 1. 直接化學發(fā)光和間接化學發(fā)光直接化學發(fā)光和間接化學發(fā)光 直接發(fā)光直接發(fā)光是被測物作為反應物直接參加化學發(fā)光反應，生成電子激發(fā)是被測物作為反應物直接參加化學發(fā)光反應，生

25、成電子激發(fā)態(tài)產物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。態(tài)產物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。 A + BA + B C C* * + D + D C C* * C + h C + h 式中式中A A或或B B是被測物，通過反應生成電子激發(fā)態(tài)產物是被測物，通過反應生成電子激發(fā)態(tài)產物C C* * ，當當C C* * 躍遷回基躍遷回基態(tài)時，輻射光子。態(tài)時，輻射光子。32第三節(jié)第三節(jié) 化學發(fā)光分析化學發(fā)光分析間接發(fā)光間接發(fā)光是被測物是被測物A A或或B B，通過化學反應生成初始激發(fā)，通過化學反應生成初始激發(fā)態(tài)產物態(tài)產物C C* * ， C C* * 不直接發(fā)光，而是將其能量轉移給不直接發(fā)光，而是將其能量轉移給F F，使使F F躍遷回基態(tài)，產